SPINK1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

錢婀娜，徐正順，于 泳，肖燕景

結(jié)直腸癌發(fā)病率在男性癌癥患者中居第3位，女性癌癥患者中居第2位[1]。這種疾病具有侵襲性，即使在目前的治療方式下仍有大量患者死亡。絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(serine protease inhibitor Kazal Ⅰ,SPINK1)是一種胰蛋白酶激酶抑制劑[2]，目前已知它與炎癥、細(xì)胞增殖和癌癥的發(fā)生有關(guān)，基因突變會(huì)導(dǎo)致慢性或遺傳性胰腺炎。而且，SPINK1表達(dá)水平改變與許多癌癥的預(yù)后有關(guān)[3]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種酪氨酸蛋白激酶受體，與其相應(yīng)配體結(jié)合，激活后參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，EGFR的過度表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)[4]。因此，酪氨酸激酶抑制劑被用來抑制腫瘤生長，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感性[5]。本研究利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測SPINKl和EGFR蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及探討與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料收集鄭州市第十人民醫(yī)院和鄭州市中心醫(yī)院病理科2012年至2013年手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌和結(jié)直腸腺瘤的石蠟組織標(biāo)本98例。其中，結(jié)直腸癌55例；所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或免疫治療，手術(shù)后進(jìn)行常規(guī)化療，隨訪時(shí)間2～36個(gè)月，疾病進(jìn)展定義為因結(jié)直腸癌死亡或在隨訪過程中出現(xiàn)新發(fā)的轉(zhuǎn)移；本組中有12例出現(xiàn)了新發(fā)的轉(zhuǎn)移及疾病相關(guān)性死亡。本組中結(jié)直腸腺瘤43例，選取40例病理證實(shí)癌旁正常組織作為正常對(duì)照。結(jié)直腸癌中男性35例，女性20例；年齡28～81歲，中位數(shù)年齡69.6歲；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)[6]公布的腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)，將結(jié)直腸癌分為Ⅰ+Ⅱ期24例，Ⅲ+Ⅳ期31例；臨床病理資料，見表1。所有標(biāo)本均經(jīng)40 g·L-1福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)和組織學(xué)結(jié)構(gòu)。鼠抗人SPINK1單克隆抗體(1∶800，Abnova公司，臺(tái)灣)，兔抗人EGFR多克隆抗體(即用型)及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。

1.2方法免疫組織化學(xué)染色，采用檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)，按試劑盒說明書操作，一抗4 ℃孵育過夜，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，并分別設(shè)立陽性對(duì)照，新鮮DAB顯色。由兩位病理學(xué)家獨(dú)立閱片，如有異議，病理學(xué)家一起分析最后得出一致結(jié)論。SPINKl免疫組化陽性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，EGFR陽性信號(hào)為細(xì)胞膜和/或胞質(zhì)著色。結(jié)果判定[7-8]：①無著色為0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；②陽性范圍記分：每張切片在光鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞率為0記0分，<10%記1分，10%～50%記2分，>50%記3分。上述2項(xiàng)結(jié)果相乘：0～1分為陰性(-)，2～9分為陽性(+)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SPINK1和EGFR蛋白在結(jié)直腸癌的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)直腸癌SPINK1蛋白與性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)(P<0.05)，而與年齡無關(guān)(P>0.05)，EGFR蛋白與有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 SPINK1和EGFR蛋白在結(jié)直腸癌的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 例

續(xù)表

組 別SPINK1+-P值EGFR+-P值無1411205腫瘤分期0.0130.038Ⅰ+Ⅱ159195Ⅲ+Ⅳ283301

注：SPINK1：絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型；EGFR：表皮生長因子受體。

2.2SPINK1和EGFR結(jié)直腸癌中SPINK1表達(dá)陽性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖1。EGFR陽性信號(hào)為細(xì)胞膜和/或胞質(zhì)，見圖2。SPINK1陽性率為78.18%(43/55)，高于結(jié)直腸腺瘤20.93%(9/43，P<0.05)及其周圍正常黏膜組2.50%(1/40，P<0.05)。結(jié)直腸腺瘤及其周圍正常黏膜組SPINK1的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)直腸癌中EGFR陽性率為89.09%(49/55)，高于結(jié)直腸腺瘤18.60%(8/43，P<0.05)及其周圍正常黏膜組7.50%(3/40，P<0.05)。結(jié)直腸腺瘤和及其周圍正常正常黏膜EGFR的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示SPINK1和EGFR在結(jié)直腸癌中表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.496，P<0.05)。

