鯉皰疹病毒II型ORF4基因的克隆、表達與免疫學(xué)檢測方法

周 勇，范玉頂，徐 進，馬 杰，江 南，劉文枝，曾令兵

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

鯉皰疹病毒II型ORF4基因的克隆、表達與免疫學(xué)檢測方法

周 勇，范玉頂，徐 進，馬 杰，江 南，劉文枝，曾令兵

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

根據(jù)鯉皰疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2)ORF 4基因序列(GenBank： JQ815364.1)設(shè)計特異性引物，PCR擴增得到ORF 4基因編碼框全長序列1 041 bp，將其克隆至原核表達載體pET-32a(+)中，構(gòu)建了重組原核表達載體pET-32a-ORF 4。將pET-32a-ORF 4重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到融合表達的重組蛋白，融合表達的重組蛋白主要以包涵體的形式存在，其分子質(zhì)量約為57 ku，與預(yù)期大小一致。將純化的重組蛋白免疫日本大耳兔，制備了多克隆抗體，ELISA檢測抗體效價大于1∶50 000，Western blot檢測顯示該抗體可以特異性識別重組蛋白。間接免疫熒光檢測結(jié)果表明：該多克隆抗體可與由CyHV-2感染引起細胞病變的異育銀鯽腦組織細胞(GICB)發(fā)生特異性的結(jié)合。

鯉皰疹病毒II型；ORF 4；原核表達；多克隆抗體；免疫熒光檢測

鯽(Carassiusauratusgibelio)是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類。近年來，在鯽養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的病害問題，嚴(yán)重制約了鯽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。其中，鯉皰疹病毒II型(cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)感染養(yǎng)殖鯽引起的皰疹病毒性造血器官壞死癥(herpesviral haematopoietic necrosis，HVHN)危害最為嚴(yán)重[1, 2-3]，該病毒可感染各種規(guī)格的鯽，死亡率高達90%～100%[2]。

鯉疹病毒II型(CyHV-2)是第二個分離自鯉科魚的皰疹病毒，與鯉痘瘡病毒(Carp pox herpesvirus，Cyprinid herpesvirus I, CyHV-1)及錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3)的關(guān)系接近，同屬于異樣皰疹病毒科鯉皰疹病毒屬成員[4]。1992年，日本首次報道了CyHV-2引起養(yǎng)殖金魚大規(guī)模死亡[5]，隨后在美國[6-7]、臺灣[8]、澳大利亞[9]、新西蘭[10]及英國[11]養(yǎng)殖的金魚中都檢測到該病毒。2011年，匈牙利首次報道了養(yǎng)殖的銀鯽感染CyHV-2的病例[3]，我國是繼匈牙利后第二個從養(yǎng)殖鯽體內(nèi)分離到CyHV-2病毒的國家，由該病毒引起的鯽大規(guī)模死亡已給我國鯽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2, 12]。

目前，對于鯉皰疹病毒II型檢測方法有PCR[13]、雙重PCR[14]、熒光實時定量PCR[15]、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增[16-17]、電鏡觀察[4]及細胞培養(yǎng)分離[18]等方法。但尚未見利用免疫學(xué)技術(shù)檢測鯉皰疹病毒II型的文獻報道。本實驗通過克隆與原核表達CyHV-2 ORF 4基因，表達產(chǎn)物純化后注射免疫日本大白兔制備抗CyHV-2 ORF 4蛋白的多克隆抗體，建立了CyHV-2免疫學(xué)檢測方法，并為進一步研究CyHV-2 ORF4基因編碼蛋白的功能奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株、細胞系、菌株與質(zhì)粒

鯉皰疹病毒II型(CyHV-2)由本實驗室從患典型造血器官壞死癥的養(yǎng)殖鯽體內(nèi)分離與鑒定[2]；鯽腦組織細胞系(GICB)由本實驗室建立與保存[18]；原核表達載體pET-32a(+)、表達菌株BL21(DE3)購于Novagen公司；pMD19-T載體購于TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶BamH I、HindIII (Promega)、T4 DNA連接酶(TakaRa)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(Abclonal Biotechology)、病毒DNA提取試劑盒(OMEGA)、膠回收試劑盒(OMEGA)、質(zhì)粒提取試劑盒(Promega)、免疫熒光染色試劑盒(碧云天)、化學(xué)發(fā)光底物(Thermo)。

