陳茜,趙天云,郭小花,潘永英,劉文興,宋興榮
廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心麻醉科,廣東廣州510623
基礎(chǔ)研究
膜聯(lián)蛋白 AA 11蛋白在異丙酚對膿毒癥大鼠腸保護作用中的機制
陳茜,趙天云,郭小花,潘永英,劉文興,宋興榮
廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心麻醉科,廣東廣州510623
目的觀察膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1)蛋白在異丙酚對膿毒癥大鼠腸保護作用中的機制。方法采用大鼠股靜脈注射脂多糖復制膿毒癥模型,按完全隨機化原則分為6組:正常對照組、內(nèi)毒素組、異丙酚組、脂肪乳組、內(nèi)毒素+異丙酚組、內(nèi)毒素+脂肪乳組。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測腸組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1β)、白細胞介素-1(IL-6)的表達;Western Blot檢測腸組織中Annexin A1表達;HE染色比較各組腸組織形態(tài)。結(jié)果與對照組相比,脂多糖組IL-1β,IL-6,TNF-α表達明顯升高,Annexin A1表達明顯降低;脂多糖+異丙酚組IL-1β,IL-6,TNF-α表達明顯降低,Annexin A1表達明顯升高(P<0.05)。結(jié)論異丙酚對膿毒癥大鼠腸道有明顯的保護和抗炎作用,且該作用可能與膜聯(lián)蛋白A1蛋白相關(guān)。
膿毒癥;異丙酚;膜聯(lián)蛋白A1
膿毒癥是臨床危重患者常見的嚴重并發(fā)癥之一,而腸道是膿毒癥發(fā)生的中心器官[1],保護腸道黏膜的屏障功能在膿毒癥的治療過程中至關(guān)重要[2]。異丙酚是一種短效、快速的靜脈全麻藥,除了它本身的麻醉作用外,還具有強大的抗炎作用[3-5]。前期實驗已證實異丙酚可通過上調(diào)膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1)的表達從而抑制炎癥反應(yīng)。而近年來有研究表明:在炎癥時,腸組織可分泌Annexin A1,并推測其可能參與了腸炎癥損傷的修復[6-8]。本研究的前期實驗是從血液中的單核細胞入手,但異丙酚對腸炎性疾病是否具有保護作用,其抗炎機制是否通過腸組織Annexin A1調(diào)控尚未可知,因此研究擬探討異丙酚通過調(diào)控腸上皮細胞Annexin A1蛋白在膿毒癥中的抗炎作用及其機制,為臨床腸炎性疾病手術(shù)的麻醉藥物選擇和麻醉方式選擇提供新的思路,也為今后異丙酚應(yīng)用于臨床危重患者提供有效的胃腸保護奠定堅實的基礎(chǔ)。
1.1 實驗動物及分組
36只雄性SD大鼠,體質(zhì)量180~220 g,均禁食過夜,用烏拉坦(1.0 g/kg)肌肉注射麻醉后,行右側(cè)股靜脈插管建立靜脈輸液通道。將36只SD大鼠采用隨機數(shù)字法將大鼠隨機分為對照組、內(nèi)毒素組、異丙酚組、脂肪乳組、內(nèi)毒素+異丙酚組、內(nèi)毒素+脂肪乳組,每組6只。
1.2 動物模型建立及用藥
按照以下分組要求注射藥物:正常對照組,注射0.9%生理鹽水;脂多糖組,注射脂多糖10 mg/kg;脂多糖+異丙酚組,注射LPS 10 mg/kg和丙泊酚5 mg/kg,繼以丙泊酚10 mg/(kg·h)的速度使用微泵持續(xù)靜脈泵注至6 h;脂肪乳組,注射0.9%生理鹽水,繼以10%脂肪乳10 mg/(kg·h)的速度使用微泵持續(xù)靜脈泵注至6 h;異丙酚組,注射0.9%生理鹽水,繼以丙泊酚10 mg/(kg·h)的速度使用微泵持續(xù)靜脈泵注至6 h;脂肪乳+內(nèi)毒素組,注射LPS 10 mg/kg,繼以10%脂肪乳10 mg/(kg·h)的速度使用微泵持續(xù)靜脈泵注至6 h。
1.3 檢測方法
取大腸組織制備石蠟切片,行HE染色。血清檢測:腸道黏膜組織勻漿后分別用于ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。Western Blot檢測:使用含有1%蛋白酶抑制劑混合物的RIPA蛋白裂解液裂解組織10 min,4℃12 000 g離心,取上清,獲取總蛋白樣本。將總蛋白樣本與上樣緩沖液混勻,煮沸5 min后上樣。采用12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,并轉(zhuǎn)膜,電泳和轉(zhuǎn)膜均使用BIO-RAD Western blot系統(tǒng)。將膜使用5%脫脂奶室溫封閉1 h。分別使用兔抗大鼠Annexin A1抗體,兔抗大鼠β-actin抗體4℃孵育過夜。接著使用PBST洗滌3次,除去未結(jié)合的一抗。HRP標記的二抗孵育條帶2 h,洗滌后滴加ECL顯色液,在暗室中顯影、定影,分析各組目的蛋白的條帶。
