現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)白酒釀造微生物的研究進(jìn)展

周慶伍，曹潤(rùn)潔，2，何宏魁，2，湯有宏，2，劉國(guó)英，2，李安軍，2

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州236820； 2.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽亳州236820）

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)白酒釀造微生物的研究進(jìn)展

周慶伍1，曹潤(rùn)潔1，2，何宏魁1，2，湯有宏1，2，劉國(guó)英1，2，李安軍1，2

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州236820； 2.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽亳州236820）

基于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)白酒釀造微生物的研究，闡述了研究白酒釀造微生物所運(yùn)用的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的各種方法，包括PCR克隆文庫(kù)技術(shù)、PCR-變性梯度凝膠電泳、單鏈構(gòu)象多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)、核酸探針原位雜交技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)等及其相應(yīng)原理，并且綜述了近年來(lái)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段分別在大曲、窖泥、酒醅微生物中的應(yīng)用研究進(jìn)展，對(duì)深入研究微生物與酒體風(fēng)味形成之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)； 白酒釀造微生物； 鑒定； 檢測(cè)； 微生物群落結(jié)構(gòu)

人們熟知的現(xiàn)代世界六大蒸餾酒分別是白蘭地（Brandy）、威士忌（Whisky）、伏特加（Vodka）、金酒（Gin）、朗姆酒（Rum）、中國(guó)白酒（Baijiu）。其中，中國(guó)白酒是我國(guó)特有的一種蒸餾酒，中國(guó)白酒的釀造是采用含有淀粉或糖質(zhì)的原料，并以酒曲作為釀酒的糖化發(fā)酵劑，發(fā)酵后經(jīng)蒸餾、勾調(diào)等工藝制成[1]。白酒釀造過(guò)程中微生物群落呈現(xiàn)復(fù)雜多樣性，而發(fā)酵過(guò)程中微生物的菌群結(jié)構(gòu)的變化，很大程度上對(duì)白酒的產(chǎn)量與質(zhì)量均起著決定性的作用。隨著人們對(duì)釀酒微生物研究的深入，釀造過(guò)程中的主要微生物正在逐步被人們揭示。近年來(lái)，因現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，對(duì)于白酒微生物的研究已經(jīng)從傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)研究，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段為白酒釀造微生物群落的深入發(fā)展提供了重要的研究方向。本文基于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)白酒釀造微生物的研究及進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 白酒釀造微生物研究中所運(yùn)用的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)方法及其原理

1.1 PCR克隆文庫(kù)技術(shù)

克隆文庫(kù)技術(shù)可分析樣品中微生物的種類(lèi)及其相應(yīng)比例，通過(guò)該技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)無(wú)法培養(yǎng)的微生物，再對(duì)文庫(kù)中的基因序列進(jìn)行測(cè)定，獲得樣品中所含基因的種類(lèi)和相對(duì)數(shù)量[2]。目前PCR克隆文庫(kù)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物的相關(guān)研究，常用的是核糖體RNA基因克隆文庫(kù)的構(gòu)建，主要包括16S rDNA基因克隆文庫(kù)、真菌18S rDNA基因克隆文庫(kù)以及真菌ITS基因克隆文庫(kù)。2008年，張守印等[3]使用16S rDNA克隆文庫(kù)對(duì)細(xì)菌群落分析的可靠性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明使用該技術(shù)手段可以反映出菌群中各種細(xì)菌的豐度。

PCR克隆技術(shù)的基本原理：使用PCR擴(kuò)增目的基因片段將擴(kuò)增片段導(dǎo)入載體，再將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞（如感受態(tài)的E.Coli），經(jīng)平板培養(yǎng)篩選目的克隆，再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)目的克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取載體DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理后再經(jīng)核酸電泳確認(rèn)，最后測(cè)定目的片段的序列，獲得系統(tǒng)發(fā)育信息[4-5]。PCR克隆文庫(kù)技術(shù)能獲得微生物的準(zhǔn)確基因序列信息，可檢測(cè)出微生物群落中的優(yōu)勢(shì)菌群。