離心機(Sigma，3K-15)、化學(xué)發(fā)光成像與分析系統(tǒng)(Bio-Rad，ChemiDocTMXRS+)、PCR儀(Biometra，T-professional)、低溫恒溫槽(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)、小型垂直電泳槽(Bio-Rad，Mini-PROTEAN?Tetra System)、酶標(biāo)儀(Bio-Rad，iMarkTM)、半干轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad，TRANS-BLOT?SD)、倒置熒光顯微鏡(Leica，DFC420C)。

1.2 CyHV-2 ORF 4基因的克隆

根據(jù)CyHV-2 ORF 4基因序列(GENBANK登錄號：NC 019495.1)，設(shè)計一對引物ORF 4-F∶5-CGGAATTCATGTCTTCTGTAACCG-3和ORF 4-R∶5’-CCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATC-3。采用病毒DNA提取試劑盒(OMEGA)，從GICB細胞增殖培養(yǎng)的CyHV-2 中提取病毒DNA作為PCR模板，進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)采用50 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L) 1 μL，Primers(ORF 4-F/ ORF 4-R，10 μmol/L)各1 μL，rTaq DNA聚合酶(5 U/μL)1 μL，DNA 模板為0.5 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，經(jīng)膠回收試劑盒回收目的片段，將純化的的ORF 4基因與pMD19-T載體于16 ℃ 連接4 h后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受細胞中，篩選陽性克隆，命名為：pMD19-T-ORF 4，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 原核表達載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pMD19-T-ORF 4與原核表達載體pET-32a(+)分別由BamH I和HindIII雙酶切，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，膠回收試劑盒回收目的片段，用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，PCR篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后，命名為：pET-32a-ORF 4，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達及純化

將培養(yǎng)過夜的陽性重組菌pET-32a-ORF 4/BL21以1∶100的比例接種到LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Amp)中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm為0.4-0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)4 h后取樣，進行SDS-PAGE分析。經(jīng)過誘導(dǎo)的重組菌株經(jīng)超聲波破碎處理，離心去上清，沉淀溶解在適量的磷酸鈉緩沖液(含8 mol/L尿素)中，然后參照蛋白純化試劑盒(Promega，HisLink Spin Protein Purification System)對重組蛋白進行純化。

1.5 多克隆抗體制備及效價測定

取純化后的重組蛋白0.6 mg采用皮下多點注射法免疫日本大耳兔(免疫前采集正常血清作為陰性對照)，以后每2周加強免疫一次，共5次。首次免疫加入與重組蛋白等量弗氏完全佐劑，后4次加入與重組蛋白等量弗氏不完全佐劑。末次加強免疫后7 d心臟采血，分離血清?？寡褰?jīng)抗體親和純化得到純化的多克隆抗體。以純化的重組蛋白為抗原，以每孔100 μg的濃度4 ℃包被96孔板，待測多克隆抗體為一抗，按1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1∶64 000，1∶128 000，1∶256 000，1∶512 000的比例稀釋待測多抗，將注射佐劑加PBS的陰性血清以1∶1 000，1∶4 000稀釋作為陰性對照。用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，以四甲基苯胺(TMB)溶液顯色后用酶標(biāo)儀測定OD450nm，以確定抗體效價。

1.6 Western blot分析

將誘導(dǎo)表達的重組菌pET-32a-ORF 4/BL21進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含有20 g/L BSA的PBST(含有終濃度為0.05%的Tween-20)室溫封閉1 h，用制備的抗體室溫孵育1 h，PBST(含有終濃度為0.05%的Tween-20)洗膜后，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，再次清洗，最后用化學(xué)發(fā)光底物工作液孵育5 min顯色。同時用未經(jīng)誘導(dǎo)表達的重組菌pET-32a-ORF 4/BL21作為對照進行相同操作。

1.7 間接免疫熒光檢測

以純化的多克隆抗體為一抗，紅色熒光探針標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)抗體為二抗，參照免疫熒光染色試劑盒(碧云天，免疫熒光染色試劑盒—抗兔Cy3)對感染CyHV-2的GICB細胞進行檢測，并用DAPI染色細胞核。同時設(shè)置未感染CyHV-2的GICB細胞作為對照進行相同操作。

2 結(jié)果

2.1 CyHV-2 ORF 4基因的克隆

PCR擴增反應(yīng)從抽提的CyHV-2總DNA中擴增出目的片段，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析該片段大小約為1 000 bp，其分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致(圖1)。膠回收PCR產(chǎn)物，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得了陽性重組菌株pMD19-T-ORF 4/DH5α。測序結(jié)果表明成功克隆了大小為1 041 bp的目的片段至T載體中。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products M：DL2000 DNA Mark；1：PCR產(chǎn)物；2：陰性對照