1.4 統(tǒng)計學處理
計數(shù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用SPSSl3.0軟件進行分析,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩組間均值比較采用LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 大腸組織HE染色
結(jié)果顯示膿毒癥組大鼠結(jié)腸固有膜內(nèi)彌漫性淋巴細胞、漿細胞、單核細胞等細胞浸潤,大量中性粒細胞浸潤發(fā)生在固有膜、隱窩上皮、隱窩內(nèi)及表面上皮。與之相反,正常對照組和內(nèi)毒素+異丙酚組大鼠腸黏膜則未見明顯異常(圖1)。
圖1 大腸組織HE染色結(jié)果A:對照組;B:內(nèi)毒素組;C:內(nèi)毒素+異丙酚組.
2.2 炎癥因子在各組的表達
與對照組相比,內(nèi)毒素組TNF-α,IL-6,IL-1β表達明顯升高;與內(nèi)毒素組相比,內(nèi)毒素+異丙酚組TNF-α,IL-6,IL-1β表達明顯降低;與內(nèi)毒素組相比,內(nèi)毒素+脂肪乳組TNF-α,IL-6,IL-1β表達明顯降低,但仍顯著高于內(nèi)毒素+異丙酚組(P<0.05,圖2~4)。
2.3 AnnexinA1蛋白在各組中的表達
與內(nèi)毒素組相比,異丙酚組和內(nèi)毒素+異丙酚組的Annexin A1表達均明顯升高(P<0.05);其余各組AnnexinA1表達與對照組無明顯差異(P>0.05,圖5)。
Taniguchi等[9]研究發(fā)現(xiàn),注射LPS能引起TNF-α、IL-6和IL-10的升高,同時能升高IL-6對IL-10的比值,應(yīng)用異丙酚后TNF-α、IL-6和IL-10水平降低。Hsu等[10]研究發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用異丙酚同生理鹽水對照組相比,細胞因子水平并沒有明顯變化,但異丙酚對內(nèi)毒素刺激引起的TNF-α、IL-1β、IL-6升高起抑制作用,可見異丙酚對無刺激時的細胞因子分泌沒有影響,但對內(nèi)毒素刺激引起的細胞因子升高起抑制作用。此外Chen等[11]用 RT-PCR發(fā)現(xiàn)同事應(yīng)用異丙酚組TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平比LPS刺激組低,可見異丙酚抑制炎癥因子發(fā)生在翻譯前水平。而本實驗選取促炎癥細胞因子IL-1β,IL-6,TNF-α等進行了檢測,結(jié)果顯示異丙酚可以明顯減少促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的釋放,說明異丙酚具有抗炎作用,這與上述既往文獻報道異丙酚的抗炎作用是一致的。此外HE染色結(jié)果顯示:給予異丙酚處理的膿毒癥大鼠腸組織損傷比未用異丙酚處理明顯減輕很多,提示異丙酚對膿毒癥大鼠腸組織有明顯的保護作用,為異丙酚的抗炎作用提供病理支持。
Annexin A1是膜鈣蛋白家族中的一員,是一個重要的炎癥調(diào)控蛋白。早期人們對Annexin A1抗炎作用主要集中在炎癥包上(中性粒細胞、單核細胞等)[12]。近年來有學者發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)、體外誘導產(chǎn)生結(jié)腸炎時,腸粘膜組織也可分泌Annexin A1,并對其具體的調(diào)控機制進行了初探[13]。有文獻報道,AnnexinA1對腸粘膜損傷具有保護作用,且這種保護作用可能是通過其受體FPR2/ALX介導的,AnnexinA1通過激活其受體可抑制白細胞的功能和促進胃粘膜傷口的愈合[14]。盡管如此,目前人們對Annexin A1在調(diào)節(jié)胃腸損傷和炎癥方面的研究甚少。本研究初步證實異丙酚可能通過上調(diào)膿毒癥大鼠模型腸組織Annexin A1蛋白的表達抑制炎癥反應(yīng),但該作用是否通過其受體FPR2/ALX介導以及其上下游的調(diào)控機制等還需要下一步實驗證實。
綜上所述,本實驗證實了異丙酚對膿毒癥大鼠腸道有明顯的保護和抗炎作用,且該作用可能與上調(diào)腸上皮組織Annexin A1蛋白表達有關(guān),但其具體分子機制還有待進一步研究。
