甘蔗CDK基因的cDNA全長(zhǎng)克隆與表達(dá)分析

蘇亞春黃 瓏凌 輝 王竹青 劉 峰 蘇煒華 黃 寧吳期濱 高世武 闕友雄

福建農(nóng)林大學(xué) / 農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國(guó)家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心, 福建福州 350002

甘蔗CDK基因的cDNA全長(zhǎng)克隆與表達(dá)分析

蘇亞春**黃 瓏**凌 輝 王竹青 劉 峰 蘇煒華 黃 寧吳期濱 高世武 闕友雄*

福建農(nóng)林大學(xué) / 農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國(guó)家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心, 福建福州 350002

植物細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 與周期蛋白(Cyclins)協(xié)同作用, 是重要的細(xì)胞周期性調(diào)控因子。本研究從甘蔗受花葉病毒侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得一條與高粱(Sorghum bicolor) CDK基因(GenBank登錄號(hào)為XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列, 通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1799 bp的甘蔗ScCDK基因(GenBank登錄號(hào)為KR258796)。序列分析顯示ScCDK基因含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(65～1603 bp), 編碼512個(gè)氨基酸, 且具有CDK典型保守結(jié)構(gòu)域, 如ATP結(jié)合位點(diǎn)、磷酸結(jié)合位點(diǎn)及活化環(huán)A-loop。此外, 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示該基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞核, 為可溶性蛋白, 不存在信號(hào)肽, 二級(jí)結(jié)構(gòu)元件多為無(wú)規(guī)則卷曲, 主要參與蛋白翻譯。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明, ScCDK基因的表達(dá)具有組織特異性, 其在蔗芽上的表達(dá)量最高, 其次是在蔗肉、蔗根、葉鞘和蔗皮中; 在PEG、NaCl和ABA的脅迫誘導(dǎo)過(guò)程中, ScCDK均表現(xiàn)上調(diào)作用,且受 ABA脅迫后表達(dá)量最高, 約為對(duì)照組的 1.9倍。推測(cè)該基因的表達(dá)與甘蔗抗干旱和抗?jié)B透脅迫有關(guān), 同時(shí)受ABA的誘導(dǎo), 參與細(xì)胞周期分裂。

甘蔗; CDK基因; 同源克隆; 生物信息學(xué)分析; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

細(xì)胞周期(cell cycle)是指細(xì)胞從一次有絲分裂開(kāi)始到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程, 主要包括間期(G1期、S期和G2期)和分裂期(M期) 2個(gè)過(guò)程[1]。細(xì)胞間期是真核生物細(xì)胞有絲分裂或者減數(shù)分裂的準(zhǔn)備時(shí)期, 在這一階段完成DNA的復(fù)制和相關(guān)蛋白質(zhì)的合成等[1]。細(xì)胞經(jīng)分裂期后一分為二,整個(gè)細(xì)胞周期完成, 細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期或者停止分裂[1]。

細(xì)胞周期各個(gè)階段的推進(jìn)依賴(lài)各種蛋白的相互調(diào)節(jié), 其中細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶(cyclindependent kinases, CDKs)起關(guān)鍵作用。CDKs是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶, 和周期蛋白(Cyclin)協(xié)同作用, 是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因子[2]。CDKs可以和Cyclin結(jié)合形成異二聚體, 其中CDK為催化亞基, Cyclin為調(diào)節(jié)亞基, 不同的Cyclin-CDK復(fù)合物通過(guò)調(diào)節(jié)CDK的活性催化不同底物的磷酸化, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期不同時(shí)相的推進(jìn)和轉(zhuǎn)化作用[3]。CDK的活性依賴(lài)于其正調(diào)節(jié)亞基Cyclin的順序性表達(dá)和其負(fù)調(diào)節(jié)亞基CDI (cyclin dependent kinase inhibitor, CDK抑制因子)的濃度。同時(shí), CDK的活性還受到磷酸化和去磷酸的調(diào)節(jié)[4]。CDK家族蛋白均具有一個(gè)類(lèi)似的 CDK結(jié)構(gòu)域, 其中含有一段保守序列, 即PSTAIRE區(qū)域(Pro-Ser-Thr-Ala-Ile-Arg-Glu區(qū)域, 激酶活性區(qū)域), 該序列可與cyclin box結(jié)合以促使靶蛋白的磷酸化[5]。在結(jié)構(gòu)上, CDKs包含3個(gè)重要的功能域[5], 其第 1個(gè)功能域?yàn)锳TP的結(jié)合部位和該酶的活性部分; 第2個(gè)功能域?yàn)镃yclin調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合部位; 第3個(gè)功能域?yàn)榱姿猁}結(jié)合位點(diǎn)P13 (suc1) (能抑制激酶活性, 阻止細(xì)胞進(jìn)入或退出 M 期)的結(jié)合部位。各種 CDKs在細(xì)胞周期特定的時(shí)間內(nèi)被激活, 通過(guò)磷酸化底物, 驅(qū)使細(xì)胞完成細(xì)胞周期[6]。

