工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖的提取條件優(yōu)化

萬玉軍，唐曉芳，李鎮(zhèn)江，王剛，，楊曉琴，鄭君，黃偉，江源鋼，王宏

1(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川成都，611130)

2(成都金開生物工程有限公司，四川成都，611130)

普魯蘭多糖是一種特殊的微生物胞外多糖，是由出芽短桿霉發(fā)酵產(chǎn)生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性黏質(zhì)多糖［1-3］。因其水溶性好、溶液黏稠穩(wěn)定、優(yōu)良的增稠作用［4-5］、無色無味無毒性、安全性好等特點(diǎn)［6］，已被廣泛用于醫(yī)藥、食品、輕工、化工和石油［7-9］等領(lǐng)域，另外在煙草工業(yè)、農(nóng)業(yè)種子保護(hù)等領(lǐng)域［10-11］也逐步被應(yīng)用，是一種很有前景的工業(yè)用多糖。但目前尚未實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，原因在于普魯蘭多糖菌種產(chǎn)率低、發(fā)酵提取工藝有較大的局限性，比如如何除雜(菌體以及無機(jī)鹽、有機(jī)殘余物)、脫色(發(fā)酵液中色素沉積過多)、去蛋白(保留目的產(chǎn)物，去除雜蛋白)等問題［12-14］。篩選出了1株產(chǎn)率可達(dá)68～71 g/L的普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株，已經(jīng)用于5 t發(fā)酵罐規(guī)模的生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過對普魯蘭多糖5 t發(fā)酵罐規(guī)模發(fā)酵后，對普魯蘭多糖提取過程中所遇到的難點(diǎn)進(jìn)行研究，旨在解決提取問題，為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株:出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)A-22菌株，來源于成都金開生物公司實(shí)驗(yàn)室。

普魯蘭發(fā)酵液。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

NaOH、HCl、乙醇、H2SO4等均為分析純試劑，成都市科龍?jiān)噭┗S生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

壓濾機(jī)、超濾膜設(shè)備、NDJ-8S數(shù)字式黏度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;UV1800PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 提取工藝流程

發(fā)酵液預(yù)處理→除菌體雜質(zhì)→活性炭脫色→樹脂(脫色、去蛋白)→超濾→干燥

1.4.2 發(fā)酵液預(yù)處理

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)過80℃高溫滅酶，稀釋到2%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 硅藻土的選型、用量

選取兩種硅藻土進(jìn)行過濾，預(yù)處理過后的發(fā)酵液分成等體積的3份，硅藻土的量選擇1%、2%、3%，制成厚度不同的濾餅層，進(jìn)行板框過濾，過濾后，測定發(fā)酵液的澄清度(透過率)和含糖量。

1.4.4 活性炭對普魯蘭多糖脫色效果實(shí)驗(yàn)

1.4.4.1 活性炭的用量

取等體積的經(jīng)除菌后的發(fā)酵液6份，在自然pH，溫度40℃，脫色時間30 min，攪拌條件下，活性炭的用量分別為 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%(活性炭用量/發(fā)酵液體積)，經(jīng)過濾后，在吸光度420 nm條件下測定吸光值，得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

1.4.4.2 活性炭脫色時間

取等體積的經(jīng)除菌后的發(fā)酵液6份，在活性炭用量為0.5%，自然pH，溫度40℃，攪拌條件下，篩選脫色時間為20、30、40、50、60、70 min 時脫色效果，經(jīng)過濾后，在吸光度420 nm條件下測定吸光值，得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

1.4.4.3 活性炭脫色溫度

取等體積的經(jīng)除菌后的發(fā)酵液6份，在活性炭用量為0.5%，自然pH，脫色時間為40 min，攪拌條件下，篩選溫度為 30、40、50、60、70、80 ℃時脫色效果，經(jīng)過濾后，在吸光度420 nm條件下測定吸光值，得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