2.2 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

經(jīng)BamH I和HindIII 雙酶切的pET-32a(+)，與ORF 4基因連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，PCR鑒定獲得了陽性重組菌株pET-32a-ORF 4/BL21。提取重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I 和HindIII雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明雙酶切得到的目的片段以及PCR鑒定陽性克隆的產(chǎn)物均與預(yù)期大小的核酸片段相同(圖2)。 測序結(jié)果進一步表明ORF 4基因被正確地插入到pET-32a(+)載體上，重組表達載體構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pET-32a-ORF 4酶切、PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant expression plasmid by restriction enzyme digestion analysis and PCRM∶ DL2000 DNA marker;1∶經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的重組質(zhì)粒;2∶PCR鑒定陽性克隆產(chǎn)物;3∶PCR陰性對照。

2.3 重組蛋白的表達

SDS-PAGE分析表明，重組菌株pET-32a-ORF 4/BL21經(jīng)1 mmol/L的IPTG 于37 ℃的條件下誘導(dǎo)4 h，能有效地誘導(dǎo)重組菌株中CyHV-2 ORF 4基因的表達，表達的蛋白分子質(zhì)量約為57 ku，與預(yù)期大小一致(圖3)。誘導(dǎo)表達的菌體通過超聲破碎處理后，表達產(chǎn)物主要存在于超聲破碎后的沉淀中，說明表達的蛋白主要以包涵體形式存在(圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒表達的CyHV-2蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of CyHV-2 ORF 4 protein expressed by recombinant plasmid M∶蛋白分子標(biāo)準(zhǔn);1-8∶誘導(dǎo);9∶未誘導(dǎo)

圖4 CyHV-2 ORF 4蛋白的表達形式分析Fig.4 Analysis of CyHV-2 ORF 4 protein expression formM∶蛋白分子標(biāo)準(zhǔn);1∶超聲沉淀;2∶超聲沉淀;3∶超聲上清

2.4 重組蛋白多克隆抗體的制備及檢測

收集經(jīng)過5次免疫的日本大耳兔抗血清，抗血清經(jīng)抗體親和純化得到純化的多克隆抗體，濃度為4.75 mg/mL。經(jīng)ELISA法測定，抗體效價大于1∶50 000。Western blot結(jié)果表明：多克隆抗體能特異性地結(jié)合重組蛋白(圖5)。

圖5 CyHV-2 ORF 4蛋白的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of expressed CyHV-2 ORF 4 protein with the polyclonal antibodies M∶蛋白分子標(biāo)準(zhǔn);1∶誘導(dǎo)的Western blot檢測;4∶未誘導(dǎo)的Western blot檢測

2.6 間接免疫熒光檢測

將感染CyHV-2的GICB細胞和未處理的正常GICB細胞依次與多克隆抗體和紅色熒光探針標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體孵育。熒光顯微鏡下觀察顯示，感染CyHV-2的GICB細胞在綠光激發(fā)下呈現(xiàn)出紅色，而沒有感染CyHV-2的GICB細胞則沒有紅色熒光出現(xiàn)(圖6)。說明制備的多抗能夠特異性地檢測CyHV-2。

圖6 免疫熒光檢測GICB細胞中的CyHV-2Fig.6 Detection CyHV-2 in GICB cells by the immunofluorescence A∶DAPI染色感染CyHV-2的GICB細胞;B∶綠色熒光下的感染CyHV-2的GICB細胞;C∶A和B融合圖;D∶DAPI染色正常的GICB細胞;E∶綠色熒光下的正常的GICB細胞;F∶D和E融合圖(標(biāo)尺大小∶50 μm)

3 討論

近年來，鯉皰疹病毒II型(CyHV-2)感染養(yǎng)殖鯽引起的鯽造血器官壞死癥給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失[2]。CyHV-2是一種大DNA病毒，其基因組全長290 304 bp(GenBank∶ JQ815364.1)，包含154個基因開放閱讀框，其中ORF 4和ORF 151A編碼了腫瘤壞死因子受體類似物(Tumour Necrosis Factor Receptor, TNFR)，此類蛋白可能在CyHV-2的免疫逃避中發(fā)揮作用[19]。通過Genbank氨基酸比對發(fā)現(xiàn)CyHV-2 ORF 4與草魚TNFR、斑馬魚TNFR和大西洋鮭TNFR的相似性分別為27%、25%和27%，與石斑魚虹彩病毒vTNFR和牛痘病毒vTNFR的相似性分別為28%和31%。

