超臨界溶液浸漬法制備載藥多孔微球用于肺部吸入式給藥

唐 川

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

藥物療效的發(fā)揮，不僅依賴于藥物的成分及藥物的含量，同時(shí)也受到給藥系統(tǒng)的影響[1]。傳統(tǒng)的給藥途徑如口服給藥，胃酸會(huì)破壞大部分蛋白質(zhì)或多肽類藥物的結(jié)構(gòu)；而靜脈注射給藥則是一種侵入式給藥途徑，病人順應(yīng)性低。肺部由于比表面積大、毛細(xì)血管豐富等特點(diǎn)，成為理想的給藥部位，肺部吸入式給藥也成為給藥途徑研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。已有的研究表明，蛋白質(zhì)藥物經(jīng)肺部給藥，藥效發(fā)揮迅速且藥代動(dòng)力學(xué)可重復(fù)性好[2]。但肺部吸入式給藥也有一定的局限，比如要求顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑在一定范圍內(nèi)（1～5 μm），否則不能進(jìn)入肺部達(dá)到給藥效果。實(shí)心藥物顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑基本和幾何粒徑相同，1～5 μm的實(shí)心顆粒雖然可以到達(dá)肺部深處，但會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬（巨噬細(xì)胞可吞噬大約1～5 μm幾何粒徑的顆粒），因此只有顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑在 1～5 μm之間，而幾何粒徑不在1～5 μm之間才能滿足肺部吸入式給藥要求。多孔微球由于其密度較同材料實(shí)心微球小，因此其空氣動(dòng)力學(xué)粒徑與實(shí)心微球不相同，采用多孔微球作為藥物載體可實(shí)現(xiàn)肺部給藥，并且避免被巨噬細(xì)胞吞噬。但如何在保證藥物活性的同時(shí)，將藥物負(fù)載到多孔微球中，制備粒徑滿足肺部吸入式給藥要求的微粒是亟待解決的問題。

超臨界溶液浸漬法(supercritical solution impregnation, SSI)是一種將小分子物質(zhì)負(fù)載到聚合物中的過程技術(shù)，主要是利用超臨界流體高擴(kuò)散系數(shù)、低黏度及其對(duì)聚合物的溶脹作用[3]。自1986年Sand[4]使用超臨界溶液浸漬(supercritical solution impregnation, SSI)制備得到含藥物成分的聚合物以來，SSI被認(rèn)為在藥物制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。SSI過程制備藥物具有如下幾種顯著優(yōu)勢(shì)：（1）操作條件溫和；（2）產(chǎn)品有機(jī)溶劑殘留量低；（3）藥物在基質(zhì)中均勻分布，可有效避免釋藥過程中的突釋現(xiàn)象，可達(dá)到緩控釋給藥的目的[5,6]；（4）基質(zhì)制備過程與藥物負(fù)載過程分開進(jìn)行，載體多樣，不受載藥過程制約[7]。

本文以生物相容性材料聚乳酸（PLLA）為材料制成多孔微球，以地塞米松為模型藥物，采用 SSI法將藥物負(fù)載至多孔微球中制備載藥多孔微球。考察載藥多孔微球的載藥量、形貌、空氣動(dòng)力學(xué)粒徑以及釋放行為等，探索載藥聚乳酸多孔微球在肺部吸入式給藥中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

左旋聚乳酸（PLLA），分子量 11 kDa；二氧化碳，純度99.9%；地塞米松，純度大于98%；泊洛沙姆F-127，純度大于98%；聚乙烯醇，AH-26；無水乙醇、二氯甲烷，分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見分光光度計(jì)，型號(hào)Ultraspec 3320 pro；動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀，型號(hào) APS-3321；高速分散器，型號(hào) XHF-D；恒溫水浴槽，型號(hào) DF-101S；真空干燥箱，型號(hào)DZF-6050；循環(huán)水式真空泵，型號(hào)SHB。

1.3 PLLA多孔微球的制備

本研究使用泊洛沙姆作為多孔微球的致孔劑，采用乳液-溶劑揮發(fā)法制備PLLA多孔微球。實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）將泊洛沙姆與PLLA溶于二氯甲烷中形成泊洛沙姆與PLLA質(zhì)量比為3:7，總聚合物濃度為3%的溶液。（2）將配制好的聚合物溶液加入到濃度為1%的聚乙烯醇水溶液中，使用高速分散器在 3000 rpm下分散3 min，形成均一乳液。（3）乳液置于30℃恒溫水浴槽中，200 rpm條件下攪拌5 h以揮發(fā)除去二氯甲烷。（4）待PLLA 多孔微球固化后，8000 rpm離心5 min收集得到PLLA多孔微球，并用去離子水清洗三次，以除去多孔微球表面的聚乙烯醇，干燥得到PLLA多孔微球。