根據(jù)基因編碼蛋白的氨基酸序列及其結(jié)構(gòu)不同, CDKs功能存在差異, 但其一些重要位點(diǎn)的功能域,如絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)、蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)域、L12螺旋、αl螺旋和T-環(huán)等結(jié)構(gòu)較為保守[7]。CDKs序列的保守性說(shuō)明其功能在進(jìn)化上也具有高度的保守性, 這一保守性與生物細(xì)胞周期的精密調(diào)控密切關(guān)聯(lián)[8]。前人研究發(fā)現(xiàn), CDK基因的表達(dá)可能與植物體休眠—生長(zhǎng)的規(guī)律高度相關(guān)[9]。CDK與Cyclin結(jié)合形成CDK/Cyclin復(fù)合體, 通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及死亡[10]。目前植物中已發(fā)現(xiàn)的CDKs有9類(lèi), 但起作用的只有CDK1～CDK7類(lèi)基因[11]。其中, CDK1可與Cyclin (A、B1、B2、B3)結(jié)合, 在G2/M交界期起作用; CDK2可與Cyclin (A、E、D1、D2、D3)結(jié)合, 主要作用時(shí)期為G1/M交界期和S期; CDK3在G1/M交界期起作用; CDK4可與Cyclin (D1、D2、D3)結(jié)合并作用于G0/M交界期或G1期; CDK5與p35及Cyclin (D1、D2、D3)形成復(fù)合物, 促進(jìn)神經(jīng)微絲蛋白的磷酸化; CDK6與Cyclin (D1、D2、D3)結(jié)合促進(jìn)G0/G1期的轉(zhuǎn)化; CDK7與CyclinH及p36結(jié)合, 主要作用是激活 CDK1～CDK6[12-13]。前人在研究粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)細(xì)胞分裂周期基因cdc2和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的cdc28基因時(shí)發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白分子質(zhì)量約為 34 kD, 此后有關(guān)該基因家族的研究日益加深, 并正式命名為CDKs[14-15]。李海波等[16]對(duì)不同氮、磷狀況下水稻CDK基因表達(dá)分析表明, 在缺磷和供氮的情況下cdc2OS-1基因被誘導(dǎo)表達(dá), 從而促進(jìn)細(xì)胞分裂, 加速不定根和側(cè)根的生長(zhǎng)。同時(shí), 研究還發(fā)現(xiàn)干旱[17]、激素[18]等的脅迫會(huì)導(dǎo)致CDK基因表達(dá)變化, 從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期, 影響細(xì)胞的分裂進(jìn)程。

甘蔗(Saccharum spp.)是最重要的糖料作物, 也是高生物量的能源作物, 蔗糖約占我國(guó)食糖總產(chǎn)的92%。我國(guó)甘蔗85%種植于鹽堿地及旱地, 近年頻發(fā)的干旱、寒害和日趨嚴(yán)重的病蟲(chóng)害等, 對(duì)甘蔗生產(chǎn)造成極大的危害, 因此挖掘甘蔗抗逆性基因乃至解析甘蔗的抗逆性分子機(jī)制是甘蔗抗逆性育種中的重要基礎(chǔ)工作[19]。本研究從實(shí)驗(yàn)室前期甘蔗受花葉病毒侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(未發(fā)表)中獲得一條與高粱(Sorghum bicolor) CDK 基因(GenBank登錄號(hào)為XP_002466536.1)序列同源性達(dá) 98%的 Unigene, 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR, RT-qPCR)技術(shù), 對(duì)該基因在甘蔗不同組織中和各種外源脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行分析, 以期進(jìn)一步揭示該基因的功能和作用模式。研究結(jié)果有望為甘蔗CDK基因的克隆和功能驗(yàn)證及甘蔗響應(yīng)干旱、鹽等環(huán)境脅迫的分子研究積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料處理

從大田中隨機(jī)取回健康并且長(zhǎng)勢(shì)一致的崖城05-179植株(由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存), 將根部的泥土洗干凈, 選取健康乳白色的幼根作為材料, 而后選取第7或者第8節(jié)蔗節(jié), 用酒精擦凈外皮, 依次進(jìn)行側(cè)芽、蔗皮、蔗肉取樣, 同時(shí)進(jìn)行+1葉的蔗葉和葉鞘取樣,作為基因組織特異性的分析材料。與此同時(shí), 將從大田中取回的崖城05-179植株砍成單芽莖段, 洗凈后放入水浴鍋, 在100 mg L-1多菌靈(福瑞得, 中國(guó)鄭州)水溶液中進(jìn)行 50℃溫育40 min脫毒處理, 隨后將這些莖段種到無(wú)菌土中(16 h光/8 h暗, 28℃)培養(yǎng)蔗苗, 切下蔗苗用于無(wú)菌苗的誘導(dǎo)、擴(kuò)繁及生根。將獲得的無(wú)菌組培苗放入蒸餾水中預(yù)培養(yǎng) 10 d, 隨后選取生長(zhǎng)一致的小苗在平底試管中進(jìn)行可控環(huán)境下的試驗(yàn)處理[20], 即 100 μmol L-1脫落酸(abscisic acid, ABA)水溶液、25.0%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) 8000水溶液和250 mmol L-1氯化鈉(sodium chloride, NaCl)水溶液培養(yǎng)處理。分別于0、6、12和24 h (PEG-8000和ABA處理)或0、12、24和48 h (NaCl處理)各取3株蔗苗作為1次生物學(xué)重復(fù)的材料, 設(shè)每個(gè)處理3組生物學(xué)重復(fù)。將以上所有樣品放入液氮速凍并于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 甘蔗ScCDK基因克隆

