海濱錦葵耐鹽基因KvSOS1的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

王紅艷++王鴻磊

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.017

摘要：為了克隆鹽生植物海濱錦葵耐鹽基因KvSOS1并構(gòu)建其表達(dá)載體，采用RT-PCR和RACE方法從海濱錦葵中克隆了質(zhì)膜Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因KvSOS1（GenBank登錄號KJ577576）的全長cDNA序列，長度為3 850 bp，其中開放閱讀框長度為3 444 bp。KvSOS1基因編碼1個由1 147個氨基酸殘基組成的蛋白，分子量為127.56 ku，理論等電點(diǎn)pI為6.18。疏水性分析結(jié)果表明，該蛋白N-末端具有高度疏水性，并含有11個跨膜區(qū)，C-末端為1個長約700個氨基酸殘基的親水性尾巴位于細(xì)胞質(zhì)中。KvSOS1基因編碼蛋白與雷蒙德氏棉、可可和陸地棉SOS1蛋白的氨基酸序列同源性很高，分別為86%、82%和82%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示KvSOS1基因編碼蛋白與質(zhì)膜Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NHX）屬于不同分支。同時將KvSOS1基因構(gòu)建入植物表達(dá)載體pBI121中，并成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。

關(guān)鍵詞：海濱錦葵；耐鹽基因；質(zhì)膜Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；表達(dá)載體

中圖分類號： Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0076-04

收稿日期：2015-08-14

基金項(xiàng)目：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院校級項(xiàng)目（編號：YT201204）；國家自然科學(xué)基金（編號：41171216）。

作者簡介：王紅艷（1980—），女，河南安陽人，碩士，助理研究員，主要從事植物逆境生理及分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：why1980221@163.com。

通信作者：王鴻磊，碩士，副教授，主要從事生化與分子生物學(xué)方面的研究。E-mial：whl197749@163.com。鹽脅迫是嚴(yán)重影響植物生長發(fā)育的主要非生物環(huán)境脅迫因素之一。土壤中Na+過高會擾亂植物正常的生理代謝活動，造成植物體內(nèi)水分虧缺、離子平衡破壞，并引起氧化傷害等次生脅迫，從而導(dǎo)致植物生長受到抑制，甚至死亡[1-2]。植物抵御鹽脅迫的有效策略在于降低細(xì)胞質(zhì)中Na+的含量，包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的區(qū)隔化[3-5]。目前，關(guān)于Na+的吸收機(jī)制尚不清楚，而Na+的外排和區(qū)隔化分別由位于細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來調(diào)節(jié)。質(zhì)膜型Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SOS1）利用質(zhì)膜上的P型 H+-ATPase建立的跨膜質(zhì)子梯度作為驅(qū)動力，將胞內(nèi)過量的Na+運(yùn)出細(xì)胞以消除Na+的毒害，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種介導(dǎo)Na+外排的質(zhì)膜整合蛋白，在植物抵御鹽脅迫過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。

近年來，質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SOS1）在植物耐鹽性中的作用受到廣泛重視，許多植物的SOS1基因已被克隆和鑒定，包括甜土植物擬南芥、水稻、小麥、黃瓜等及鹽生植物鹽芥、鹽地堿蓬、獐茅等[7-13]。這些研究表明，鹽脅迫下SOS1能夠?qū)a+從根表皮及皮層細(xì)胞中排出胞外，降低Na+的積累。突變體功能互補(bǔ)試驗(yàn)和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽生理分析證實(shí)，SOS1可以恢復(fù)和提高轉(zhuǎn)化體的耐鹽能力[14-19]。由此可見，SOS1基因可用于植物耐鹽基因工程進(jìn)行作物遺傳改良，是具有重要應(yīng)用價值的耐鹽基因之一。

