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      基于新一代測序的SNP單體型分析在先天性攣縮性蜘蛛樣指癥PGD中的應用

      2017-02-06 07:52:04陳林君刁振宇徐志鵬周建軍顏桂軍孫海翔
      生殖醫(yī)學雜志 2017年1期
      關(guān)鍵詞:滋養(yǎng)層囊胚單體

      陳林君,刁振宇,徐志鵬,周建軍,顏桂軍,孫海翔

      (南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學科,南京 210008)

      基于新一代測序的SNP單體型分析在先天性攣縮性蜘蛛樣指癥PGD中的應用

      陳林君,刁振宇,徐志鵬,周建軍,顏桂軍,孫海翔*

      (南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學科,南京 210008)

      目的 探討基于新一代測序(NGS)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)單體型分析在先天性攣縮性蜘蛛樣指癥(CCA)種植前遺傳學診斷中的有效性。 方法 對活檢的滋養(yǎng)層細胞采用多重置換擴增(MDA)的方法擴增全基因組,應用基于NGS的SNP單體型分析和直接測序兩種方法對MDA產(chǎn)物進行CCA的種植前遺傳學診斷(PGD)。 結(jié)果 應用MDA方法對活檢的4枚囊胚的滋養(yǎng)層細胞成功地進行了全基因組擴增;通過基于NGS的SNP單體型分析發(fā)現(xiàn),其中兩枚是未感染CCA的囊胚,另兩枚是感染CCA的囊胚;單體型分析結(jié)果與直接測序法結(jié)果一致。取卵5個月后患者移植一枚基因型正常的冷凍囊胚,于妊娠的第38周經(jīng)剖宮產(chǎn)成功分娩一體重為2 850 g的健康嬰兒。 結(jié)論 基于NGS的SNP單體型分析是單基因病的種植前遺傳學診斷的有效篩查工具。

      種植前遺傳學診斷; 先天性攣縮性蜘蛛樣指癥; 多重置換擴增; 新一代測序; 單核苷酸多態(tài)性

      (JReprodMed2017,26(1):59-63)

      先天性攣縮性蜘蛛樣指癥(congenital contractural arachnodactyly,CCA)是一種常染色體顯性遺傳的結(jié)締組織病,以皺耳、蜘蛛樣指、關(guān)節(jié)攣縮(尤其是肘和膝關(guān)節(jié))、窄體型和脊柱側(cè)彎為特點[1-2]。CCA是由原纖維蛋白2(fibrillin 2,F(xiàn)BN2)基因的突變引起的,這些突變(包括無義和錯義突變、插入/復制以及拼接位點突變)主要分布于FBN2基因的22至36外顯子之間[3-4],目前還沒有有效的治療方法。因此,開展種植前遺傳學診斷(PGD)仍是目前最好的應對策略。通過PGD可以移植基因型完全正常的胚胎,這樣可以避免產(chǎn)前診斷中因發(fā)現(xiàn)患病胎兒而終止妊娠對母體造成的身心傷害。單體型分析可以將單基因病中的致病基因所在的染色體與正常染色體區(qū)分開來[5],也可以避免直接檢測中因等位基因脫扣(allele dropout,ADO)或基因重組(recombination)而導致的誤診[6-7],特別是對于常染色體顯性遺傳病的PGD具有更重要的臨床意義。本文闡述了基于NGS的SNP單體型分析對CCA的種植前遺傳學診斷的方法。

      資料和方法

      一、研究對象

      患者夫婦:女方正常,男方患有CCA,夫婦育有一CCA患兒,父子均具有典型的CCA臨床癥狀,其外周血基因組DNA(gDNA)經(jīng)一代測序發(fā)現(xiàn)CCA的致病基因(FBN2基因)33號外顯子發(fā)生一錯義突變(c.4274 G>A,p.Cys1425Try)。該夫婦于2014年6月來我中心要求行PGD治療。

      二、研究方法

      1.促排卵、體外受精和胚胎培養(yǎng):患者采用長方案降調(diào)節(jié),于黃體中期皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a,達必佳,F(xiàn)erring,德國)進行降調(diào)。當降調(diào)滿足要求后,給予促性腺激素(Gn)重組人卵泡刺激素(rFSH,果納芬,Merck Serono,瑞士)150 ~ 225 U/d,當優(yōu)勢卵泡直徑達到18 mm時給予HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)10 000 U,36 h后行陰道超聲介導下取卵術(shù)。成熟卵母細胞行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)授精,ICSI后16~18 h評估受精結(jié)果,以出現(xiàn)兩個原核(2PN)的受精卵為正常受精的胚胎,胚胎采用G1/G2(Vitrolife,瑞典)序貫培養(yǎng)法,在37℃、三氣(6% CO2,5%O2,89%N2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