本研究通過PCR技術(shù)從CyHV-2基因組DNA中擴增得到完整的ORF 4基因，將其克隆至原核表達載體pET-32a(+)中，構(gòu)建了重組原核表達載體pET-32a-ORF 4。pET表達系統(tǒng)與重組蛋白在大腸桿菌中表達的其他系統(tǒng)相比，具有很高的表達效率。該系統(tǒng)是一種帶有T7 噬菌體lac 強啟動子的原核高效融合蛋白表達載體，由lac 啟動子和編碼硫氧還蛋白(109個氨基酸，Trx-Tag)、組氨酸(6個氨基酸，His-Tag)及S標(biāo)簽(15個氨基酸，S-Tag)的基因組成。在其下游多克隆位點插入外源基因，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，可表達出含有S-Tag、His-Tag、Trx-Tag和外源基因的融合蛋白。由于ORF 4編碼蛋白與上述標(biāo)簽蛋白的融合表達，所以本實驗表達的重組蛋白分子量比原始ORF 4編碼蛋白大18 ku，約為57 ku，與預(yù)測分子質(zhì)量基本一致。對表達的重組蛋白可溶性分析顯示，該重組蛋白主要以包涵體形式存在，這可能主要與目的蛋白自身氨基酸的組成和標(biāo)簽蛋白有關(guān)。根據(jù)6×His與金屬Ni2+高親和力結(jié)合的特性，利用Ni-NTA 贅合物樹脂對重組蛋白直接進行純化。

將純化的重組蛋白與佐劑完全乳化后采用5次免疫程序免疫日本大耳兔，成功地制備了抗ORF 4 編碼蛋白的特異性多克隆抗體。Western blot得到一條與預(yù)期大小一致蛋白雜交帶，說明多克隆抗體特異性較好，純度較高。本研究制備的多克隆抗體能在病變的GICB細胞中特異性地結(jié)合CyHV-2 ORF4編碼蛋白，表明該多克隆抗體可應(yīng)用于CyHV-2的免疫診斷。但由于CyHV-2 ORF4編碼蛋白不是該病毒的膜蛋白，制備的多克隆抗體是否能檢測到完整的病毒粒子還需進一步試驗驗證。

本研究建立了一種CyHV-2免疫學(xué)診斷方法，不僅豐富了該病毒的檢測方法，對CyHV-2病毒的免疫學(xué)診斷與防控技術(shù)研究具有重要意義。而且為今后深入研究CyHV-2 ORF4基因編碼蛋白的功能奠定了前期基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Cloning, expression and immunological assay of ORF 4 encoding protein of Cyprinid herpesvirus II

ZHOU Yong, FAN Yu-ding, XU Jin, MA Jie, JIANG Nan, LIU Wen-zhi, ZENG Ling-bing

(YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China)

The specific primer pairs were designed according to the ORF 4 gene sequence of Cyprinid herpesvirus II (CyHV-2) and the 1041bp full-length sequence of ORF4 gene coding frame was amplified by PCR, and then the full-length CyHV-2 ORF 4 gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-32a(+) to construct the recombinant expression vector pET-32a-ORF 4. The recombinant expression vector pET-32a-ORF 4 was successfully expressed inE.coliBL21 (DE3) as a fusion protein with a size of 57 ku after induction by isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG).The recombinant protein was presented mainly in inclusion body. The purified recombinant proteins were used to immune Japanese white rabbit to produce polyclonal antibody. Titer of polyclonal antibodies was above 1∶50 000. Western blot test demonstrated that the recombinant protein was recognized by the polyclonal antibody.

Cyprinid herpesvirus II (CyHV-2); ORF 4; prokaryotic expression; polyclonal antibodies; immunological assay

2015-06-05；

2015-08-25

國家“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金”(nycytx-46-11)；中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項課題(2016HY-200501)；武漢市科技計劃項目(2016020101010083)

周 勇(1984- )，男，助理研究員，研究方向為水生動物病害。E-mail：zhouy@yfi.ac.cn

曾令兵。E-mail: zlb@yfi.ac.cn

S941.41

A

1000-6907-(2017)01-0061-05