大菱鲆胚胎生長發(fā)育的研究

佟雪紅++鮑成滿++湯新慧++楊小蘭++陳倩

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.092

摘要：觀察了大菱鲆胚胎的發(fā)育過程，研究了其發(fā)育特征和胚體的生長特征。結(jié)果表明，大菱鲆受精卵在水溫為14.4 ℃、鹽度為3.1%～3.3%條件下，歷經(jīng)103 h胚體孵化出膜。胚體長度在卵裂期、囊胚期、原腸期、器官形成期經(jīng)歷了“縮小-膨大-再縮小-再膨大”的變化過程，并在卵裂期達到最低值1.015 mm，胚體大小的變化跟不同發(fā)育期的細胞運動以及器官發(fā)育密切相關(guān)。胚體中油球直徑從受精卵至卵裂期逐漸增加并在卵裂期達到最高值 0.186 mm，之后逐漸減小。胚體質(zhì)量在卵裂期時最低，為0.509 mg，之后快速增長并在原腸期達到最高值0.576 mg，此后急劇降低，在孵化時胚體質(zhì)量為0.525 mg。

關(guān)鍵詞：大菱鲆；胚胎發(fā)育；生長；油球；體質(zhì)量

中圖分類號： S961.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0318-03

收稿日期：2015-08-29

基金項目：國家自然科學基金（編號：31340007）；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目；江蘇省高校自然科學基礎(chǔ)研究項目（編號：12KJB240001）；江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設實驗室開放課題（編號：JLCBE12003）；鹽城師范學院教授、博士基金（編號：6207110006）。

作者簡介：佟雪紅（1979—），女，江蘇鹽城人，博士，講師，研究方向為魚類生理學。E-mail：txh113005@163.com。大菱鲆（Scophthalmus maximus）屬鲆科（Bothidae）菱鲆屬（Scophthalmus），在中國又稱“多寶魚”，自然分布于東北大西洋沿岸。它具有適應低水溫生活、生長速度快、肉質(zhì)好、養(yǎng)殖和市場潛力大等優(yōu)點，是名貴的低溫經(jīng)濟魚類，現(xiàn)已成為我國北方沿海重要的養(yǎng)殖品種[1]。

關(guān)于大菱鲆早期發(fā)育變化規(guī)律的研究已有一些報道。雷霽霖等對大菱鲆胚胎和仔魚、稚魚發(fā)育進行了詳細闡述[2]；李慶華等采用營養(yǎng)強化和控光控溫方法對大菱鲆親魚性腺發(fā)育及卵子質(zhì)量的影響進行了研究[3]；彭墨等用亞麻籽油替代魚油對大菱鲆幼魚生長、脂肪酸組成及脂肪沉積的影響進行了探討[4]；苗淑彥等探究了飼料中不同種類的碳水化合物對大菱鲆幼魚生長、成活、飼料利用、體組成和血液生理生化指標等的影響[5]；Al-Maghazachi等對大菱鲆仔魚、稚魚的發(fā)育進行了分期研究[6]；van Bussel等研究了硝酸鹽對大菱鲆幼魚的生長生理的影響[7]。上述研究主要圍繞大菱鲆早期發(fā)育的形態(tài)學和消化生理學而展開，而關(guān)于大菱鲆胚胎發(fā)育階段的生長特性的研究未見相關(guān)報道。本試驗在觀察記錄了大菱鲆胚胎發(fā)育時序的基礎(chǔ)上，進一步測定了胚體的長度、油球的直徑和胚體的體質(zhì)量，分析了胚體的生長特性，以期為完善大菱鲆的人工育苗技術(shù)提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

試驗于2014年4月在山東萊州大菱鲆育苗場進行。試驗用雌、雄親魚均取自親魚馴養(yǎng)池，將親魚人工催產(chǎn)后進行受精，將品質(zhì)較好的浮性卵移入孵化網(wǎng)箱進行孵化培育。

1.2方法

1.2.1胚胎發(fā)育的觀察胚胎孵化過程中水溫為（14.4±05） ℃，鹽度為3.1%～3.3%，pH值為7.9～8.3。在不同發(fā)育期連續(xù)采樣，并用奧林巴斯顯微鏡（BX41）觀察胚胎的發(fā)程、記錄發(fā)育特征，直至孵化出膜。

1.2.2胚胎生長的測定每個發(fā)育期隨機取樣70粒受精卵，其中30粒用于測定胚胎的長度和油球的直徑，采用與顯微鏡配套的電子目鏡進行測量；另外40粒受精卵在吸干水分后測定其質(zhì)量，用電子天平進行測量。

2結(jié)果與分析

2.1大菱鲆胚胎發(fā)育時序及形態(tài)特征

由表1可知，受精后2 h 40 min進入卵裂期，9 h 40 min時胚體出現(xiàn)卵黃合胞體；10 h 40 min進入囊胚期；17 h 10 min進入原腸期，36 h原口關(guān)閉前期，胚盤下包80%，體節(jié)、視囊原基、克氏囊出現(xiàn)，39 h 10 min原口關(guān)閉，胚體成型，尾芽形成；47 h 50 min 胚體克氏囊明顯，聽囊出現(xiàn)、色素形成，51 h 30 min胚體色素增多，晶體原基形成，克氏囊開始退化，86 h胚體心跳出現(xiàn)，角膜形成，尾部鰭褶出現(xiàn)；103 h時胚體頭部破膜而出。