A:無染色；B:弱表達(dá)；C:中等強(qiáng)度表達(dá)；D:高強(qiáng)度表達(dá)。圖1 SPINK1在結(jié)直腸癌細(xì)胞胞質(zhì)中的染色強(qiáng)度(免疫組化，×400)

組 別SPINK1/例+-陽性率/%EGFR/例+-陽性率/%結(jié)直腸癌組431278.18①49689.09①結(jié)直腸腺瘤組93420.93 83518.60 對(duì)照組1392.50 3377.50

注：①與結(jié)直腸腺瘤組比較，P<0.05。SPINK1：絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型；EGFR：表皮生長因子受體。

2.3SPINK1蛋白的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性根據(jù)隨訪資料，43例SPINK1陽性的患者中有10例在治療過程中出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或腫瘤相關(guān)性死亡，中位生存期為23.31個(gè)月。12例SPINK1陰性的患者中有2例在治療過程中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或腫瘤相關(guān)性死亡，中位生存期為32.2月。Kaplan-Meie分析顯示SPINKl陽性表達(dá)的病例相對(duì)于陰性者具有較短的生存期或疾病進(jìn)展期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A:正常結(jié)腸黏膜；B:結(jié)直腸癌中胞質(zhì)弱表達(dá)；C:結(jié)直腸癌中胞質(zhì)中等強(qiáng)度表達(dá)；D:結(jié)直腸癌中胞質(zhì)高表達(dá)。圖2 EGFR在各組中的表達(dá)(免疫組化，×400)

圖3 SPINKI的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者疾病進(jìn)展的Kaplan-Meier曲線圖

3 討論

SPINK1是一種由SPINK基因編碼的胰蛋白酶抑制劑，由胰腺腺泡細(xì)胞分泌成胰液，也被稱為胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑(tumor-associated trypsin inhibitor,TATI)或胰腺分泌性胰蛋白酶抑制劑(pancreatic secretory trypsin inhibitor,PSTI)，已知在炎癥、細(xì)胞增殖和癌癥發(fā)病中起重要作用。有研究表明在胰腺癌、胃癌、腎癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌和前列腺癌中SPINK1在組織或血清中的過表達(dá)與預(yù)后差有關(guān)[9]。本研究表明，結(jié)直腸癌中SPINK1表達(dá)陽性率高于結(jié)直腸腺瘤及其周圍正常黏膜組織，結(jié)直腸癌SPINK1蛋白的表達(dá)與性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，提示在結(jié)直腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中SPINK1可能具有重要作用，進(jìn)一步行Kaplan-Meie分析顯示，SPINKl陽性表達(dá)的患者相對(duì)于陰性者具有較短的生存期或疾病進(jìn)展期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果與之前Gaber等研究相一致[10-11]。作為絲氨酸蛋白酶的弱抑制劑，SPINK1被認(rèn)為由于破壞細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的平衡而在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展中發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用[12]。有研究表明，SPINK1在肝組織中高表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，在結(jié)直腸癌患者血清中SPINK1水平與結(jié)直腸癌患者總體生存率有關(guān)[13]，表明SPINK1可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。

EGFR是一種酪氨酸激酶受體，表達(dá)于上皮性腫瘤中[14]。EGFR表達(dá)升高參與腫瘤的發(fā)生，包括細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移，與預(yù)后不良有關(guān)。在70%～80%的結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)EGFR過度表達(dá)，被認(rèn)為是靶向治療的靶點(diǎn)之一[15]。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌中EGFR表達(dá)陽性率高于結(jié)直腸腺瘤及其周圍正常黏膜組織，并且與有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，與先前Bansal等的發(fā)現(xiàn)相一致[16]，表明EGFR的過表達(dá)隨著腫瘤組織的惡性轉(zhuǎn)化而逐漸增加，是一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后預(yù)測因子[17]。

有研究通過放射免疫法測定顯示，SPINK1結(jié)合表面受體并刺激成纖維細(xì)胞中的DNA合成，在結(jié)構(gòu)上SPINK1包括與表皮生長因子相似的50%的序列同源性和3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，表明SPINK1可作為生長因子發(fā)揮作用。SPINK1可以誘導(dǎo)EGFR的二聚化和磷酸化，并通過MAPK通路促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖[18]。

總之，本研究結(jié)果SPINK1的高表達(dá)與疾病進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)，Kaplan-Meie分析顯示SPINKl陽性表達(dá)的病例相對(duì)于陰性者具有較短的生存期或疾病進(jìn)展期SPINK1的表達(dá)與EGFR在結(jié)直腸癌中表達(dá)呈正相關(guān)，SPINK1可被視為增生性腫瘤蛋白。二者在結(jié)直腸癌中的相互作用和分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，為未來的臨床決策和個(gè)體化靶向治療提供充分依據(jù)。

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