1.4 載藥PLLA多孔微球的制備

采用超臨界流體裝置，通過SSI將地塞米松負(fù)載于PLLA多孔微球，實(shí)驗(yàn)裝置及流程如圖1所示[8]。具體流程如下：在高壓釜的頂部放置并固定盛放有PLLA多孔微球的濾紙，在高壓釜的底部放置盛有過量地塞米松的濾紙。地塞米松與PLLA多孔微球分開放置，避免兩者的直接接觸和混合。啟動(dòng)設(shè)備，CO2經(jīng)鋼瓶流出，冷卻成為液體，經(jīng)高壓泵加壓后在40℃進(jìn)行預(yù)熱后進(jìn)入高壓釜，設(shè)定攪拌器轉(zhuǎn)速 60 rpm，高壓釜內(nèi)壓力15 MPa、溫度40 ℃，并保持一段時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后關(guān)閉鋼瓶、高壓泵，打開泄壓閥卸去高壓，得到載藥PLLA多孔微球，保存供后續(xù)檢測(cè)。

圖1 超臨界溶液浸漬法實(shí)驗(yàn)流程圖

1.5 PLLA 多孔微球載藥量測(cè)定

采用紫外分光光度計(jì)對(duì)載藥多孔微球載藥量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱取25 mg PLLA載藥多孔微球樣品，加入2.5 mL二氯甲烷將樣品完全溶解；揮發(fā)除去二氯甲烷，再加入2.5 mL無水乙醇萃取出樣品中的藥物；8000 rpm離心5 min，上清液在240 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)地塞米松標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到地塞米松質(zhì)量，根據(jù)式1計(jì)算得到樣品的載藥量（DLC)，即藥物質(zhì)量與聚合物質(zhì)量之比。

1.6 載藥 PLLA 多孔微球的表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察載藥多孔微球形貌。取少量樣品使用導(dǎo)電膠將其固定置于銅臺(tái)上，將多余的未被固定的樣品除去，真空下噴金1 min，然后在SEM下對(duì)樣品的形貌進(jìn)行觀察并拍攝圖片。利用Image-pro plus軟件對(duì)樣品的掃描電子顯微鏡圖片進(jìn)行分析，獲得微球的平均粒徑。

使用空氣動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀測(cè)定 PLLA多孔微球的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑?？諝鈩?dòng)力學(xué)粒徑譜儀可測(cè)定空氣動(dòng)力學(xué)直徑為0.5～20 μm之間的顆粒。實(shí)驗(yàn)設(shè)定進(jìn)氣量5 L/min，分別測(cè)定空白多孔微球和浸漬后多孔微球空氣動(dòng)力學(xué)粒徑，并定義可吸入比為空氣動(dòng)力學(xué)直徑在1～5 μm之間的顆粒。

1.7 載藥多孔微球的體外釋放行為

載藥多孔微球的釋放行為通過體外釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。37℃條件下，稱取約25 mg載藥多孔微球樣品置于離心管中，加入4 mL 磷酸緩沖液（0.05 M，pH7.4），在一定的時(shí)間間隔進(jìn)行取樣。取樣時(shí)，5000 rpm離心 5 min，取上清液2 mL，同時(shí)補(bǔ)加磷酸緩沖液2 mL，分散后繼續(xù)進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)，樣品在240 nm處測(cè)量吸光度。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線可得地塞米松質(zhì)量，計(jì)算得到載藥PLLA多孔微球在體外的釋放曲線。

2 結(jié)果與討論

肺部吸入式給藥系統(tǒng)不僅要求藥物微?？諝鈩?dòng)力學(xué)粒徑處于1～5 μm之間，而幾何粒徑不處于1～5 μm之間，同時(shí)還要求多孔微粒具有一定載藥量，并能夠以一定速率釋放藥物，因此本文對(duì)載藥多孔微球的載藥量、形貌、空氣動(dòng)力學(xué)粒徑、釋放行為進(jìn)行了研究。

2.1 浸漬時(shí)間對(duì)載藥量的影響

SSI過程中浸漬時(shí)間對(duì)多孔微球載藥量影響如圖2所示。由圖中可以看出，隨著浸漬時(shí)間的增加，載藥量逐漸增加，并在1 h后趨于平衡，1 h后多孔微球載藥量變化不大。SSI過程主要包括三個(gè)階段：藥物在超臨界CO2中的溶解；藥物在聚合物中的擴(kuò)散；藥物在超臨界CO2中和聚合物中的分配。這三個(gè)階段中，超臨界CO2環(huán)境下藥物在聚合物基質(zhì)中的擴(kuò)散最慢，因此是SSI過程的限速步驟。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下（40℃，15 MPa）達(dá)到平衡載藥量的時(shí)間為1 h，為保證CO2，聚合物和藥物能達(dá)到分配平衡，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中浸漬時(shí)間均定為2 h。

