N—芐氧羰基—氨基酸—霉靈的合成及殺菌活性

陳然++方祖凱++李黎++胡奎++牛俊凡++李俊凱

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.048

摘要：為合成N-芐氧羰基（Cbz）-氨基酸-霉靈，并測定新化合物的室內(nèi)殺菌活性。采用N，N′-環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和[4-（N，N-二甲氨基）吡啶]（DMAP）形成的脫水縮合體系，N-芐氧羰基氨基酸和霉靈發(fā)生縮合反應(yīng)生成13個(gè)新化合物。采用菌絲生長速率法測定各化合物對小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和棉花枯萎病菌（F. oxysporum）的殺菌活性。N-芐氧羰基-丙氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-脯氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-苯丙氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-甲硫氨酸-霉靈對小麥赤霉病菌的抑制中濃度（EC50）分別為0.264、0.212、0.225、0.205 mmol/L，低于對照藥劑霉靈的抑制中濃度（0.338 mmol/L）；N-芐氧羰基-脯氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-苯丙氨酸-霉靈、N-芐氧羰基-甲硫氨酸-霉靈對棉花枯萎病菌的抑制中濃度分別為0.234、0.277、0.289 mmol/L，低于對照藥劑霉靈的抑制中濃度（0.479 mmol/L）。合成的衍生物均保持了霉靈的生物活性，具有雜環(huán)、苯環(huán)或雜原子的氨基酸結(jié)構(gòu)能夠增加衍生物的活性。

關(guān)鍵詞：N-芐氧羰基-氨基酸-霉靈；合成；殺菌活性；小麥赤霉??；棉花枯萎病

中圖分類號： S482.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0185-04

收稿日期：2015-09-10

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：30971948；31371976）。

作者簡介：陳然（1990―），男，湖北洪湖人，碩士。E-mail：changdachenran@163.com。

通信作者：李俊凱，博士，教授，主要從事新農(nóng)藥開發(fā)與農(nóng)藥環(huán)境毒理研究。E-mail：junkaili@sina.com。霉靈（hymexazol）是一種內(nèi)吸性殺菌劑和植物生長調(diào)節(jié)劑[1]，主要用作拌種、拌土或隨水灌溉。霉靈在植物體內(nèi)經(jīng)代謝可產(chǎn)生2種糖苷，被植物吸收后可提高作物的生理活性，如促進(jìn)植株生長、根分蘗、根毛增加、提高根的活性。在土壤中，霉靈可降解成毒性很低、對土壤中的微生物生態(tài)無影響、對環(huán)境安全的化合物[2-4]。

氨基酸類農(nóng)藥可以作為除草劑[5]、殺蟲劑[6]、殺菌劑[7]和植物生長調(diào)節(jié)劑[8]。由于氨基酸類農(nóng)藥化學(xué)結(jié)構(gòu)選用了自然界本身存在的氨基酸結(jié)構(gòu)，并且自然界存在著相應(yīng)的可分解它們的微生物群，因此這類農(nóng)藥容易被分解而不易造成殘留污染[9]，而且降解后的氨基酸還能作為植物生長營養(yǎng)劑，對農(nóng)作物有較好的增產(chǎn)效果[10]。氨基酸酯類農(nóng)藥是氨基酸類農(nóng)藥之一。Boesenberg等報(bào)道了一些分子結(jié)構(gòu)中含鹵代芳環(huán)且具有除草活性的氨基酸酯類衍生物，如N-酰基氨基酸酯、苯并唑基氨基酸酯、苯并噻唑基氨基酸酯等[11]。Chen等合成了一系列含氮芥、磷、硫及苯環(huán)的氨基酸酯類衍生物，發(fā)現(xiàn)其具有良好的除草和殺菌活性[12]。

研究表明，將活性農(nóng)藥分子與氨基酸進(jìn)行耦合，不僅可以得到具有一定活性的新化合物，而且還可以大大改善農(nóng)藥的傳導(dǎo)性[13]?；诎被犷愞r(nóng)藥的優(yōu)點(diǎn)以及霉靈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，筆者將霉靈和不同種類的氨基酸進(jìn)行拼接，合成一系列未見文獻(xiàn)報(bào)道的N-芐氧羰基-氨基酸-霉靈，以期為提高霉靈的殺菌活性，并擴(kuò)大霉靈的殺菌譜提供理論指導(dǎo)?；衔锖铣陕肪€見圖1。

1材料與方法

1.1供試材料

小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）；棉花枯萎病菌（F. oxysporum），均由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院病理研究室提供。

97%霉靈原藥，淄博德樽貿(mào)易有限公司；95%氯甲酸芐酯（Cbz-Cl）、N，N′-環(huán)己基碳二亞胺、4-（N，N-二甲氨基）吡啶等試劑為市售分析純；L-甘氨酸（Gly）、L-丙氨酸（Ala）、L-纈氨酸（Val）、L-亮氨酸（Leu）、L-異亮氨酸（Ile）、L-脯氨酸（Pro）、L-苯丙氨酸（Phe）、L-色氨酸（Trp）、L-甲硫氨酸（Met）、L-蘇氨酸（Thr）、L-絲氨酸（Ser）、L-酪氨酸（Tyr）、L-組氨酸（His）等氨基酸為市售生化試劑。

LABOROTA4003型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國）、Bruker600型核磁共振儀（德國）、WRR熔點(diǎn)測定儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、EA3000元素分析儀（意大利利曼有限公司）、ZF-2型三用紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠）、85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）、SPX-80-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2化合物的合成