2.2大菱鲆胚胎大小變化

大菱鲆胚胎生長過程中，其長度整體呈增長趨勢。但不同發(fā)育期胚體長度經(jīng)歷“縮小—膨大—再縮小—再膨大”的變化過程。由圖1可知，胚體長度從受精卵到卵裂期呈縮小趨勢并在卵裂期達到最低值（1.015±0.121） mm，之后保持膨大趨勢直至囊胚期，囊胚期至原腸期再次出現(xiàn)縮小趨勢并在原腸期時達到（1.044±0.241） mm，之后保持膨大狀態(tài)直至孵化。

2.3大菱鲆胚體油球變化

如圖2所示，油球直徑從受精卵至卵裂期逐漸增加并在卵裂期達到最高點（0.186±0.011） mm，之后逐漸縮短。油球直徑在卵裂期至原腸期間減少的幅度[（0.186±0.011）～表1大菱鲆胚胎發(fā)育過程及主要特征

發(fā)育時期發(fā)育階段受精后時間胚體發(fā)育及主要特征受精卵受精0 h質(zhì)量較好的受精卵無色透明，漂在水面上胚盤出現(xiàn)2 h原生質(zhì)在動物極形成胚盤卵裂期2細胞2 h 40 min胚盤出現(xiàn)2個均等的分裂球4細胞3 h 10 min胚盤出現(xiàn)4個均等的分裂球8細胞3 h 40 min胚盤出現(xiàn)大小不均等的8個分裂球16細胞4 h 40 min胚盤出現(xiàn)16個分裂球，呈雙層分布，里層4個細胞，外層12個細胞32細胞5 h 40 min胚盤出現(xiàn)不均等、不規(guī)則的32個分裂球64細胞6 h 50 min胚盤出現(xiàn)不規(guī)則的64個分裂球，最外側(cè)分裂球界限模糊連成一體128細胞7 h 30 min分裂球增為128個，細胞體積小、不易分辨多細胞9 h 40 min胚盤中細胞數(shù)量越來越多，邊界變得模糊不清，中央部分的細胞連成一體，出現(xiàn)與營養(yǎng)物質(zhì)吸收有關(guān)的卵黃合胞體囊胚期高囊期10 h 40 min動物極的胚盤高度較高，卵黃合胞體層分化為內(nèi)、外兩部分低囊期11 h 50 min胚盤中細胞沿卵黃囊遷移，高度變低原腸期原腸早期17 h 10 min胚盤中分裂細胞沿卵黃遷移，開始下包；邊緣細胞會內(nèi)卷并向上運動，在囊胚層外周形成胚環(huán)。部分分裂細胞流向胚環(huán)的某部并加厚形成胚盾原腸早期24 h胚盤下包1/5，胚盾繼續(xù)加厚，并形成胚體原基原腸中期29 h 30 min胚盤下包1/2；胚盾繼續(xù)延長，胚體形態(tài)明顯原腸中期32 h 10 min胚盤下包3/4；胚體的頭突出現(xiàn)并逐漸增大；表皮、神經(jīng)褶出現(xiàn)原腸中期36 h胚盤下包4/5；胚環(huán)逐漸縮小為胚孔，而未被完全包被的卵黃被稱為原口；體節(jié)、視囊原基、克氏囊出現(xiàn)原腸晚期39 h 10 min胚盤下包完全，原口封閉，胚體成型；脊索原基形成、尾芽形成器官形成期聽囊形成期47 h 50 min胚體克氏囊明顯，聽囊出現(xiàn)、色素形成晶體形成期51 h 30 min胚體色素增多，消化道、晶體原基形成，克氏囊開始退化體節(jié)形成期56 h 50 min胚體克氏囊消失，體節(jié)分節(jié)，肌節(jié)逐步形成肌節(jié)分化期60 h 40 min胚體繞卵黃2/3，背部色素增多，胚胎肌節(jié)分節(jié)明顯，頭部晶體體積增大心臟分化期65 h胚體繞卵黃3/4，心臟進一步發(fā)育并分化鰭褶形成期72 h 30 min胚體繞卵黃4/5，透明的鰭褶在尾部生成并向頭部延伸鰭原基形成期79 h 35 min胚體扭動加快，脈絡膜裂形成，脊索中空化，腹部出現(xiàn)鰭原基心臟跳動期86 h胚體心跳出現(xiàn)，角膜形成，尾部鰭褶出現(xiàn)肌肉效應期95 h 40 min胚體繞卵黃9/10，扭動劇烈，紅色色素明顯增多，尾部出現(xiàn)黑色色素孵化期破膜期103 h胚體劇烈扭動并孵化出膜，仔魚背鰭和臀鰭上出現(xiàn)絨毛狀色素叢，魚體呈深棕色并攜帶卵黃囊