采用 TRIzol法提取甘蔗崖城 05-179葉片的總RNA, 然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 中國(guó)大連)合成第一鏈cDNA, 作為RT-PCR的模板。基于從甘蔗受花葉病毒侵染的轉(zhuǎn)錄組(未發(fā)表)中挖掘到的一條與高粱CDK基因(GenBank登錄號(hào)為XM 002466491.1)同源性高達(dá)98%的Unigene序列, 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物, 其上游引物為 5′-CGACCTG ACCCGATTCGAAAG-3′, 下游引物為 5′-GTGCC ATCCTTCCAGTAAGT-3′。RT-PCR反應(yīng)體系為 25 μL, 包含10×GC緩沖液2.5 μL、10 mmol L-1dNTPs 2.0 μL、上下游引物(20 μmol L-1)各1.0 μL、Ex Taq酶0.125 μL、cDNA模板1.0 μL、ddH2O 17.375 μL。RT-PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min; 94℃變性1 min, 48℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Gel Extracti on Kit (Tiangen, 中國(guó)北京)純化回收, 并與 pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 在含氨芐青霉素(ampicillin)抗性的 LB平板上篩選陽(yáng)性克隆, 隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行 PCR鑒定[20], 并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序分析。

1.3 甘蔗ScCDK基因序列生物信息學(xué)分析

測(cè)序獲得的ScCDK基因cDNA序列經(jīng)NCBI的ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html)服務(wù)器, 進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析。此外, 借助ProtParam pI/Mw (http://web.expasy.org/compute_ pi/)、GOR IV (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=npsa_gor4.html)、 SWISSMODEL (http://swissmodel. expasy.org/)軟件預(yù)測(cè)目標(biāo)序列一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu); 再依次利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和 ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)軟件預(yù)測(cè)ScCDK基因編碼氨基酸的信號(hào)肽和疏水性/親水性; 然后利用Profun 2.2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ ProtFun/)和 Psort (http://www.psort.org/)軟件預(yù)測(cè)ScCDK基因編碼蛋白的功能和亞細(xì)胞定位; 最后使用Blastp工具在NCBI上查找甘蔗ScCDK同源氨基酸序列, 并運(yùn)用 MEGA4.0軟件中的近鄰相接法(neighbor-joining, NJ) (1000 BootStrap)構(gòu)建同源進(jìn)化樹(shù)。

1.4 ScCDK基因表達(dá)模式分析

采用TRIzol法提取經(jīng)ABA、PEG和NaCl脅迫處理的崖城05-179組培苗的總RNA, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit Perfect Real Time (Ta-KaRa, 中國(guó)大連)合成第1鏈cDNA, 作為qRT- PCR模板。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)ScCDK定量引物, 其上游引物為 5′-CTGTTAGAGAAGATG TTGAC-3, 下游引物為5′-ATGTGATGCCTCATACT T-3′。采用ABI 7500 Real-time PCR System (美國(guó))以CAC (clathrin adaptor complex) (上游引物5′-ACAA CGTCAGGCAAAGCAAA-3′, 下游引物5′-AGATCA ACTCCACCTCTGCG-3′)和CUL (cullin) (上游引物5′-TGCTGAATGTGTTGAGCAGC-3′, 下游引物5′-T TGTCGCGCTCCAAGTAGTC-3′)作為內(nèi)參基因[20-21]。按照SYBR Green PCR Master Mix Kit (Rox) (Roche,上海)說(shuō)明書(shū)配置定量反應(yīng)體系。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s、60℃ 1 min, 45個(gè)循環(huán); 增加熔解曲線(xiàn)。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。采用 2-ΔΔCT算法[22]分析基因相對(duì)表達(dá)量, 用DPS軟件分析數(shù)據(jù)顯著性, 用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗ScCDK基因的克隆

以甘蔗崖城05-179的葉片cDNA為模板, 采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了約 1799 bp的單一條帶(圖1)。該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接轉(zhuǎn)化、菌落PCR檢測(cè)和菌液測(cè)序鑒定, 得到圖2序列。使用ORF finder分析發(fā)現(xiàn), ScCDK (GenBank登錄號(hào)為KR258796)基因含有一個(gè)1539 bp的完整ORF (65～1603 bp), 編碼512個(gè)氨基酸。

圖1 甘蔗ScCDK基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig. 1 RT-PCR amplification of ScCDK gene in sugarcaneM: DNA marker 15000+2000; 1: RT-PCR產(chǎn)物。M: DNA marker 15000+2000; 1: RT-PCR product.

2.2 甘蔗ScCDK基因序列分析

2.2.1 ScCDK基因編碼氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

ExPASy-ProtScale軟件預(yù)測(cè)顯示, ScCDK編碼蛋白的分子式為 C2513H3881N727O731S18, 理論分子量為56.5 kD, 等電點(diǎn)為9.32, 負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)有48個(gè), 正電荷殘基(Arg+Lys)有62個(gè), 不穩(wěn)定系數(shù)(II)為 38.12, 平均疏水性(GRAVY)為-0.775, 脂肪系數(shù)(AI)為 63.09。由此推測(cè) ScCDK蛋白為一個(gè)穩(wěn)定的堿性蛋白。

2.2.2 ScCDK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 由GOR IV軟件預(yù)測(cè)可知, 甘蔗ScCDK蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈 3種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成,其中無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例最高為 59.57%, α-螺旋和延伸鏈所占比例分別為20.70%和19.73%, 該預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ScCDK蛋白缺少β-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖2 甘蔗ScCDK基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of sugarcane ScCDK gene下畫(huà)線(xiàn)部分為RT-PCR特異性引物在基因序列中的位置; 文本框部分為基因編碼區(qū)的起始密碼子和終止密碼子。＊終止密碼子。The sequence fragment complementary to primer is underlined. The initiation and termination codons of the coding region of the target gene are highlighted in text box. * Stop codon.