鹽生植物是生存于天然高鹽環(huán)境的植物群體，在長期的進(jìn)化過程中形成了有效的鹽脅迫應(yīng)答機(jī)制或調(diào)控途徑，是獲得耐鹽基因的好材料。因此，從鹽生植物中獲得SOS1等耐鹽基因并深入研究其鹽響應(yīng)調(diào)控機(jī)制，對進(jìn)一步了解植物耐鹽機(jī)制，獲得優(yōu)質(zhì)耐鹽基因意義重大。海濱錦葵（Kosteletzkya virginica L.）是分布于美國含鹽沼澤地帶的多年生鹽生植物，生長基質(zhì)的含鹽量高達(dá)2.5%，是一種優(yōu)良的耐鹽經(jīng)濟(jì)作物和種質(zhì)資源[20]。目前對海濱錦葵耐鹽性的研究主要集中在鹽脅迫對種子萌發(fā)和幼苗生長過程的生理特性變化方面，而對其耐鹽基因方面的研究很少[21]。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆海濱錦葵KvSOS1基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和構(gòu)建植物表達(dá)載體，為該基因的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料海濱錦葵種子，采自中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所山東省東營市試驗(yàn)基地。

1.1.2菌株及質(zhì)粒載體大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌LBA4404及表達(dá)載體質(zhì)粒pBI121為筆者實(shí)驗(yàn)室保存；基因克隆載體pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 購自TransGen公司。

1.1.3主要試劑RNA提取試劑RNAiso Plus 購自TaKaRa公司；RACE試劑盒購自Clontech公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo Scientific 公司；T4 DNA連接酶購自Promega公司；PCR mix、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒和抗生素購自TransGen公司。引物合成和測序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1海濱錦葵幼苗培養(yǎng)及處理將海濱錦葵種子浸種、催芽后播種在含有干凈河沙的營養(yǎng)缽中，1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌，放入人工氣候箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。待海濱錦葵長出4片真葉時，用含有200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland營養(yǎng)液處理24 h，剪取幼苗根部用來提取總RNA。

1.2.2海濱錦葵總RNA的提取及第一鏈cDNA合成海濱錦葵總RNA的提取按照RNAiso Plus 說明書進(jìn)行。用超微量分光光度計NanoDrop-2000c檢測所提總RNA的濃度和質(zhì)量。以海濱錦葵總RNA為模板，按照TransGen公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 合成cDNA第一鏈。

1.2.3海濱錦葵KvSOS1基因全長cDNA的克隆利用GenBank上公布的陸地棉、可可、毛果楊、蓖麻等植物的SOS1基因的同源保守序列，設(shè)計1對簡并引物DP-F：5′-GG（A/G）GAATCCTT（A/G）ATGAA（C/T）GATGGG AC-3′，DP-R：5′-AC（T/C）A（G/A/T）AGC（G/A）CTTTCCTGCCA（C/T） AG-3′，以海濱錦葵cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增得到的目的片斷回收純化后與pEASY-Blunt Zero Cloning Vector連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取陽性菌落測序。對測序結(jié)果進(jìn)行Blast在線分析，確認(rèn)為SOS1基因的同源區(qū)段后，參照Clontech 公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification 試劑盒的操作方法，分別設(shè)計3′-RACE引物和5′-RACE引物，進(jìn)行海濱錦葵KvSOS1基因3′和5′末端的擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的5′-RACE和3′-RACE片段分別進(jìn)行克隆、測序后，與上述獲得的中間片段用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，從而得到海濱錦葵KvSOS1基因的cDNA全長序列。

1.2.4海濱錦葵KvSOS1基因的生物信息學(xué)分析對海濱錦葵KvSOS1基因的cDNA全長序列用NCBI的ORF Finder識別開放閱讀框并翻譯成氨基酸序列；利用ExPAsy服務(wù)器上的ProtParam工具 （http：//web.expasy.org/protparam/）分析基因編碼蛋白的基本性質(zhì)；利用在線工具 Conserved Domain Search Service（http：//www.ncbi.nlm.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析基因編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；利用在線工具TMPRED （http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_ form .html） 進(jìn)行基因編碼蛋白的跨膜預(yù)測和疏水性分析；利用在線Blast程序?qū)蚝塑账嵝蛄羞M(jìn)行同源性分析，多序列比對分析采用ClustalX 2.1軟件；利用 MEGA 4.0 軟件中的 Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5海濱錦葵SOS1基因表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定根據(jù)獲得的海濱錦葵KvSOS1基因的cDNA序列及表達(dá)載體pBI121上的限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計包含完整編碼框并含有酶切位點(diǎn)的引物，以海濱錦葵總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶進(jìn)行回收純化后連接pEASY-Blunt Zero Cloning Vector。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。經(jīng)測序驗(yàn)證后的陽性克隆放大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，通過雙酶切獲得帶有黏性末端的KvSOS1全長cDNA序列。然后與經(jīng)過相同雙酶切的植物表達(dá)載體pBI121采用T4連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆并進(jìn)行菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證，最終獲得含有重組表達(dá)載體pBI121-SOS1的陽性克隆。隨后將該陽性克隆放大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，采用凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在含有鏈霉素和利福平的YEB平板上篩選陽性克隆并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，對菌液PCR鑒定為陽性的克隆即可用于遺傳轉(zhuǎn)化。