      2.滋養(yǎng)層細胞活檢、囊胚冷凍和全基因組擴增:用激光在ICSI后第3天胚胎的透明帶上打一個孔徑為11 μm的小孔,以便滋養(yǎng)層細胞能夠從此孔疝出。于ICSI后第5天上午對滋養(yǎng)層細胞疝出的囊胚行滋養(yǎng)層細胞活檢。用活檢針吸取5~10個滋養(yǎng)層細胞,并用激光輔助切割;活檢下來的滋養(yǎng)層細胞用PBS(SAGE,美國)漂洗3次并迅速轉(zhuǎn)移至0.2 ml PCR管中于-80℃保存?;顧z后的囊胚采用Kitazato玻璃化冷凍試劑盒(Kitazato Biopharma,日本)冷凍保存于液氮中。

      全基因組擴增采用多重置換擴增(MDA)方法,MDA試劑盒采用REPLI-g單細胞試劑盒(Qiagen,德國)。MDA產(chǎn)物純化后可以直接PCR或-20℃保存。

      3.基于NGS的SNP單體型分析:在千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/) 中的FBN2基因上下游5 Mb區(qū)域篩選來自CHB(北方漢人)和CHS(南方漢人)的58個最小等位基因頻率均大于0.2的SNP高頻突變位點和一個致病位點(FBN2的33號外顯子突變位點c.4274 G>A)。登陸網(wǎng)站(https://www.ampliseq.com/)提交這些位點設(shè)計引物。隨后進行DNA純化,應用試劑盒Ion AmpliSeq(Life Technologies,美國)建庫和PGM(Life Technologies,美國)測序,選擇若干有效位點建立單體型。

      4.直接測序法:采用PCR方法擴增FBN2基因的33號外顯子。

      上游引物為5’-CACCCTCAGTAGAAGTCAGAATG-3’,下游引物為5’-TACATAGTCACCTGCAAGTCAAG-3’。

      PCR反應體系為50 μl∶5 μl的MDA產(chǎn)物(100倍稀釋)或100 ng gDNA,5 μl的10×PCR buffer,1.5 μl的50 mmol/L MgCl2,1 μl的10 mmol/L dNTP mix,1 μl的10 μmol/L引物,1.5 U Taq DNA polymerase(Invitrogen,美國)。PCR反應條件:96℃預變性3 min;隨后以(96℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min)×40;最后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工測序。

      5.凍胚移植與隨訪:于取卵5個月后,患者口服戊酸雌二醇(補佳樂,Bayer,德國)6 mg/d準備內(nèi)膜進行凍融胚胎移植(FET)。當內(nèi)膜厚度≥8 mm時,肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg/d。當黃體酮補充至第6天時進行凍融胚胎移植。

      在移植后的第14天測血清β-HCG水平確定妊娠情況。移植后第42天經(jīng)超聲檢查孕囊有胎心確定為臨床妊娠。妊娠21周時進行羊水穿刺。

      結(jié) 果

      一、體外受精、胚胎培養(yǎng)

      患者共獲取卵17枚,其中16枚成熟卵母細胞行ICSI授精。ICSI后16~18 h觀察有9枚正常的2PN受精卵。ICSI后第3天有4枚胚胎發(fā)育至8-細胞,另外5枚胚胎分別發(fā)育至10-細胞、9-細胞、7-細胞、6細胞、2-細胞。ICSI后第5天有3枚胚胎發(fā)育至囊胚(編號分別為:B4、B5、B10),第6天有1枚胚胎發(fā)育至囊胚(編號為:B13)。對這4枚囊胚成功進行了滋養(yǎng)層細胞活檢。

      二、CCA診斷結(jié)果

      采用MDA方法成功對4枚活檢囊胚(B4、B5、B10、B13)的滋養(yǎng)層細胞進行了全基因組擴增。

      在單體型分析時,我們選擇58個SNP高頻突變位點和一個致病位點(c.4274 G>A)對父親、母親和CCA患兒的外周血gDNA進行檢測。選擇父親在某個SNP位點上為雜合,而母親在該位點上為純合或雜合,同時結(jié)合CCA患兒的SNP位點,最終選擇符合要求的15個SNP位點和致病位點來構(gòu)建該家系單體型(表1)。

