副豬嗜血桿菌病實驗室診斷方法綜述

張文通，魏 鳳，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

副豬嗜血桿菌病實驗室診斷方法綜述

張文通1，魏 鳳2，李 峰2，沈志強1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

副豬嗜血桿菌病是豬的一種傳染性病癥，以呼吸困難、多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎為主要特征。該病主要影響2周齡到4月齡的青年豬。感染豬群主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于 5～8 周齡的豬，發(fā)病率達 20%～30%，嚴重時死亡率可達 50%以上。該病隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化發(fā)展，再加上免疫抑制病（如豬圓環(huán)病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征等），目前在我國流行日趨嚴重[1-3]。預防該病所用的疫苗由于血清型之間的差異，交叉保護率低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重的損失，已成為影響?zhàn)B豬業(yè)最重要的細菌性疾病之一。

防制該病的關鍵措施之一是對該病病原的確診。依靠對發(fā)病豬群的病史、臨床癥狀、剖檢病變這些傳統診斷方法可以進行初步診斷，但弄清病原乃至病原的型必須依靠實驗室診斷。自 1922 年Schermer和 Ehrlich 分離出該病病原以來，科研工作者對該病確診進行了大量的研究，取得了顯著成績。本文就該病實驗室診斷方法研究進展綜述如下。

1 細菌分離鑒定

細菌的分離培養(yǎng)對確診是十分有必要的，但往往因雜菌的干擾而不能分離成功。

細菌分離鑒定時應當采集處于疾病急性期的豬并且沒有使用抗生素的病料，無菌操作條件下采集病豬肺臟、關節(jié)液、淋巴結等組織，通常在接種于含 NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）的巧克力瓊脂平板。在含血清和 NAD 的 TSA 培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h 后，可以觀察到針尖大小、圓形、光滑濕潤、無色透明、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色后顯微鏡下觀察，為革蘭氏陰性細小桿菌。在無菌操作條件下，挑取上述可疑菌落，水平劃線接種于無 NAD 的綿羊鮮血平皿上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37 ℃培養(yǎng) 24～48 h 后，觀察其在葡萄球菌周圍生長情況，應出現“衛(wèi)星生長現象”且無溶血現象[3-4]。

2 血清學診斷

副豬嗜血桿菌病血清學的診斷方法主要包括補體結合試驗（CF）、平板凝集試驗、間接血凝試驗（IHA）及酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。

補體結合試驗，用補體結合試驗方法檢測副豬嗜血桿菌的抗體，發(fā)現在補體結合試驗中各種血清型之間具有廣泛的交叉反應性。

高艷等利用副豬嗜血桿菌陜西分離株制備平板凝集抗原，用其免疫健康家兔制備血清抗體，建立副豬嗜血桿菌平板凝集檢測方法。采用該試驗建立的副豬嗜血桿菌平板凝集試驗方法對臨床血清樣品的檢測結果與臨床診斷結果基本一致。

魏子貢等用超聲波破碎的副豬嗜血桿菌血清4型和血清5型抗原代替副豬嗜血桿菌煮沸物或熱酚水透析物，用醛化鞣酸化的綿羊紅細胞代替新鮮綿羊紅細胞，經對免疫豬群的抗體水平檢測，免疫豬群兩周后抗體檢出率達 89%；對 1 665 份豬血清進行檢測，陽性率為 47.1%。該方法敏感性較高、特異性強、重復性好，可用于疫苗免疫后抗體水平的檢測及副豬嗜血桿菌病的流行病學調查。石碧等建立了用莢膜多糖作為包被抗原的間接血凝方法，通過優(yōu)化莢膜最佳生長條件，得到了高質量的抗原，從而使抗體檢測的敏感性得到了大幅提高。而 Miniats 等曾用副豬嗜血桿菌 0322 株鹽水浸出抗原致敏綿羊紅細胞檢測陽性血清，結果表明 IHA 法與間接 ELISA 檢測法符合率為 65.3%。

李鵬等利用純化融合 P2蛋白作包被抗原及優(yōu)化 ELISA 反應條件，建立了可檢測抗 HPSP2 蛋白抗體的間接 ELISA 方法，并用所建立的 P2-ELISA與國外進口的 HPS 檢測試劑盒 Synbiocits-ELISA 對196 份臨床送檢血清進行平行檢測，陽性符合率為93.4%。臧瑩安等利用副豬嗜血桿菌（HPS）OMP P5基因表達并純化復性后蛋白作為包被蛋白，建立針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白 P5 的間接 ELISA 抗體檢測方法，通過對進行和未進行 HPS免疫的健康豬血清的檢測，證實了建立的間接 ELISA 方法具有敏感性高、特異性強、反應快速準確等特點，可用于HPS 的快速診斷。鄭念廣等采用 121 ℃高壓處理副豬嗜血桿菌4型和5型耐熱蛋白，混合作為包被抗原，建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接 ELISA 方法。結果表明敏感性比間接血凝試驗高，與國外ELISA 試劑盒一致，可用于副豬嗜血桿菌的血清抗體檢測和血清流行病學調查。馮小明等采用超聲裂解的副豬嗜血桿菌菌體上清作為包被抗原，建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接 ELISA 方法。建立的間接 ELISA 方法的特異性和重復性良好，敏感性比間接血凝試驗高，可用于副豬嗜血桿菌的檢疫和流行病學調查。