圖2 TNF-α在不同組別大鼠腸組織的表達C:對照組;L:內(nèi)毒素組;P:異丙酚組;I:脂肪乳組L+ P:內(nèi)毒素+異丙酚組;L+I:內(nèi)毒素+脂肪乳組.*P<0.05 vs內(nèi)毒素組.
圖3 IL-6在不同組別大鼠腸組織的表達C:對照組;L:內(nèi)毒素組;P:異丙酚組;I:脂肪乳組L+P:內(nèi)毒素+異丙酚組;L+I:內(nèi)毒素+脂肪乳組. *P<0.05 vs內(nèi)毒素組
圖4 IL-1β在不同組別大鼠腸組織的表達C:對照組;L:內(nèi)毒素組;P:異丙酚組;I:脂肪乳組L+P:內(nèi)毒素+異丙酚組;L+I:內(nèi)毒素+脂肪乳組.*P<0.05 vs內(nèi)毒素組.
圖5 AnnexinA1蛋白在各組中的表達C:對照組;L:內(nèi)毒素組;P:異丙酚組;I:脂肪乳組L+P:內(nèi)毒素+異丙酚組;L+I:內(nèi)毒素+脂肪乳組.*P<0.05 vs內(nèi)毒素組.
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Mechanism of Annexin A1 protein in the protective effect of propofol on sepsis in rats
CHEN Xi,ZHAO Tianyun,GUO Xiaohua,PAN Yongying,LIU Wenxing,SONG Xingrong
Department of Anesthesiology,Women and Children's Medical Center Affiliated to Guangzhou Medical College,Guangzhou 510623,China
Objective To investigate the protection of Annexin A1 on the injury of intestinal protective effect of propofol in rats with sepsis.Methods Sepsis of rat model was induced by injection of lipopolysaccharide in rat femoral vein.The rats were randomized to 5 groups:normal control group(Group C),LPS group(Group L),propofol group(Group P),LPS+Propofol group (Group L+P),Intralipid group(Group I),LPS+Intralipid group(Group L+I).The intestinal tissue in each group were stained with hematoxylin and eosin(HE)and examined under microscope.The expression of tumor necrosis factor(TNF-α), interleukin1(IL-1)and leukocyte mediated endothelin-1(IL-6)on intestinal tissue were detected by ELISA.Western blot was used to detect the expression of Annexin A1.Results Compared with the control group,the expression of IL-1,IL-6,TNF-α was significantly increased,the Annexin A1 was obviously decreased in group L,while the opposite in group L+P.Conclusion Propofol may have protective and anti-inflammatory effects on the intestinal tract of rats with sepsis,and the effect may be correlated with the Annexin A1.
spesis;propofol;Annexin A1
2016-06-16
廣東省自然科學基金(S2013040016969);廣東省人口和計劃生育委員會科研項目(20133083)
陳茜,博士,主治醫(yī)師,E-mail:catherinecham@163.com
宋興榮,碩士,主任醫(yī)師,E-mail:songxr1966@sohu.com