圖2 SSI過程中浸漬時(shí)間對(duì)載藥多孔微球載藥量的影響

2.2 載藥多孔微球的載藥量

通過乳液-溶劑揮發(fā)法制備的PLLA多孔微球，在用SSI法進(jìn)行藥物負(fù)載后（40℃，15 MPa，浸漬時(shí)間2 h），得到載藥PLLA多孔微球，通過載藥量測(cè)定，得出載藥量為1.0 mg/g。這說明藥物可以通過SSI方法負(fù)載到聚合物中，這為藥物+載體形式的藥物制劑提供了一種綠色化的制備方法。

2.3 載藥 PLLA 多孔微球的表征

2.3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）結(jié)果分析

PLLA多孔微球的SEM圖片在SSI過程負(fù)載藥物前后如圖3所示，其中圖 3（a）表示采用泊洛沙姆作為致孔劑，使用乳液-溶劑揮發(fā)法制備的空白PLLA多孔微球，可以看到大部分PLLA微粒呈球形，表面存在孔洞；圖3（b）為利用SSI過程在40℃，15 MPa條件下浸漬2 h負(fù)載藥物后的載藥PLLA多孔微球，可以看出經(jīng)過SSI過程處理之后，微球粒徑變小，表面孔洞部分消失。這是因?yàn)樵贑O2環(huán)境中，PLLA玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）大幅下降，聚合物表面出現(xiàn)部分軟化現(xiàn)象，使得多孔微球表面的孔洞融合，微球由于塌縮粒徑變小。這種表面孔洞消失的現(xiàn)象對(duì)于多孔微球在緩控釋給藥方面的應(yīng)用是非常有利的，表面孔洞的小時(shí)可以有效避免多孔微球在藥物釋放過程中產(chǎn)生的突釋現(xiàn)象。

圖3 PLLA多孔微球的SEM圖片

2.3.2 多孔微球粒徑分析

藥物顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)性質(zhì)極大的影響藥物在肺部的吸入給藥過程。只有空氣動(dòng)力學(xué)粒徑在 1～5 μm之間的顆?？梢赃M(jìn)入肺部深處，而大于5 μm的顆粒則容易進(jìn)入口腔，小于1 μm的顆粒由于布朗運(yùn)動(dòng)停留在上呼吸道。除此以外，如果顆粒的幾何粒徑在1～5 μm之間則會(huì)被肺部巨噬細(xì)胞會(huì)吞噬，將其排出體外，不能達(dá)到治療效果，因此只有空氣動(dòng)力學(xué)粒徑處于1～5 μm之間而幾何直徑大于5 μm的顆粒可以進(jìn)入肺部深處，完成給藥[9]。

本研究采用空氣動(dòng)力學(xué)粒徑譜儀測(cè)定多孔微球的空氣動(dòng)力學(xué)粒徑并計(jì)算可吸入比，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，空白PLLA多孔微球經(jīng)SSI過程負(fù)載藥物后，幾何粒徑變小和空氣動(dòng)力學(xué)粒徑均變小，可吸入比由24.51%提高到66.44%，這表明經(jīng)SSI過程將藥物負(fù)載與空白多孔微球后，有 66.44%的微粒可進(jìn)入肺部深處達(dá)到給藥目的。

表1 SSI浸漬前后平均粒徑、空氣動(dòng)力學(xué)粒徑及可吸入比

2.4 載藥多孔微球的體外釋放行為

進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)時(shí)，選用SSI方法制備的載藥PLLA 多孔微球，其制備條件為40℃，15.0 MPa，載藥量為1.0 mg/g。在37℃下，載藥多孔微球的釋放曲線如圖4所示，在釋放的起始階段，載藥PLLA多孔微球在起始的24 h中共釋放了20.0%的藥物，在40天內(nèi)累積釋放了61.6%的藥物。經(jīng)過SSI過程處理后的PLLA多孔微球，表面孔結(jié)構(gòu)閉合，微球表面為完整的球形，由于其表面封閉的結(jié)構(gòu)阻止了地塞米松從微球到溶液主體的快速釋放，進(jìn)而使多孔微球的突釋現(xiàn)象得到了規(guī)避。這種表面封閉的載藥PLLA多孔微球?qū)τ诰忈尳o藥來說是十分有利的。

圖4 在37℃下，載藥PLLA多孔微球體外釋放

3 結(jié)論

本文采用SSI法將地塞米松負(fù)載到PLLA多孔微球中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSI法可將地塞米松成功負(fù)載于PLLA載藥多孔微球中；SEM圖片顯示PLLA多孔微球表面孔結(jié)構(gòu)閉合，粒徑減小；載藥多孔微球的粒徑可滿足肺部吸入式給藥的要求。此外，PLLA載藥多孔微球的體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示，通過SSI過程制備的PLLA載藥多孔微球可降低藥物的突釋行為，延長釋放時(shí)間。因此，利用SSI法制備載藥多孔微球用于肺部吸入式給藥具有良好的應(yīng)用前景。

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