      根據(jù)家系單體型結(jié)果對4個活檢囊胚的滋養(yǎng)層細胞的MDA產(chǎn)物進行分析,發(fā)現(xiàn)B4和B10為正常囊胚,而B5和B13為感染CCA囊胚(表1);同時在囊胚B13中發(fā)生了來源于母源的基因重組現(xiàn)象(表1中B13的3號SNP位點),但該重組并沒有影響PGD結(jié)果。

      直接測序法結(jié)果與單體型分析結(jié)果完全一致(圖1)。

      三、隨訪結(jié)果

      在妊娠38周時剖腹產(chǎn)一體重為2 850 g的健康嬰兒,新生兒手指外型正常,其外周血gDNA中也未見致病基因突變,而父親和CCA患兒均表現(xiàn)為屈曲指(圖2)。

      表1 基于NGS的SNP單體型分析

      SNP位點父親母親CCA患兒B4B5B10B133GAAAAAAGAAAGAA12CTTTTTTCTTTCTT13GCGGGCGGGCGGGC16AGAAAGAAAGAAAG20TCCTCCTTTCCTCC21CACCCACCCACCCA22TCTTTCTTTCTTTC27(致病位點)GAGGGAGGGAGGGA37CACCCACCCACCCA43TATTTATTTATTTA45TCCTCCTTTCCTCC47CGGCGGCCCGGCGG54GCCCCCCGCCCGCC56GCGGGCGGGCGGGC58TATTTATTTATTTA59TCTTTCTTTCTTTC

      B4和B10為正?;蛐湍遗撸籅5和B13為CCA囊胚圖1 囊胚活檢滋養(yǎng)層細胞的直接測序結(jié)果

      箭頭示父親及患兒的屈曲指圖2 家庭成員的手指外型

      討 論

      CCA的發(fā)病率目前無法估計,因為它與另一種遺傳疾病馬凡氏綜合征(Marfan syndrome,MFS)在臨床表型上有部分重疊,而MFS是由原纖維蛋白1(FBN1)突變引起的[8]。因此,可以從基因水平上區(qū)分這兩種遺傳病。在我們的報道中,CCA是由FBN2基因的33號外顯子發(fā)生一錯義突變(c.4274 G>A)引起的。

      PGD幾乎能診斷所有已知突變的遺傳病,但仍有一些因素會導致PGD誤診[9]。ADO是導致PGD誤診的因素之一,對于顯性遺傳病而言,ADO會導致移植含有致病基因的胚胎。一旦發(fā)生誤診將會對患者造成經(jīng)濟上,尤其是精神上無法挽回的傷害。在診斷單基因病時一般采用多個多態(tài)(STR或SNP)位點結(jié)合致病位點進行單體型分析來發(fā)現(xiàn)ADO等誤診因素并防止誤診[10-11]。在我們的研究中,我們采用單體型分析和直接測序法兩種方法對CCA進行診斷,確保PGD的準確性。