3 分子生物學檢測

在研究動物傳染性疾病的診斷中，分子生物學方法的引入大幅提高了診斷結果的準確性，特別是一些生長緩慢的病原體所致疾病診斷的發(fā)展。

根據副豬嗜血桿菌 16S rRNA 序列設計的引物建立的 PCR 診斷方法可以從臨床樣品中檢測出副豬嗜血桿菌，這種方法檢測的最小細菌濃度為 102CFU/mL，其敏感性也遠遠高于常規(guī)的細菌分離方法。劉建奎等針對副豬嗜血桿菌 16S rRNA 序列設計 1 對特異性引物，并據此建立了快速準確鑒定副豬嗜血桿菌PCR 方法，13 份疑似病料檢測結果表明，PCR 檢測結果與傳統生化鑒定結果符合率為 100%。

車勇良等建立一種可快速檢測副豬嗜血桿菌的環(huán)介導等溫擴增（LAMP）方法，是常規(guī) PCR 檢測最低限的 100 倍，顯示出較高的敏感性。

2013 年李富祥等根據副豬嗜血桿菌 16S rRNA基因的保守序列設計特異性引物和 TaqMan 探針，建立了副豬嗜血桿菌 TaqMan 實時熒光定量 PCR 檢測方法。結果表明，該方法最低可檢測到 6.92×101copies/μL 的標準品陽性質粒；臨床樣品檢測結果表明，該方法可用于副豬嗜血桿菌感染的早期診斷和流行病學調查以及副豬嗜血桿菌的定量分析。羅寶正等參考 GenBank 已發(fā)表的副豬嗜血桿菌轉錄起始因子 infB 基因序列設計特異性引物和探針，建立基于 TaqMan 探針熒光 PCR 技術檢測副豬嗜血桿菌的方法，結果表明 TaqMan 探針熒光 PCR 方法和細菌分離方法的檢測效果一致。

[1] 白文彬，于康震．動物傳染病診斷學[M]．北京：中國農業(yè)出版社，2002：476-482．

[2] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學 [M].第 5 版.北京：中國農業(yè)出版社，2006：264-265.

[3] 陳欣.副豬嗜血桿菌的分離與單抗制備及其抗原表位鑒定[D].北京：中國農業(yè)科學院，2011.

[4] 蔡旭旺.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究[D].武漢：華中農業(yè)大學，2006.

（編輯：柳青）

塵埃減少加劇中國空氣污染

【英國廣播公司網站5月12日報道】空氣中的塵埃通常被認為是一種環(huán)境問題，但是缺少塵埃正讓中國的空氣污染問題大大加劇。

一項新研究表明，塵埃減少意味著有更多的太陽輻射到達地面，從而導致風速降低。缺少風反過來又導致中國一些人口密集地區(qū)污染進一步加劇。

研究人員發(fā)現，塵埃減少導致這些地區(qū)人為污染增加 13%。

研究人員利用模型模擬這一地區(qū) 150 年的風沙模式，發(fā)現塵埃使大量的太陽光偏斜。

如果沒有這些塵埃，就會有更多來自太陽的熱量抵達地面。陸地和海上的溫度差異會產生風。如果沒有塵埃，陸地溫度會增加更多，那會改變陸地與海面的溫度差異，導致風減弱，從而造成更多的空氣污染。

這項研究的第一作者、來自華盛頓州太平洋西北國家實驗室的楊陽（音）說：“塵埃有兩個來源。一個是戈壁沙漠，一個是中國西北的高原，但是我們發(fā)現戈壁的影響大得多?！?/p>

楊陽說：“空氣中的塵埃減少導致更多的太陽輻射到達地面。它降低了陸地和海面之間的溫度差異，影響了風的循環(huán)，導致中國東部的空氣流動性降低，后者又導致空氣污染的積聚?！?/p>

塵埃的減少幾乎達到將近三分之一。對風速的影響則相對小得多。然而，當這種情況在廣泛的范圍內大規(guī)模出現的時候，風速上的小變化就意味著中國東部冬季空氣污染程度增加 13%。

除了中國，現在世界上許多地方都遭遇空氣污染程度加劇的問題，了解塵埃、風和排放是如何共同作用的可以幫助人們限制污染的空氣帶來的影響。

這項研究的關鍵結論之一就是塵埃的缺席可能意味著你呼吸的空氣不是更好，而是變糟了。

這項研究成果發(fā)表在《自然·通訊》雜志上。

（轉自 參考消息[N]，2017-05-15）

S858.285.1

A

1002-1957(2017)03-0101-02

2017-03-22

山東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系生豬創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-08-17）

張文通（1979-），男，河南滎陽人，助理研究員，碩士，主要從事獸用生物制品研究.E-mail：hzndzwt1@163.com