1.2 PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

PCR-DGGE技術(shù)是當(dāng)今分子生物學(xué)分析中最常用的分析方法之一，是研究環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的重要手段，已經(jīng)在海洋微生物和土壤微生物中得到應(yīng)用廣泛[6-7]。該技術(shù)具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)便，能全面反映樣品微生物多樣性等優(yōu)點(diǎn)，并可獲悉微生物的動(dòng)態(tài)群落的變化。DGGE的設(shè)計(jì)原理：根據(jù)雙鏈DNA堿基序列中GC含量及對(duì)應(yīng)的熔解Tm值均不同。DGGE法是在聚丙烯酰胺中形成變性劑梯度（如加入甲酰胺或尿素），使用特定引物PCR擴(kuò)增相同長(zhǎng)度的目的片段，電泳時(shí)GC含量低的先變性，含量高的后變形，根據(jù)其變性后遷移速度不同，把GC含量不同的核酸分離出來(lái)[5]。PCR-DGGE的技術(shù)原理[8]是環(huán)境樣品DNA提取后經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大量序列不同、長(zhǎng)度一致的基因片段。DNA分子中4種堿基組成和排列具有差異性，致使不同序列的雙鏈DNA分子有不同的解鏈溫度，再經(jīng)變性梯度凝膠電泳形成各異的條帶，隨后把切膠回收后的條帶序列與DGGE指紋圖譜對(duì)比分析，最終獲得環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的整體信息。

1.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)（PCR-SSCP）

單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（SSCP）是根據(jù)DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的一種檢測(cè)方法，能夠分離長(zhǎng)度相同而序列不同的核酸片段。單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)所依據(jù)的原理是：相同長(zhǎng)度的單鏈DNA，因堿基序列不同，形成的構(gòu)象不同，進(jìn)而形成了單鏈構(gòu)象的多態(tài)性。凝膠電泳中長(zhǎng)度相同核苷酸序列不同的DNA的遷移率不同，即可形成分離的條帶，因此在非變形聚丙烯酰胺凝膠中呈現(xiàn)不同的條帶可被銀染或者熒光標(biāo)記引物檢測(cè)，最后用DNA自動(dòng)測(cè)序進(jìn)行分析，可進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的研究。

用PCR-SSCP技術(shù)可以進(jìn)行序列差異的測(cè)定，但隨著片段長(zhǎng)度的增加，檢測(cè)的敏感度會(huì)降低。在PCR-SSCP技術(shù)中，進(jìn)一步提高了檢測(cè)突變方法的簡(jiǎn)便性和靈敏性?；具^(guò)程[9]：（1）提取樣品基因組DNA；（2）利用PCR擴(kuò)增16S rDNA或18S rDNA特定區(qū)域；（3）將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性形成單鏈DNA；（4）將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；（5）回收DNA，進(jìn)行基因測(cè)序，同基因文庫(kù)的16S rDNA或18S rDNA序列對(duì)比分析確定微生物的種屬。

1.4 核酸探針原位雜交技術(shù)（FISH）

核酸熒光原位雜交技術(shù)(FISH)提供微生物形態(tài)學(xué)、數(shù)量、空間分布與環(huán)境方面的信息，進(jìn)而對(duì)環(huán)境中微生物進(jìn)行動(dòng)態(tài)地觀察和鑒定[10]。FISH技術(shù)方法具有快速、靈敏的特點(diǎn)，其原理是根據(jù)待測(cè)微生物樣品不同分類(lèi)級(jí)別上的種群所具有特異的DNA序列，作為探針的是使用熒光標(biāo)記的特異的寡聚核苷酸片段，然后與環(huán)境中基因組DNA分子進(jìn)行雜交，使用光密度測(cè)定法直接比較核酸雜交所得條帶或斑點(diǎn)獲得定量結(jié)果，該結(jié)果可反映出該特異微生物種群的存在與豐度。因此，核酸熒光原位雜交技術(shù)可以進(jìn)行樣品的原位雜交，應(yīng)用于環(huán)境中特定微生物種群鑒定、種群數(shù)量分析及其特異微生物跟蹤檢測(cè)等方面。