      單體型分析方法除了可以發(fā)現(xiàn)ADO外,還可以區(qū)分致病基因所在的染色體和正常染色體,單倍體胚胎和二倍體胚胎。Qubbaj等[12]報道用直接測序法和單體型分析由純合突變引起的先天性高胰島素癥(congenital hyperinsulinism)。他們對活檢的卵裂球的MDA產(chǎn)物行直接測序,同時選用了7個連鎖的STR位點來驗證直接測序的準確性。其中4個胚胎中的一個胚胎經(jīng)直接測序診斷為正常的胚胎,而通過單體型分析發(fā)現(xiàn)該致病基因所在染色體的胚胎僅僅只有來源于父源等位基因,即該致病基因所在的染色體為單倍體或單體,這個胚胎是部分單體不能被用來移植。這就是單體型分析方法的優(yōu)勢所在,而直接測序法是無法做到的。此外還有一個潛在的誤診因素(基因重組)也是直接測序法無法發(fā)現(xiàn)的。減數(shù)分裂重組也會引發(fā)誤診[7],由于多態(tài)位點并不是致病基因本身,兩者雖然緊密連鎖但仍相距一定的距離,減數(shù)分裂過程中發(fā)生的基因重組可能會將多態(tài)位點與致病基因分割開來,甚至相距1 Mb的距離都會有1%的重組發(fā)生[13]。為了防止因基因重組而引發(fā)的誤診,在單體型分析時應盡可能選擇更多且離致病基因上下游較遠距離的多態(tài)位點。在我們的研究中,我們沒有采用STR作為多態(tài)位點來進行單體型分析,而是選擇在人基因組中數(shù)量更多且分布更廣的SNP位點,同時結(jié)合高通量測序(NGS)來進行單體型分析。由于SNP在不同人群中發(fā)生的頻率是有變化的,我們在南方漢人和北方漢人基因組中選擇致病基因FBN2上下游5 Mb范圍內(nèi)的58個SNP高頻突變位點和致病位點(c.4274 G>A),通過NGS獲得每個SNP位點的等位基因型,最終選擇了其中的15個SNP位點構(gòu)建家系單體型來確定致病位點所在染色體(表1),通過家系單體型再來分析囊胚感染CCA的情況(表1),結(jié)果發(fā)現(xiàn)囊胚B4和B10是沒有感染CCA的正常胚胎,而囊胚B5和B13是感染CCA的胚胎。此外,我們在囊胚B13中發(fā)現(xiàn)了一個來源于母源性重組現(xiàn)象(表1),但這個重組并沒有影響PGD的結(jié)果。單體型分析與直接測序法結(jié)果完全一致(圖1),但單體型分析可以將致病位點(c.4274 G>A)所在的染色體和正常染色體區(qū)分開來,同時也可以發(fā)現(xiàn)重組,保證PGD的準確性,而直接測序法沒有這些優(yōu)勢。因此,單體型分析結(jié)合致病基因檢測可以作為單基因病PGD的一種策略。

      雖然PGD已經(jīng)成功應用于臨床,但是產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)PGD仍有誤診存在。據(jù)歐洲人類生殖與胚胎協(xié)會(ESHRE)PGD聯(lián)盟報道[14],基于PCR和FISH的PGD周期中分別有0.14%和0.06%的誤診。一般建議接受PGD治療的患者在妊娠期間做產(chǎn)前診斷以確保PGD的準確性[15]。我們報道的患者于妊娠的21周行羊水穿刺,在培養(yǎng)的羊水細胞gDNA中沒有發(fā)現(xiàn)CCA致病基因的突變。此外,新生兒出生后具有完全正常的手指外型,其外周血gDNA也未見CCA致病基因的突變(圖2),這些都說明CCA的PGD是完全準確的。

      總之,采用基于NGS的SNP單體型分析結(jié)合致病基因檢測進行CCA的PGD,可以保證基因診斷的準確性,為該技術(shù)在其他單基因病診斷中的臨床應用提供了研究基礎(chǔ)。

      致謝

      特別感謝北京嘉寶仁和醫(yī)療科技有限公司在單體型分析上提供的技術(shù)支持。

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      [編輯:侯麗]

      Application of NGS-based SNP haplotyping for preimplantation genetic diagnosis of congenital contractural arachnodactyly

      CHEN Lin-jun, DIAO Zhen-yu, XU Zhi-peng, ZHOU Jian-jun, YAN Gui-jun, SUN Hai-xiang*

      ReproductiveMedicineCenter,DrumTowerHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityMedicalCollege,Nanjing210008

      Objective: To investigate the effectiveness of next generation sequencing (NGS)-based single nucleotide polymorphism (SNP) haplotyping for preimplantation genetic diagnosis (PGD) of congenital contractural arachnodactyly (CCA).Methods: Multiple displacement amplification (MDA) was performed for whole genome amplification (WGA) of biopsied trophectoderm cells. NGS-based SNP haplotyping and direct mutation detection by sequencing were used for PGD of CCA.Results: MDA was successfully performed for WGA of biopsied trophectoderm cells from four blastocysts. NGS-based SNP haplotype found that two blastocysts were unaffected by CCA, while another two blastocysts were affected by CCA. These diagnostic results were consistent with the results of direct mutation detection by sequencing. One blastocyst was transferred in the subsequent frozen embryo transfer (FET) cycle five months after oocyte retrieved. A weight of 2 850 g of healthy baby was born by cesarean section at the 38thweek of gestation.Conclusions: NGS-based SNP haplotyping is an effective screening tool for PGD of monogenic disorders.

      Preimplantation genetic diagnosis; Congenital contractural arachnodactyly; Multiple displacement amplification; Next generation sequencing; Single nucleotide polymorphism

      10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.011

      2016-06-26;

      2016-07-19

      陳林君,男,江蘇金壇人,碩士,助理研究員,生殖醫(yī)學專業(yè).(*

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