2結(jié)果與分析

2.1海濱錦葵KvSOS1基因全長cDNA序列的獲得

使用簡并引物DP-F和DP-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得約1 900 bp的cDNA中間片段。將該片段進(jìn)行回收、克隆并測序，所獲得的核酸序列經(jīng)Blast比對證實(shí)該片段與GenBank數(shù)據(jù)庫已知的SOS1基因同源序列具有較高的同源性。根據(jù)此片段序列設(shè)計特異性引物3′-GSP（5′-GTGCATCCAACTTTTAGTCATGGGAG-3 ′）和5′-GSP（5′-GCTATCC CAAAAGCA ATTCCAACCGC-3′），利用RACE技術(shù)獲得了海濱錦葵KvSOS1基因的3′末端和5′末端cDNA片段，分別進(jìn)行回收、克隆、測序得到3′端和5′端片段的長度分別為1 375 bp和809 bp。將上述3個核苷酸序列拼接后，獲得了海濱錦葵KvSOS1的全長cDNA序列，其長度為3 850 bp，5′端和3′端分別存在93 bp和313 bp的非翻譯區(qū)，開放閱讀框長度為 3 444 bp。將該基因命名為KvSOS1，GenBank中登錄號為KJ577576。

2.2海濱錦葵KvSOS1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

海濱錦葵KvSOS1基因的開放閱讀框編碼1個由1 147個氨基酸殘基組成的蛋白，分子量為127.56 ku，理論等電點(diǎn)pI為6.18。利用NCBI的保守區(qū)搜索工具在線分析KvSOS1編碼的氨基酸序列，其N-末端具有NhaP、Na+/H+Exchanger、b_cpa1等保守結(jié)構(gòu)域，C-末端有cNMP 、Crp等保守結(jié)構(gòu)域，表明該基因?qū)儆贜a+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員（圖1）。用TMPRED軟件進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測和疏水性分析表明，該蛋白N-末端具有高度疏水性，并含有11個跨膜區(qū)，C-末端為1個長約700個氨基酸殘基的親水性尾巴位于細(xì)胞質(zhì)中（圖2）。

同源性Blast比對結(jié)果表明，海濱錦葵KvSOS1編碼蛋白與多個物種編碼SOS1蛋白的氨基酸序列具高度同源性。如表1所示，同源性最高的是雷蒙德氏棉，同源性高達(dá)86%，與可可和陸地棉的同源性均為82%，與毛果楊、蓖麻、胡楊的同源性分別為74%、73%、72%。將以上植物的SOS1蛋白與海濱錦葵KvSOS1編碼蛋白進(jìn)行多重序列比對發(fā)現(xiàn)，不同植物SOS1的N端跨膜區(qū)保守度較高，而C端相對較低。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示KvSOS1編碼蛋白與其他植物的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SOS1）同屬于一個系統(tǒng)發(fā)育支，而與液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NHX）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。結(jié)果表明KvSOS1是編碼質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。