（0.184±0021） mm]小于原腸期至孵化期間減少的幅度[（0.184±0021）～（0.180±0.009） mm]。

結(jié)合圖1和圖2的數(shù)據(jù)，胚體長度與油球直徑的比值在不同發(fā)育期差異較大。比值在卵裂期時最低，為5.46，其后該比值整體呈現(xiàn)升高狀態(tài)并且在器官形成期和孵化期分別達到5.88和5.98，較受精卵時期增幅分別為4.57%和6.26%。

2.4大菱鲆胚胎體質(zhì)量變化

胚體質(zhì)量在卵裂期最低，為（0.509±0073） mg；之后快

速增長并在原腸期達到最高值（0.576±0.068） mg；此后急劇降低，在孵化時胚體質(zhì)量為（0.525±0106） mg，較原腸期降幅為8.85%（圖3）。

3討論

3.1大菱鲆胚胎發(fā)育特征

大菱鲆受精卵呈圓形，浮性卵。不同發(fā)育期歷時時間差異較大，其中卵裂期7 h，囊胚期1 h 10 min，原腸期22 h，器官形成期47 h 50 min，即胚體器官原基形成以及功能強化過程

經(jīng)歷的時間最長，這與其他生物早期發(fā)育過程規(guī)律一致[8-9]。胚體的這種發(fā)育機制為完善機體生理功能、提高胚后階段仔稚魚的成活率提供了保障。

溫度是影響魚類胚胎發(fā)育速度的重要因子，不同溫度條件下胚體出膜的時間差異較大。雷霽霖等研究表明，在 13 ℃ 條件下，大菱鲆胚胎約經(jīng)116 h完成孵化[2]。而本試驗中，水溫為14.4 ℃，胚胎歷時103 h孵化出膜。上述數(shù)據(jù)說明，胚胎發(fā)育跟水溫密切相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，水溫越高，發(fā)育速度越快；水溫越低，發(fā)育速度越慢。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在半滑舌鰨[10]、對蝦[11]、黃鯛[12]、扇貝[13]、烏賊[14]等生物的胚胎發(fā)育過程中。但孵化時水溫也不能過高，水溫過高會降低孵化率[15]。此外，有報道稱，受精卵的分裂速度受細胞質(zhì)影響[16]，由此推測，可能是水溫的變化首先影響到細胞質(zhì)的理化性質(zhì)，進而影響到胚胎的卵裂速度和孵化成功率。另外，大菱鲆胚胎發(fā)育速度不同還可能與試驗對象分布在不同地理環(huán)境導致的種群差異以及胚體內(nèi)DNA含量、卵徑、卵黃成分等方面的差異有關(guān)[17]。

3.2大菱鲆胚胎生長特征

近年來，關(guān)于大菱鲆胚胎發(fā)育的研究已有報道[1-2，18]，但是關(guān)于胚體發(fā)育期胚體生長的研究鮮有報道。本試驗精確測定了胚胎的大小和體質(zhì)量，結(jié)果表明，大菱鲆胚胎生長過程中，胚體長度經(jīng)歷“縮小—膨大—再縮小—再膨大”的變化過程。有研究報道表明，卵膜的收縮和膨脹跟胚體的細胞運動以及器官發(fā)育密切相關(guān)[19]。在本試驗中，胚體大小跟發(fā)育時期密切相關(guān)，在細胞數(shù)量急劇增多的卵裂期和變化劇烈的原腸期，胚體長度均出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象，而在其他時期表現(xiàn)為增大的趨勢，原因可能是在發(fā)育的最后階段，胚體通過吸收大量水分來增加自身體積，進而增大胚體內(nèi)的壓力，以便幫助胚體沖破胚膜，順利孵出。

大菱鲆的卵子屬于端黃卵，有1個油球。油球中營養(yǎng)豐富，含有脂類和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，是大菱鲆胚胎發(fā)育必需的營養(yǎng)和能量來源。不同發(fā)育時期，大菱鲆胚體中油球直徑差異較大，卵裂期之前油球直徑逐漸增大，卵裂期之后逐漸降低。此外，胚體長度與油球直徑的比值也呈現(xiàn)了類似的變化趨勢：該比值在卵裂期時最低，為5.46，其后該比值整體呈現(xiàn)升高狀態(tài)并且在器官形成期和孵化期分別達到5.88和 5.98。卵裂期之后，油球直徑持續(xù)下降的趨勢說明，原腸期和器官形成期，尤其是器官形成期，胚體對油球中脂類和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)的利用比率逐漸增加，這與上述時期細胞活動和組織分化劇烈導致的耗能量增大有關(guān)[20]。

胚胎的體質(zhì)量跟發(fā)育期也聯(lián)系密切，在卵裂期時體質(zhì)量達到最低值，可能是與胚體的迅速生長和旺盛的新長代謝導致的內(nèi)源營養(yǎng)消耗量升高有關(guān)；在原腸期時，胚體質(zhì)量達到最高峰，但原腸期之后，胚體質(zhì)量一直呈下降趨勢直至孵化出膜，具體的原因尚有待于進一步深入研究分析。

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