2.2.3 ScCDK蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè) ProtScale軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn), 在ScCDK基因的編碼氨基酸序列中, 少部分殘基為疏水性, 且集中分布于第 223～第234位氨基酸之間, 其中第231位具有最高分值,為 2.167, 疏水性最強(qiáng); 大部分的氨基酸殘基為親水性, 且分值都處于較低的位置, 其中第 353位具有最低分值, 為-3.856, 親水性最強(qiáng)。預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白具有較強(qiáng)的親水性, 為親水性蛋白。

2.2.4 ScCDK蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)和分析 SignalP 4.0 Server軟件預(yù)測(cè)結(jié)果(表1)顯示, ScCDK編碼蛋白的第25位賴(lài)氨酸殘基可能是信號(hào)肽原始剪切位點(diǎn), 其最高預(yù)測(cè)分值及最高的信號(hào)肽分值分別僅為0.127和0.138,綜合分析結(jié)果表明ScCDK蛋白無(wú)信號(hào)肽。

2.2.5 ScCDK蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 由蛋白預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)圖(圖3)可以看出, ScCDK蛋白的空間結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。比較甘蔗ScCDK與高粱(Sorghum bicolor, XM_002466491.1)、玉米(Zea mays, XM_008644544.1)和水稻(Oryza sativa, EEC72196.1) CDK蛋白的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)虛擬圖, 顯示ScCDK的三級(jí)空間構(gòu)象與高粱高度相似, 而與玉米和水稻CDK蛋白空間結(jié)構(gòu)存在一定的差異(圖3)。

表1 甘蔗ScCDK蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Table 1 Signal P-NN prediction for sugarcane ScCDK protein

圖3 甘蔗、高粱、玉米和水稻CDK蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 3 Predicted third structure of CDK proteins in sugarcane, Sorghum bicolor, Zea mays and Oryza sativa甘蔗ScCDK: KR258796.1; 高粱CDK: XM_002466491.1; 玉米CDK: XM_008644544.1; 水稻CDK: EEC72196.1; 箭頭顯示甘蔗ScCDK與玉米和水稻CDK蛋白空間結(jié)構(gòu)的差異。Sugarcane ScCDK: KR258796.1; Sorghum bicolor CDK: XM_002466491.1; Zea mays CDK: XM_008644544.1; Oryza sativa CDK: EEC72196.1. The arrow indicates the third structure difference among sugarcane ScCDK, Zea mays CDK and Oryza sativa CDK proteins.

2.2.6 ScCDK 蛋白功能預(yù)測(cè) 根據(jù) Profun 2.2 Server軟件預(yù)測(cè)顯示, ScCDK蛋白功能主要參與翻譯, 其可能性為 1.614; 其次 ScCDK也可能參與了嘌呤和嘧啶類(lèi)合成、脂肪酸代謝及中間代謝, 其概率依次為1.362、1.308和0.762。

2.2.7 ScCDK蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) Psort軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明, 甘蔗ScCDK蛋白定位于細(xì)胞核的可能性最大(98.0%), 其次是微小體(45.8%), 再次是溶酶體(25.0%), 而被定位在線(xiàn)粒體基質(zhì)上的可能性最小, 僅為10.0%。

圖4 甘蔗ScCDK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 4 Conserved domain prediction of ScCDK protein

2.2.8 ScCDK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析 如圖4所示, ScCDK含有 CDK蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征, 包括Ser/Thr蛋白激酶S-TKc結(jié)構(gòu)域、活性位點(diǎn)等。該蛋白屬于PKc-like superfamily, 具有PTZ00024多元結(jié)構(gòu)域, 在第30個(gè)殘基到第180個(gè)殘基之間有ATP結(jié)合位點(diǎn), 隨后在第 250個(gè)殘基到第300個(gè)殘基之間存在CDK/cyclin interface的結(jié)合位點(diǎn), 同時(shí)還具有激酶活性必須的活化環(huán) A-loop, 這些典型結(jié)構(gòu)特征都是CDK蛋白所具有的。

2.2.9 ScCDK蛋白的氨基酸同源性分析 應(yīng)用NCBI中的BlastP程序, 對(duì)ScCDK蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn), 該蛋白與高粱(XP_ 002466536.1)、 玉 米 (P_008644544.1)、 谷 子(KQL08688.1)和水稻(EEC72196.1)的CDK蛋白氨基酸序列相似性分別為98%、96%、96%和93% (圖5)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示, ScCDK蛋白與高粱CDK蛋白(XP_002466536.1)親緣關(guān)系較近(圖6)。

2.3 ScCDK基因的組織特異性表達(dá)分析

qRT-PCR分析結(jié)果如圖7顯示, ScCDK基因在不同甘蔗組織器官中均有表達(dá), 其在側(cè)芽中表達(dá)量最高, 是蔗皮中的 3.91倍; 其次是在蔗肉和蔗根中的表達(dá)量, 分別為蔗皮中的2.06倍和1.97倍; 而在蔗皮中表達(dá)量最少。由此可知, ScCDK基因的表達(dá)存在組織特異性。