1.5 磷脂脂肪酸（PLFA）

PLFA指紋圖譜技術(shù)是一種研究微生物群落結(jié)構(gòu)的快捷方法，廣泛應(yīng)用于土、淤泥和堆肥等復(fù)雜體系的微生物群落及動(dòng)態(tài)變遷規(guī)律的研究，該方法快速、可靠、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性高。磷脂脂肪酸是除古生菌外微生物細(xì)胞膜的主要成分，僅存在活細(xì)胞膜中[11]。PLFA指紋圖譜技術(shù)分析法是首先用Bligh 和Dyer法將磷脂脂肪酸部分提取出來(lái)，再用氣相色譜分析，獲得PLFA譜圖，即可通過(guò)譜圖的變化得到快速有效的監(jiān)測(cè)群落的微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

1.6 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)（PCR-RFLP）和末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（T-RFLP）

體育個(gè)性化的特性有：①整體性：體育學(xué)習(xí)中要實(shí)現(xiàn)自身全方位的發(fā)展，突出以學(xué)生為主體。②獨(dú)特性：是個(gè)性的外表表現(xiàn)形式，個(gè)體通過(guò)長(zhǎng)期的生活實(shí)踐而形成了相對(duì)穩(wěn)定的心理特點(diǎn)。③自主性：學(xué)生在學(xué)習(xí)生活中要具備自主動(dòng)手能力，現(xiàn)在的學(xué)生在父母的羽翼下成長(zhǎng)，其能動(dòng)性比較薄弱，所以為展現(xiàn)個(gè)體的個(gè)性化，自主性是不可或缺的。④傾向性：學(xué)生在體育項(xiàng)目方面有興趣的偏向性，個(gè)體傾向性時(shí)刻決定著人對(duì)周?chē)澜绲恼J(rèn)識(shí)和態(tài)度的選擇和趨向，決定著這個(gè)人追求什么、向往什么。其主要包括需要、動(dòng)機(jī)和價(jià)值觀。⑤動(dòng)力性：進(jìn)行體育課也是學(xué)生在高強(qiáng)度學(xué)習(xí)下宣泄心情的方法。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）是利用限制性酶切片段長(zhǎng)度的差異性檢測(cè)生物個(gè)體之間差異的一種分子標(biāo)記技術(shù)。PCR-RFLP的基本原理：經(jīng)PCR擴(kuò)增目的DNA，使用特異性內(nèi)切酶處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并將其切割成不同大小片段，根據(jù)不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，電泳分析后，產(chǎn)生的不同長(zhǎng)度的DNA片段條帶，進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)組成多樣性差異的分析[12]。

T-RFLP，又被稱(chēng)為16S rRNA基因的末端限制性片段分析技術(shù)，可用于研究微生物多態(tài)性。其原理：由于不同細(xì)菌的擴(kuò)增片段內(nèi)存在核苷酸序列的差異，酶切位點(diǎn)就會(huì)存在差異，因此酶切后就會(huì)產(chǎn)生許多不同長(zhǎng)度的限制性片段。所獲得的消化產(chǎn)物可用測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)16S rRNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，用熒光物質(zhì)標(biāo)記其中一個(gè)引物的5'端，末端帶熒光標(biāo)記的片段則能被檢測(cè)到，沒(méi)有帶熒光標(biāo)記的片段則檢測(cè)不到。該項(xiàng)技術(shù)重復(fù)性好，可進(jìn)行定性和定量分析[13]。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