1.2.1N-Cbz-氨基酸的合成通法[14] 稱取0.05 mol氨基酸和0.05 mol（5.3 g）無水碳酸鈉于250 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水溶解。冷卻至-5 ℃，緩慢滴入0.06 mol（10235 g）氯甲酸芐酯，滴加完畢后緩慢升溫至室溫，反應(yīng) 5 h。反應(yīng)體系用乙醚洗滌（60 mL），棄乙醚層；水相用 6 mol/L 的鹽酸調(diào)pH值至1，然后用乙酸乙酯萃取（90 mL），飽和氯化鈉水溶液洗滌（40 mL）有機(jī)相至中性，加入無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得粗品。用乙醚 ∶甲苯（1 ∶1）溶解粗品，石油醚重結(jié)晶得目標(biāo)產(chǎn)物Ⅰa-m。

1.2.2N-Cbz-氨基酸-霉靈的合成通法參考文獻(xiàn)[15-17]方法。稱取0.03 mol N-芐氧羰基-氨基酸（Ⅰ）于150 mL圓底燒瓶中，加入50 mL乙腈，待完全溶解后，分別加入0035 mol（3.470 g）霉靈和0.35 g 4-（N，N-二甲氨基）吡啶，充分溶解后冷卻至-5 ℃。稱取0.035 mol（7.222 g）N，N′-環(huán)己基碳二亞胺于燒杯中，加入50 mL乙腈溶解，冰浴條件下緩慢滴入上述燒瓶中，冰浴下攪拌1 h后緩慢升溫至室溫，薄層色譜，跟蹤至反應(yīng)結(jié)束。過濾、濃縮，柱層析純化得目標(biāo)產(chǎn)物Ⅱa-m。

1.3殺菌活性測定

采用菌絲生長速率抑制法[18]，以霉靈為對照藥劑，測定目標(biāo)化合物對小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌的室內(nèi)殺菌活性。將供試藥液配制成0.1～1.6 mmol/L之間的梯度濃度，設(shè)3次平行試驗(yàn)。小麥赤霉病菌培養(yǎng)54 h、棉花枯萎病菌培養(yǎng)70 h后，采用十字交叉法測定各藥劑處理和空白對照的菌落直徑，取平均值后，按公式（1）計(jì)算各藥劑對病原菌的生長抑制率，將菌絲生長抑制率換算成抑制概率值Y，藥劑濃度換算成濃度對數(shù)X。按濃度對數(shù)與概率值回歸法求得不同化合物對小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌的毒力公式y(tǒng)=a+bx，并由毒力公式計(jì)算各藥劑抑制中濃度（EC50）。

抑制生長率=空白對照組菌落直徑-藥劑處理組菌落直徑空白對照組菌落直徑-打孔器內(nèi)徑×100%。（1）

2結(jié)果與分析

2.1結(jié)構(gòu)鑒定

化合物的理化性質(zhì)和元素分析數(shù)據(jù)見表1，核磁共振氫譜數(shù)據(jù)見表2。

2.2殺菌活性

從表3可知，目標(biāo)化合物對這2種供試病原菌均有很好的活性，部分化合物與霉靈的活性相近。不同的氨基酸結(jié)構(gòu)對衍生物的活性影響有差異，其中，氯甲酸芐酯保護(hù)的丙氨酸（Ⅱb）、脯氨酸（Ⅱf）、苯丙氨酸（Ⅱg）和甲硫氨酸（Ⅱi）與霉靈的耦合物，對小麥赤霉病菌的活性均顯著高于霉靈本身；氯甲酸芐酯保護(hù)的脯氨酸（Ⅱf）、苯丙氨酸（Ⅱg）和甲硫氨酸（Ⅱi）與霉靈的耦合物對棉花枯萎病菌的活性均高于霉靈。

3結(jié)論與討論

本研究以霉靈和氨基酸為原料，采用N，N′-環(huán)己基碳二亞胺脫水縮合衍生合成的方法，合成了13個(gè)未見報(bào)道的 N-芐氧羰基-氨基酸-霉靈，所有化合物的結(jié)構(gòu)均通過核磁共振氫譜和元素分析的確認(rèn)，該反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物純化處理簡單。初步的生物活性測定結(jié)果表明，目標(biāo)化合物不僅保留了霉靈原有的殺菌活性，而且接入不同氨基酸的結(jié)構(gòu)對衍生物活性影響存在差異，其中含雜環(huán)、苯環(huán)或雜原子的脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸的衍生物活性優(yōu)于其他氨基酸衍生物。氨基酸是自然界的重要物質(zhì)，具有重要的生理功能[19]，其本身具有殺蟲、殺菌和促進(jìn)植物生長的作用[20-21]。另外，在細(xì)胞膜上存在大量氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[22]，這些載體協(xié)助氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，并能增加氨基酸在生物體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)。農(nóng)藥分子與氨基酸基團(tuán)耦合后，如果沒有屏蔽氨基酸與其載體的結(jié)合部位，在一定程度上仍然可以與其載體結(jié)合，從而增加生物體對耦合物的吸收，并有可能改善耦合物在生物體內(nèi)的傳導(dǎo)，從而提高耦合物的殺菌活性。

Xu等將谷氨酸與拌種靈耦合后，施用于煙草植株的中部葉片，在植株頂端和根部都檢測到了該衍生物，且在植株頂端有一定的積累性，說明拌種靈與谷氨酸耦合后傳導(dǎo)性得到了改善[23]。本試驗(yàn)合成的霉靈-氨基酸衍生物在植物體內(nèi)是否具有類似的傳導(dǎo)性，以及傳導(dǎo)性與氨基酸種類之間是否具有相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

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