圖5 甘蔗ScCDK蛋白與其他物種CDK蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig. 5 Homology analysis of sequences from sugarcane ScCDK and those from other species

圖6 5個(gè)物種基于CDK氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 6 Phylogenetic tree of five plant species based on CDK protein sequences

2.4 ScCDK基因在非生物脅迫下的表達(dá)特性分析

RT-qPCR分析結(jié)果(圖8)表明, 甘蔗 ScCDK基因在不同非生物脅迫下具有不同的表達(dá)特性。從總體上看, ScCDK在應(yīng)答外源PEG、ABA及NaCl脅迫中均呈現(xiàn)被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的模式。在ABA處理6 h時(shí), ScCDK的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最大值, 為對(duì)照組的1.92倍, 隨后6～24 h的表達(dá)量有所下降, 但仍高于對(duì)照水平; 在PEG處理下, ScCDK的相對(duì)表達(dá)量在6 h上調(diào), 在 12 h下降至與對(duì)照相當(dāng)?shù)乃? 隨后在24 h上調(diào)達(dá)到最大值, 為對(duì)照組的1.49倍; 受NaCl脅迫后, 相比于對(duì)照, ScCDK基因表達(dá)量均上調(diào), 且其在處理 24 h后的相對(duì)表達(dá)量最高, 為對(duì)照組的1.63倍。

圖7 甘蔗ScCDK基因在不同組織中的表達(dá)Fig. 7 Relative expression of ScCDK gene in different sugarcane tissues誤差線(xiàn)為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n = 3)。Error bars represent the standard error of each treating group (n = 3).

3 討論

甘蔗作為一種重要的糖料和能源作物, 在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要的作用。但是, 各種病害等生物脅迫及干旱、低溫等非生物逆境條件嚴(yán)重危害甘蔗生產(chǎn), 造成了甘蔗的產(chǎn)量與糖分損失[21]。近年來(lái), 隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展, 利用基因工程技術(shù)尤其是轉(zhuǎn)基因策略對(duì)甘蔗品種進(jìn)行遺傳改良被證明是一種有效途徑[22]。其中, 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、經(jīng)功能鑒定的甘蔗基因資源的挖掘是其前提和基礎(chǔ)。

圖8 甘蔗ScCDK基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)Fig. 8 Gene expression of sugarcane ScCDK under different exogenous stresses誤差線(xiàn)為每組處理的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n = 3)。Error bars represent the standard error of each treating group (n = 3).

前人研究表明, CDKs屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族, 編碼該蛋白的基因較多, 屬于多基因家族[23]。本研究參考實(shí)驗(yàn)室前期甘蔗受花葉病毒侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù), 從甘蔗中成功分離獲得一條ScCDK基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明, ScCDK序列具有完整的開(kāi)放讀碼框, 其編碼蛋白在不同物種間的保守性較高, 與高粱、玉米、谷子和水稻的CDK蛋白同源性高達(dá) 93%以上。該目標(biāo)基因所編碼的蛋白極可能定位于細(xì)胞核(98%概率)上。前人研究表明, CDK基因具有參與細(xì)胞分裂的特性, 其編碼蛋白定位于細(xì)胞核中的幾率較大[24], 這一定位結(jié)果與擬南芥(Arabidopsis thaliana)[25]、煙草(Nicotiana tabacum)[26]、茶樹(shù)(Camellia sinensis)[7]等CDK蛋白的核定位分析一致, 這也與我們ScCDK的核定位預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。此外, ScCDK基因編碼的蛋白為親水、非分泌堿性蛋白, 在蛋白質(zhì)翻譯中可能發(fā)揮作用,這一結(jié)果與吳向偉等的研究結(jié)果類(lèi)似[26]。CDK作為細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)亞單位, 其與周期蛋白結(jié)合后會(huì)表現(xiàn)出激酶活性。細(xì)胞周期蛋白序列上均含有一段約 100個(gè)氨基酸的保守細(xì)胞周期框(cyclin box),這個(gè)周期蛋白框能夠介導(dǎo)Cyclin與CDK的結(jié)合, 不同的周期蛋白可以識(shí)別不同的CDK, 組成不同的復(fù)合物, 表現(xiàn)出不同的激酶活性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)的ScCDK基因編碼蛋白具有 cyclin/CDK結(jié)合位點(diǎn)、ATP結(jié)合位點(diǎn)等, 屬于典型的CDK家族蛋白。

CDK作為細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的重要成分, 是細(xì)胞周期運(yùn)行的引擎分子[2,6]。有研究結(jié)果顯示, 植物CDK基因在休眠體中少量或不表達(dá), 在分裂旺盛的植物器官中高表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞的快速分裂, 當(dāng)達(dá)到一定的分化程度后又會(huì)表現(xiàn)出低表達(dá)的狀態(tài), 這時(shí)旺盛分裂結(jié)束, 細(xì)胞分裂進(jìn)入穩(wěn)定期或休眠期[27]。本研究對(duì) ScCDK基因的組織特異性表達(dá)分析顯示,該基因在甘蔗各組織中均有表達(dá), 但在蔗芽中的表達(dá)量明顯高于其他組織, 這可能是由于芽體細(xì)胞分裂旺盛, 細(xì)胞處于分裂期, 暗示ScCDK基因可能與蔗芽細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)有關(guān)。同樣地, 李海波等[16]研究發(fā)現(xiàn)CDK基因能夠特異性地調(diào)控細(xì)胞分裂, 在生長(zhǎng)旺盛的組織中表達(dá)量較高。本研究中ScCDK基因在甘蔗側(cè)芽、蔗肉、根、葉鞘、表皮等組織中均有表達(dá)且表達(dá)量呈遞減趨勢(shì), 這可能與各組織的分裂旺盛程度相關(guān)。