1.4.4.4 活性炭脫色pH

取等體積的經(jīng)除菌后的發(fā)酵液6份，在活性炭添加量為0.5%，溫度50℃，脫色時間為40 min，攪拌條件下，篩選 pH 為4.5、5、5.5、6、6.5、7 時脫色效果，經(jīng)過濾后，在吸光度420 nm條件下測定吸光值，得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

1.5 吸附樹脂選型

活性炭對發(fā)酵液脫色后，用樹脂進(jìn)行進(jìn)一步脫色、去蛋白。在實(shí)驗(yàn)過程中，選用了5種樹脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別裝相同柱高，選用活性炭脫色完的發(fā)酵液，每份體積相同，過柱，過完之后，觀察顏色，得出多糖的得率、損失率及測定含氮量，選擇作用明顯的樹脂。

1.6 超濾

過完樹脂后的發(fā)酵液，濃度為1.5%，進(jìn)行超濾，體積濃縮為4%，再次加入等體積的純水，超濾。同樣的操作進(jìn)行5次，超濾完后，計(jì)算發(fā)酵液中的單二寡糖的含量及多糖損失率。

1.7 干燥方式的選擇

取等體積超濾完的發(fā)酵液4份(配制成5%的濃度)，分別采用冷凍干燥、噴霧干燥、滾筒干燥、微波真空干燥4種干燥方式，對其進(jìn)行干燥。分析干燥成本，干燥完之后看產(chǎn)品的復(fù)溶性(取3 g溶于100 mL水，置于攪拌器上，800 r/min攪拌至完全溶解)。

1.8 分析方法

1.8.1 發(fā)酵液多糖的測定

普魯蘭多糖含量的測定:樣品中普魯蘭多糖的定量分析采用高效液相色譜進(jìn)行測定。流動相A:水;流動相 B:乙腈，其比例7∶3。取一定體積的樣品，經(jīng)過離心，取一定體積的上清液(普魯蘭多糖含量在0.200～0.300 g)，加100 μL普魯蘭酶，定容至50 mL。在58℃下酶解4 h，經(jīng)0.45 μm膜過濾備用。進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求普魯蘭多糖的含量。

1.8.2 發(fā)酵液的黏度測定

采用NDJ-8S數(shù)字式黏度計(jì)測定。

1.8.3 色素的測定

樣品中色素測定通過UV1800PC型紫外可見分光光度計(jì)在420nm處的吸光值表示。

1.8.4 樣品中含氮量測定

凱氏定氮法［16］。

1.8.5 單二寡糖測定［7］

硫酸蒽酮法。單二寡糖去除率:(超濾前單二寡糖含量-超濾后單二寡糖含量)/超濾前單二寡糖含量 ×100)。

1.8.6 普魯蘭多糖的灰分測定［17］

灼燒殘?jiān)ā?/p>

1.8.7 普魯蘭多糖的含水量測定［18］

直接干燥法。

1.8.8 普魯蘭多糖的黏度測定［7］

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

2.1 硅藻土的選型、用量

硅藻土的用量如表1所示，壓濾后的發(fā)酵液的澄清度(透過率)和多糖得率，確定硅藻土的型號及用量。

表1 助濾劑添加量對助濾效果的影響Table 1 The effect of diatomaceous earth dosage on filter

從表1可以看出，因?yàn)槠蒸斕m多糖性質(zhì)特殊，所以濾餅層硅藻土型號和用量的不同直接影響發(fā)酵液的澄清度和目的產(chǎn)物的得率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以1號硅藻土作為助濾劑，用量2%，此時普魯蘭多糖的得率高、澄清度較好。

2.2 活性炭用量、脫色時間、脫色溫度、脫色最適pH

2.2.1 活性炭的用量

活性炭是多孔性固體吸附劑，吸附能力較強(qiáng)。如圖1所示，隨著活性炭的用量不斷加大，脫色率逐漸增大，脫色效果較好，用量超過0.5%，脫色效果不穩(wěn)定?；钚蕴苛康募哟?，多糖的損失率不斷增大，可能是活性炭吸附多糖，造成一定損失。選擇用量為0.5%，既能達(dá)到良好的脫色效果，節(jié)約活性炭用量，同時還可以降低多糖的損失。