PCR過(guò)程中將熒光能量傳遞，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，不僅能提高檢測(cè)的靈敏度，還能對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，進(jìn)而提高檢測(cè)的特異性。熒光定量PCR技術(shù)特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度較高，能夠有效解決PCR污染等問(wèn)題。PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)強(qiáng)弱積累的方式連續(xù)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，分析擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析樣品模板，可推斷獲得目的基因的初始量[14-15]。PCR反應(yīng)過(guò)程中，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，從指數(shù)期過(guò)渡到線性期和平臺(tái)期，可在指數(shù)期時(shí)的某一點(diǎn)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，以此推斷模板含量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)主要分為探針和熒光染料兩類(lèi)，模板的定量方法有相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N。相對(duì)定量是對(duì)未知的樣本比照一個(gè)參考樣本觀察量的變化，絕對(duì)定量是通過(guò)對(duì)測(cè)定樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.8 高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）

高通量測(cè)序技術(shù)，又稱(chēng)“下一代”測(cè)序技術(shù)（NGS），能夠深度測(cè)序，是新一代測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)能一次并行測(cè)定幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子的序列，且一般讀長(zhǎng)較短，能夠深入、細(xì)致、全貌的分析一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組。目前的高通量測(cè)序技術(shù)主要是由幾大公司推出的第二代測(cè)序技術(shù)以及單分子測(cè)序技術(shù)。當(dāng)前主要測(cè)序平臺(tái)有羅氏454公司的GSFLX測(cè)序平臺(tái)[16]、ABI公司的SOLID測(cè)序平臺(tái)[17]、和Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)[18]。第二代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)是高通量、重復(fù)性好、精確性高，不需要構(gòu)建文庫(kù)，無(wú)克隆誤差，能最大程度地節(jié)約人力、物力。

其中，454高通量測(cè)序法的原理是酶級(jí)聯(lián)化學(xué)，依靠生物發(fā)光進(jìn)行DNA序列分析，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來(lái)。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)釋放的有無(wú)和強(qiáng)度，實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列。Illumina的Solexa測(cè)序原理是橋式PCR，邊合成邊測(cè)序，可逆終止物。dNTP通過(guò)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)光火直接加入被熒光標(biāo)記的dNTP，在合成或連接生成互補(bǔ)鏈釋放出熒光信號(hào)。捕獲光信號(hào)轉(zhuǎn)化成一個(gè)測(cè)序峰值，獲得互補(bǔ)鏈序列信息。ABI的SOLID測(cè)序原理是Oligo連接測(cè)序，該技術(shù)基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接DNA測(cè)序法，通過(guò)連接酶，再對(duì)oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)。

2 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在白酒釀造微生物中的應(yīng)用

2.1 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在大曲微生物中的應(yīng)用

大曲生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的微生物具有多樣性、復(fù)雜性特點(diǎn)，也具有多酶多菌的特點(diǎn)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在大曲微生物上的應(yīng)用方面，主要從對(duì)其鑒定、微生物檢測(cè)及其群落結(jié)構(gòu)分析方面著手，其中對(duì)菌群的分析較多。胡佳等[19]利用免培養(yǎng)法，通過(guò)提取大曲的細(xì)菌總DNA，進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增，構(gòu)建基因文庫(kù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大曲具有高度的細(xì)菌多樣性。隨后在進(jìn)一步解析中通過(guò)PCR克隆文庫(kù)的一系列技術(shù)，分別進(jìn)行克隆分析、同源性比較以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)大曲中檢測(cè)到變形桿菌、假單胞菌等，后對(duì)大曲中鑒定出的細(xì)菌類(lèi)群中不可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行了部分解析[5]。褚學(xué)英等[20]從大曲中分離獲得了7株酵母的26S rDNA的D1/D2區(qū)的基因序列，運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)大曲中主要酵母菌進(jìn)行分子鑒定。其后，惠豐立等[21]繼續(xù)對(duì)該區(qū)域分別進(jìn)行了序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析。