細(xì)胞的周期性分裂受多種激素調(diào)節(jié), 不同激素及同一激素不同的含量對(duì)其作用不同[28-30]。趙莉娜[17]對(duì)干旱處理后擬南芥中 CDKC2基因的功能研究表明, 逆境條件下該基因表達(dá)增強(qiáng), 干旱脅迫下CDKC2基因更多地參與細(xì)胞周期調(diào)控以抵御逆境造成的傷害。有趣的是, 本研究表明, ScCDK對(duì)外源PEG、ABA和NaCl的應(yīng)答均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)模式。吳向偉[31]對(duì)克隆到的煙草NtCDK8基因應(yīng)對(duì)不同逆境條件下的時(shí)空表達(dá)分析時(shí)發(fā)現(xiàn), 在鹽誘導(dǎo)下, 該基因在3 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值, 約為對(duì)照組的3倍,但隨后直至48 h其表達(dá)量一直下降, 說(shuō)明NtCDK8基因在NaCl脅迫下表達(dá)被抑制; 而在相同處理時(shí)間點(diǎn), ABA和PEG脅迫下NtCDK8基因的表達(dá)量明顯被誘導(dǎo)且均高于對(duì)照水平, 并在48 h達(dá)到峰值。本研究中, ScCDK基因在應(yīng)對(duì)ABA、NaCl、PEG等的脅迫中在24 h或者該時(shí)間點(diǎn)前表達(dá)量就已達(dá)到峰值,應(yīng)答時(shí)間短, 這可能與細(xì)胞的防御機(jī)制有關(guān)。有研究報(bào)道, CDK可以通過(guò)調(diào)節(jié)各種信號(hào)途徑而參與植物抵御各種生物脅迫[32-33]。Zhu等[33]研究CDK8在擬南芥中的防御功能時(shí)發(fā)現(xiàn), 其通過(guò)調(diào)節(jié)抗性基因PDF 1.2的啟動(dòng)子及與中介體復(fù)合亞基25互作而參與茉莉酸介導(dǎo)的防御反應(yīng)。

4 結(jié)論

通過(guò)同源克隆獲得 1個(gè)甘蔗 ScCDK基因, 其cDNA全長(zhǎng)1799 bp, 編碼512個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)為定位于細(xì)胞核上的親水堿性蛋白。ScCDK基因表達(dá)存在組織特異性, 其表達(dá)量在蔗芽中明顯高于其他組織, 該基因廣泛存在于各甘蔗組織器官中, 參與細(xì)胞分裂過(guò)程, 而且受NaCl、PEG和ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 說(shuō)明ScCDK為潛在的積極響應(yīng)逆境脅迫的功能基因。

[1] Ukomadu C, Chem J B. Cyclin-dependent Kinases. Germany: Springer Berlin Heidelberg, 2004. p 279

[2] Morgan D O. Cyclin-dependent kinases: Engines, clocks, and microprocessors. Annu Rev Cell Dev Biol, 1997, 13: 261-291

[3] 高燕, 林莉萍, 丁健. 細(xì)胞周期調(diào)控的研究進(jìn)展. 生命科學(xué), 2005, 17: 318-322

Gao Y, Lin L P, Ding J. A review: cell cycle regulation. Chinese Bull Life Sci, 2005, 17: 318-322 (in Chinese with English abstract)

[4] Morgan D O. Principles of CDK regulation. Nature, 1995, 374: 131-134

[5] 盧夢(mèng)玲, 閆超, 賴(lài)多, 徐漢虹. Cyclin D1與細(xì)胞周期調(diào)控. 生物技術(shù)通報(bào), 2011, 27(10): 55-59

Lu M L, Yan C, Lai D, Xu H H. Cyclin D1 and cell cycle regulation. Biotechnol Bull, 2011, 27(10): 55-59 (in Chinese with English abstract)

[6] Hoffmann I. Cyclin-dependent Protein Kinases and the Regulation of the Eukaryotic Cell Cycle. Weinheim: Verlag Chemie, 1996. pp 179-201

[7] 王新超, 馬春雷, 楊亞軍, 金基強(qiáng), 馬建強(qiáng), 曹紅利. 茶樹(shù)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶(CsCDK)基因 cDNA全長(zhǎng)克隆與分析.園藝學(xué)報(bào), 2012, 39: 333-342

Wang X C, Ma C L, Yang Y J, Jin J Q, Ma J Q, Cao H L. cDNA cloning and expression analysis of cyclin-dependent kinase (CsCDK) gene in tea plant. Acta Hort Sin, 2012, 39: 333-342 (in Chinese with English abstract)

[8] Serrano M, Hannon G J, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993, 366: 704-707

[9] Malumbres M, Barbacid M. Cell cycle, CDKs and cancer: a changing paradigm. Nat Rev Cancer, 2009, 9: 153-166

[10] Zwijsen R M, Wientjens E, Klompmaker R, van der Sman J, Bernards R, Michalides R J. CDK-independent activation of estrogen receptor by cyclin D1. Cell, 1997, 88: 405-415