圖1 不同用量的活性炭對脫色的影響Fig.1 The influence of different dosage of active carbon decoloring effect

2.2.2 活性炭脫色時間

如圖2所示，隨著時間的延長，40 min時是脫色效果最好，此時可能已達(dá)到活性炭吸附色素的飽和度，60 min以后脫色效果有所下降，可能是時間太長，導(dǎo)致發(fā)酵液中小分子糖發(fā)生褐變反應(yīng)，反而有色素產(chǎn)生，影響脫色效果。因此選擇最適脫色時間為40 min。

圖2 脫色時間對活性炭脫色效果的影響Fig.2 Different time on the decoloring effect of activated carbon

2.2.3 活性炭脫色溫度

如圖3所示，溫度對活性炭脫色影響較明顯，在溫度較低時，脫色效果不好，活性炭的吸附能力較差，到達(dá)吸附飽和的時間長。而在溫度高時，脫色效果變差，可能是因?yàn)榘l(fā)酵液僅經(jīng)過除菌預(yù)處理，液體中含有較多小分子糖類，蛋白質(zhì)等其它雜質(zhì)，高溫下易發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生新的色素。同時，溫度過高，活性炭對多糖的吸附能力也增加，損失率增大。因此選擇脫色溫度為50℃，多糖的脫色效果好，損失率低。

圖3 不同的溫度對活性炭脫色效果的影響Fig.3 Different temperature on the decoloring effect of activated carbon

2.2.4 活性炭脫色pH

如圖4所示，脫色液pH5.5時，活性炭脫色效果最高，pH＞6，脫色率降低，pH在5～7之間多糖的損失率較低。因此，提高脫色效果和降低多糖損失率的前提下，選擇在pH為5.5作為最適活性炭脫色pH值。

圖4 不同pH對活性炭脫色效果的影響Fig.4 Different pH on the decoloring effect of a activated carbon

2.3 吸附樹脂選型

從圖5中可以看出，編號分別為A-E的5種樹脂，對發(fā)酵液進(jìn)一步脫色、去蛋白，樹脂A型相對于其他4種，脫色率最高，能達(dá)到96%，C、D、E三種樹脂脫色效果接近，脫色率94%左右，B型脫色率最低。脫完色后計(jì)算多糖的損失率，D型的損失率最低，C型損失率最高。對于去蛋白，A、B兩種氮含量較高，C、D、E三種氮含量差距不大。依據(jù)能達(dá)到良好脫色效果，并且對于多糖的損失降到最低，達(dá)到一定去蛋白的效果，通過篩選，D型樹脂能達(dá)到較佳的效果。

2.4 超濾

試驗(yàn)中提取的多糖分子質(zhì)量在20萬左右，但是經(jīng)過脫色后的發(fā)酵液中，含有大量的單二寡糖等小分子糖類，因此采用超濾手段去除小分子糖類，截留目的產(chǎn)物，提高產(chǎn)品純度，同時也可以起到濃縮的作用。圖6可以看出，超濾第1次，單二寡糖的去除率達(dá)到84.8%，繼續(xù)超濾，單二寡糖的去除率相比較第1次都很低了，此時去除作用已經(jīng)不明顯了，但是隨著超濾次數(shù)的增大，多糖的損失率逐漸增加。超濾3次，能使單二寡糖的去除率達(dá)到96.6%，符合標(biāo)準(zhǔn)，同時降低多糖的損失、節(jié)約成本。

圖5 不同類型的樹脂對多糖脫色及蛋白去除的影響Fig.5 Different types of resin decolorization of polysaccharide and protein removal

圖6 超濾次數(shù)對去除單二寡糖效果的影響Fig.6 Number of times of ultrafiltration to remove(Mono-di-and oligosaccharides)effect