2.3海濱錦葵KvSOS1基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

通過對海濱錦葵KvSOS1基因的序列及表達(dá)載體pBI121上的限制性酶切位點(diǎn)分析，利用Primer 5.0、DNA Club等軟件設(shè)計了包含完整編碼框并含有酶切位點(diǎn)的1對引物：KvSOS1-F，5′-TCTAGAATGGAGGAACTGAAGGAGAATC-3′；KvSOS1-R，5′-GTCGACTCAAGAAGCTTGGTTGAATGAT-3′（劃線部分TCTAGA為XbaⅠ的酶切位點(diǎn)，GTCGAC為SalⅠ的酶切位點(diǎn)）。利用此對引物以海濱錦葵總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板擴(kuò)增KvSOS1基因的編碼區(qū)（圖4）。將目的條帶進(jìn)行回收、純化、克隆，挑選陽性克隆測序后與之前獲得的全長cDNA序列進(jìn)行比對，確定為目的基因KvSOS1。將該陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ和SalⅠ雙酶切消化處理后，獲得帶有雙酶切位點(diǎn)的目的片段，與經(jīng)過同樣雙酶切的植物表達(dá)載體pBI121采用T4連接酶進(jìn)行連接（圖5）。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆菌液PCR檢測表明陽性克隆中含有3.4 kb目的片段（圖6），然后將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒pBI121-KvSOS1進(jìn)行Xba Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切，結(jié)果顯示該質(zhì)粒上含有3.4 kb目的片段（圖7）。這表明海濱錦葵KvSOS1基因已成功構(gòu)建入植物表達(dá)載體pBI121中。

2.4重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404

采用凍融法將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pBI121-SOS1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在含有鏈霉素和利福平的YEB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。隨機(jī)挑取陽性克隆，以基因序列特異引物進(jìn)行菌液PCR檢測，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為 3.4 kb（圖8），證明植物重組表達(dá)載體 pBI121-SOS1已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，此農(nóng)桿菌可用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化。

3討論

在植物抵御鹽脅迫的過程中，質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅參與植物根部的Na+外排，在維持細(xì)胞K+的穩(wěn)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值和Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)以及植物體內(nèi)Na+的長距離運(yùn)輸中也起著重要作用，對其進(jìn)行深入系統(tǒng)地研究意義重大[22-23]。目前，對鹽脅迫條件下擬南芥中的SOS（Salt Overly Sensitive）信號通路研究得比較清楚[24-25]，在水稻和鹽芥中也發(fā)現(xiàn)了相似的SOS途徑[26]。在SOS途徑中，SOS1需經(jīng)SOS2/SOS3蛋白激酶復(fù)合體磷酸化而激活其離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，它是至今發(fā)現(xiàn)的唯一能把Na+從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外的膜運(yùn)輸?shù)鞍?，與植物耐鹽性關(guān)系密切。大量研究證實(shí)，鹽脅迫可激活SOS1并誘導(dǎo)其基因上調(diào)表達(dá)，例如擬南芥、水稻、小麥、星星草、胡楊的SOS1基因均可被鹽脅迫誘導(dǎo)，上調(diào)它們的表達(dá)量。過量表達(dá)擬南芥、水稻、胡楊等的SOS1基因可提高轉(zhuǎn)化植物的耐鹽能力[15-19]。目前，已報道的不同植物中SOS1的結(jié)構(gòu)同源性非常高，特別是N-末端的10～12個跨膜結(jié)構(gòu)域非常相似，而C-末端的差異相對較大，這可能是不同植物中SOS1離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性響應(yīng)逆境脅迫的差異所在。Takahashi等發(fā)現(xiàn)來源于耐鹽基因型蘆葦SOS1比鹽敏感基因型蘆葦SOS1能夠更有效地將Na+排出細(xì)胞，更大程度地提高轉(zhuǎn)基因酵母的耐鹽能力[27]。因此，從鹽生植物中發(fā)掘SOS1基因并對其進(jìn)行深入研究對于獲得優(yōu)良耐鹽基因資源和耐鹽基因工程具有重要的應(yīng)用價值。海濱錦葵是一種具有多種經(jīng)濟(jì)價值的鹽生植物，在長期適應(yīng)環(huán)境的過程中，可能進(jìn)化出獨(dú)特的離子調(diào)控機(jī)制，從中克隆質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等耐鹽基因并深入研究其結(jié)構(gòu)功能，對發(fā)揮其在鹽土農(nóng)業(yè)及耐鹽工程育種等方面的作用具有重要意義。

4結(jié)論

本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)從海濱錦葵中首次克隆出該植物質(zhì)膜Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全長cDNA序列，命名為KvSOS1，GenBank登錄號為KJ577576，全長為 3 850 bp，開放閱讀框長度為3 444 bp。生物信息學(xué)分析表明該基因?qū)儆谫|(zhì)膜Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族。同時，已將海濱錦葵KvSOS1基因構(gòu)建入植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBI121中，并成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。這為后續(xù)研究中將該基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥以研究其功能以及耐鹽基因工程育種等方面奠定了重要的基礎(chǔ)。

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