[11] Malumbres M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol, 2014, 15: 122

[12] Harper J W, Adams P D. Cyclin-dependent kinases. Chem Rev, 2001, 101: 2511-2526

[13] Nigg E A. Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of the eukaryotic cell cycle. Curr Opin Cell Biol, 1995, 17: 471-480

[14] Norbury C, Nurse P. Animal cell cycles and their control. Annu Rev Biochem, 1992, 61: 441-470

[15] Nasmyth K. Control of the yeast cell cycle by the Cdc28 protein kinase. Curr Opin Cell Biol, 1993, 5: 166-179

[16] 李海波, 王小兵, 夏銘, 吳平. 不同氮、磷狀況對(duì)水稻根生長(zhǎng)及細(xì)胞周期蛋白激酶(CDKs)基因表達(dá)的影響. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 28: 59-64

Li H B, Wang X B, Xia M, Wu P. The effects of phosphorus and nitrate status on root growth and expression of cyclin-dependent kinases (CDKs) in rice. J Plant Physiol Mol Biol, 2002, 28: 59-64 (in Chinese with English abstract)

[17] 趙莉娜. 擬南芥CDKC2基因在植物耐旱及葉片細(xì)胞分裂過(guò)程中相關(guān)功能的研究. 中國(guó)科學(xué)院研究生院碩士學(xué)位論文, 北京, 2010

Zhao L N. Study on the Correlation Functions of Arabidopsis thaliana CDKC2 Gene in Plant Drought Tolerance and Leaf Cell Division. MS Thesis of University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China, 2010 (in Chinese with English abstract)

[18] 崔美. 蘋(píng)果周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶基因 MdCDKB1的克隆及表達(dá)分析. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 山東泰安, 2012

Cui M. Cloning and Expressing Analysis of Cyclin-Dependent Kinase B1 in Malus × domestica Borkh. MS Thesis of Shandong Agricultural University, Tai’an, China, 2012 (in Chinese with English abstract)

[19] 郭晉隆, 李國(guó)印, 蘇亞春, 王恒波, 闕友雄, 徐景升, 許莉萍.甘蔗R2R3-MYB類(lèi)似基因Sc2RMyb1的克隆及表達(dá)特性分析.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2012, 20: 1009-1017

Guo J L, Li G Y, Su Y C, Wang H B, Que Y X, Xu J S, Xu L P. Sugarcane R2R3-MYB similar gene cloning and expression of Sc2RMyb1 characteristics analysis. J Agric Biotechnol, 2012, 20: 1009-1017 (in Chinese with English abstract)

[20] 黃瓏, 蘇煒華, 張玉葉, 黃寧, 凌輝, 肖新?lián)Q, 闕友雄, 陳如凱. 甘蔗CIPK基因的同源克隆與表達(dá). 作物學(xué)報(bào), 2015, 41: 499-506

Huang L, Su W H, Zhang Y Y, Huang N, Ling H, Xiao X H, Que Y X, Chen R K. Cloning and expression analysis of CIPK gene in sugarcane. Acta Agron Sin, 2015, 41: 499-506 (in Chinese with English abstract)

[21] 吳才文, 范源洪, 陳學(xué)寬, 劉家勇, 趙俊, 趙培方, 夏紅明, 楊昆. 云南抗旱甘蔗品種的選育及效果. 中國(guó)糖料, 2012, (4): 37-39

Wu C W, Fan Y H, Chen X K, Liu J Y, Zhao J, Zhao P F, Xia H M, Yang K. Breeding of drought-resistant sugarcane varieties in Yunnan. Sugar Crop China. 2012, (4): 37-39 (in Chinese with English abstract)

[22] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod. Methods, 2001, 25: 402-408

[23] Sherr C J, Roberts J M. Living with or without cyclins and cyclin-dependent kinases. Genes Dev, 2004, 18: 2699-2711

[24] Mironov V, Veylder L D, Montagu MV, Inzé D. Cyclin-dependent kinases and cell division in plants-the nexus. Plant Cell, 1999, 11: 509-522

[25] 趙臻, 邱凱, 蒯本科. 人工 microRNA干擾擬南芥 AtCDKC;1和 AtCDKC;2基因表達(dá)的初步研究. 植物生理學(xué)通訊, 2010, 46: 693-700

Zhao Z, Qiu K, Kuai B K. A preliminary analysis of artificial microRNAs-mediated interference of AtCDKC;1 and AtCDKC;2 expression in Arabidosis. Plant Physiol Commun, 2010, 46: 693-700 (in Chinese with English abstract)

[26] 吳向偉, 王根洪, 聶夢(mèng)云, 熊海軍, 謝小東, 夏慶友. 煙草周期蛋白依賴(lài)性激酶基因 NtCDK8的克隆及生物信息學(xué)分析.煙草科技, 2014, 47(10): 71-74

Wu X W, Wang G H, Nie M Y, Xiong H J, Xie X D, Xia Q Y. Cloning and bioinformatics analysis of cyclin-dependent protein kinase gene NtCDK8 from Nicotiana tabacum. Tob Sci Tech, 2014, 47(10): 71-74 (in Chinese with English abstract)

[27] Mellerowicz E, Riding R, Little C. Genomic variability in the vascular cambium of Abies balsamea. Can J Bot, 1989, 4: 990-996