2.5 干燥方式的選擇

實(shí)驗(yàn)所采用的4種干燥方式特點(diǎn)如下:冷凍干燥，要求很高的真空和低溫，對設(shè)備要求高，干燥時間過長，這些因素?zé)o形中增加了生產(chǎn)成本，冷凍干燥后的多糖，復(fù)溶性好、溶液透亮;滾筒干燥，干燥時間短、可以連續(xù)操作、熱效率高，但是干燥完之后得用刮刀將其刮下，干燥后的產(chǎn)品較硬，復(fù)溶性較好;噴霧干燥，雖然其生產(chǎn)過程簡化，操作控制方便，但是其所需設(shè)備體積較龐大、投資大，同時熱效率很低、能耗大，干燥后的產(chǎn)品復(fù)溶性極差;微波干燥，干燥時，能量效率不高，加熱不均勻，局部溫度過高，導(dǎo)致產(chǎn)品顏色不正，表面硬化，復(fù)溶性較差。綜合設(shè)備、能耗成本考量，對比4種干燥方式，我們選用滾筒干燥方式，其干燥時間短、熱效率高，較其他3種干燥方式干燥效果好、成本低，產(chǎn)品復(fù)溶性好。

表2 不同干燥方式對復(fù)溶性的影響Table 2 The effect of different drying methods on the complex solubility

2.6 提取后成品質(zhì)量參數(shù)

產(chǎn)品:白色粉末狀、純度 93.31%、黏度 160 mm2/s、水分 3.85%、灰分 1.34%、總氮含量0.045%、單二寡糖1.5%、pH 5.7，提取的成品質(zhì)量符合國標(biāo)要求。

3 討論

隨著普魯蘭多糖的使用范圍不斷擴(kuò)大，提取成本較高、難度較大等現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)對發(fā)酵液中普魯蘭多糖的提取條件進(jìn)行了研究，包括除雜時所需硅藻土的型號、用量，脫色過程中活性炭的用量及最適脫色條件，均采用單因素實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，選取一號硅藻土作為助濾劑，用量2%，濾液澄清度高、過濾速度快;脫色活性炭的添加量為0.5%、溫度50℃、時間40 min、pH 5.5，脫色效果好、普魯蘭多糖得率高;樹脂型號D，使得二次脫色效果良好，同時能去除一些雜蛋白;超濾兩次，單二寡糖的去除率能達(dá)到96.6%在此條件下，發(fā)酵液除雜效果理想、澄清度較高、脫色效果好且普魯蘭多糖得率較高、損失率低;我們選用滾筒干燥方式，其干燥時間短、熱效率高，干燥成本低，干燥后的成品效果好，能達(dá)到質(zhì)量要求。

由于日本對普魯蘭多糖后提取工藝技術(shù)的封鎖，對其后提取工藝報道很少，基本上都在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。本實(shí)驗(yàn)是在5 t發(fā)酵罐規(guī)模發(fā)酵后，對發(fā)酵液中普魯蘭多糖的提取工藝進(jìn)行研究。在提取過程中，本實(shí)驗(yàn)篩選出一種高性能樹脂，對發(fā)酵液進(jìn)行二次脫色，同時還可以使一些膠體，雜蛋白等雜質(zhì)與普魯蘭多糖分離，有別于目前普魯蘭多糖的提取工藝，具有一定的創(chuàng)新性。采用膜分離技術(shù)，既能夠去除大量的單二寡糖以及一些小分子糖類，也能夠達(dá)到一定的濃縮目的，保證了產(chǎn)品的純度及質(zhì)量。選用區(qū)別于傳統(tǒng)噴霧干燥方式的滾筒干燥方法，降低了干燥成本，產(chǎn)品干燥效果好且復(fù)溶性更好。普魯蘭多糖的提取方法多采用醇沉法，存在乙醇用量大且重復(fù)利用成本高、生產(chǎn)安全性降低、產(chǎn)品帶有乙醇的味道等缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)所研究的提取方法不使用乙醇，既降低提取成本，也使得提取過程更加安全。以上一些提取工藝的改進(jìn)，為以后工業(yè)化生產(chǎn)(50 t發(fā)酵罐規(guī)模)提供數(shù)據(jù)參考，奠定了一定的基礎(chǔ)。

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