[28] 李英, 喻景權(quán), 朱祝軍, 陳暄, 胡文海. CPPU對(duì)瓠瓜單性結(jié)實(shí)的誘導(dǎo)作用及對(duì)細(xì)胞分裂和內(nèi)源激素水平的影響. 植物生理學(xué)報(bào), 2001, 27: 167-172

Li Y, Yu J Q, Zhu Z J, Chen X, Hu W H. Fruit growth, cell division and endogenous hormones level in parthencarpic fruit formed by CPPU induction in Lagenaria leucantha. Acta Phytophysiol Sin, 2001, 27: 167-172 (in Chinese with English abstract)

[29] 閆樹(shù)堂, 徐繼忠. 不同矮化中間砧對(duì)紅富士蘋(píng)果果實(shí)內(nèi)源激素、多胺與細(xì)胞分裂的影響. 園藝學(xué)報(bào), 2005, 32: 31-33

Yan S T, Xu J Z. The effects of different dwarfing interstocks on the endogenous hormones polyamines and cell division in fruits of red Fuji apple. Acta Hort Sin, 2005, 32: 31-33 (in Chinese with English abstract)

[30] 朱宏, 張忠恒. 小麥花粉培養(yǎng)中蔗糖濃度外源激素低溫前處理對(duì)啟動(dòng)細(xì)胞分裂的作用. 哈爾濱師范大學(xué)(自然科學(xué)學(xué)報(bào)), 2002, 18(3): 91-95

Zhu H, Zhang Z H. An analytic study of the sucrouse concentrations, the exogenous hormones and the low temperature pretreatment in fluencing the initiation of cell division in wheat pollen culture. Nat Sci J Harbin Norm Univ, 2002, 18(3): 91-95 (in Chinese with English abstract)

[31] 吳向偉. 煙草細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶 NtCDK8基因的克隆及功能分析. 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文, 重慶, 2015

Wu X W. Cloning and Functional Analysis of Cyclin-Dependent Protein Kinases, NtCDK8 from Nicotiana tobacco. MS Thesis of Southwest University, Chongqing, China, 2015 (in Chinese with English abstract)

[32] Wells A D. Cyclin-dependent kinases: molecular switches controlling energy and potential therapeutic targets for tolerance. Semin Immunol, 2007, 19: 173-179

[33] Zhu Y F, Schluttenhoffer C M, Wang P C, Fu F Y, Thimmapuram J, Zhu J K, Lee S Y, Yun D J, Mengiste T. Cyclin-dependent kinase8 differentially regulates plant immunity to fungal pathogens through kinase-dependent and -independent functions in Arabidopsis. Plant Cell, 2014, 26: 4149-4170

Cloning and Expression Analysis of CDK Gene in Sugarcane

SU Ya-Chun**, HUANG Long**, LING Hui, WANG Zhu-Qing, LIU Feng, SU Wei-Hua, HUANG Ning, WU Qi-Bin, GAO Shi-Wu, and QUE You-Xiong*
Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture / Fujian Agriculture and Forestry University / Sugarcane Research & Development Center, China Agricultural Technology System, Fuzhou 350002, China

Plant cyclin-dependent kinases (CDKs) are a specific class of serine/threonine protein kinases, which synergize with cyclins and play an important role in the process of cell regulation. In this study, a unigene that was highly homologous to the Sorghum biocolor CDK sequence (GenBank accession No. XP_002466536.1) was isolated from the sugarcane transcriptome in response to Sorghum mosaic virus (SrMV) infection. This gene was validated by RT-PCR and named as ScCDK (GenBank accession No. KR258796). ScCDK has a full-length cDNA of 1799 bp and contained a complete open reading frame (65-1603 bp) encoding 512 amino acids. The ScCDK protein contains the typical conservative CDK domains, such as ATP binding site, polypeptide substrate binding site and activation loop. Bioinformatics prediction indicated that ScCDK is soluble protein located in cell nucleus, very likely involved in intermediary metabolism, and has no signal peptide but with random coil according to its secondary structure. qRT-PCR assay revealed that ScCDK gene had tissue-specific expression in sugarcane, with the highest expression level in bud, followed by stem pith, root, leaf sheath and epidermis. The gene expression level was up-regulated by PEG, NaCl, and ABA, particularly ABA treatment resulted in 1.9-fold higher expression of ScCDK compared to the control. These results suggest that ScCDK participates in the response of drought and osmotic stresses and the cell cycle division in sugarcane andcan be induced by ABA.

Sugarcane; CDK; Homology cloning; Bioinformatics analysis; qRT-PCR

10.3724/SP.J.1006.2017.00042

本研究由福建省杰出青年科學(xué)基金(2015J06006), 福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(JA14095), 引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃(948計(jì)劃)項(xiàng)目(2014-S18)和國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-20)項(xiàng)目資助。

This work was supported by Fujian Natural Science Funds for Distinguished Young Scholar (2015J06006), the Program for New Century Excellent Talents in Fujian Province University (JA14095), the Program of Introducing International Super Agricultural Science and Technology (948 Program) (2014-S18), and the China Agriculture Research System (CARS-20).

*通訊作者(Corresponding author): 闕友雄, E-mail: queyouxiong@126.com

聯(lián)系方式: 蘇亞春, E-mail: syc2009mail@163.com; 黃瓏, E-mail: 373889724@qq.com

稿日期): 2015-12-31; Accepted(接受日期): 2016-07-11; Published online(

日期): 2016-07-28.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160728.0817.012.html