2009年，羅惠波等[22]采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)濃香型大曲發(fā)酵過(guò)程中的原核微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵各時(shí)期群落結(jié)構(gòu)的相似性與多態(tài)性，進(jìn)行了一定的推測(cè)：不同生物群落彼此具有協(xié)同作用和相互制約效應(yīng)。高亦豹[23]等采用PCR-DGGE圖譜技術(shù)分別對(duì)高溫大曲和中溫大曲進(jìn)行了細(xì)菌的群落解析，檢測(cè)出傳統(tǒng)方法無(wú)法直接分離鑒定的細(xì)菌種屬。2012年，蘭玉倩等[24]同樣采用PCR-DGGE技術(shù)分析了清香型大曲生產(chǎn)過(guò)程中酵母菌的組成，并發(fā)現(xiàn)了清香型大曲生產(chǎn)中各個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌。姚栗等[25]在探索高溫大曲中細(xì)菌的種屬分布以及細(xì)菌區(qū)系的構(gòu)成情況時(shí)則運(yùn)用了16S rDNA克隆文庫(kù)技術(shù)。張磊等[26]結(jié)合傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法中的18S rDNA序列分析技術(shù)，對(duì)習(xí)酒大曲進(jìn)行了較為系統(tǒng)的酵母菌鑒定。張霞等[27]也運(yùn)用二者結(jié)合的方法對(duì)濃香型大曲中的霉菌進(jìn)行了鑒定分析，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。劉效毅等[28]采用傳統(tǒng)的分離方法和分子生物學(xué)相結(jié)合，綜合對(duì)高溫大曲中的微生物進(jìn)行了分離鑒定。張會(huì)敏等[29]通過(guò)構(gòu)建16S rDNA克隆文庫(kù)的方法，研究分析了古井貢酒中溫大曲和高溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，并通過(guò)比較詳細(xì)的分子鑒定了兩種大曲中主要細(xì)菌的組成比例，并研究了其相應(yīng)的進(jìn)化關(guān)系。陳玲等[30]則結(jié)合16S rDNA克隆文庫(kù)法和高通量測(cè)序法，對(duì)大曲中細(xì)菌微生物群落的組成及豐度和多樣性進(jìn)行了分析，且對(duì)比了兩種方法在研究大曲樣品細(xì)菌多樣性方面的適用性，研究結(jié)果表明，在反映樣本微生物群落規(guī)模上兩種方法的差異較大，但在反映大曲樣本中主要微生物的物種組成及數(shù)量比例上，二者獲得的結(jié)果較為接近，尤其是通過(guò)兩種方法獲得樣本中優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群的結(jié)果基本一致。

除以上主要常見(jiàn)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)之外，還有一種宏基因組技術(shù)，可直接對(duì)待測(cè)樣品中所有微生物全基因組的DNA進(jìn)行克隆。黃祖新等[31]利用宏基因組技術(shù)研究了大曲微生物中群落多樣性及其變化規(guī)律，較為全面地解析了大曲微生物的代謝機(jī)理，進(jìn)一步解析了利用大曲所生產(chǎn)的白酒的香味物質(zhì)組成和風(fēng)味特征的關(guān)系。

2.2 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在窖泥微生物中的應(yīng)用

窖泥微生物種類(lèi)繁多，相對(duì)大曲而言窖泥的微生物菌系更為復(fù)雜，近年來(lái)運(yùn)用各種分子生物學(xué)技術(shù)研究白酒窖泥微生物的概況，對(duì)于窖泥中細(xì)菌、古菌群落的定性和定量分析取得了一定成效，對(duì)微生物其他菌群結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了進(jìn)一步分析。

對(duì)于瀘州地區(qū)濃香型白酒窖泥原核微生物的群落結(jié)構(gòu)，葉光斌等[32]利用克隆文庫(kù)法進(jìn)行了研究，檢測(cè)出窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌群，測(cè)定了其含量。黃志國(guó)等[33]利用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)了瀘州老窖酒廠中不同窖齡（30年、100年、200年）窖泥中細(xì)菌，對(duì)比分析了細(xì)菌的豐度、多樣性和相似性，以及優(yōu)勢(shì)微生物的種類(lèi)。甑攀等[34]運(yùn)用PCR-SSPR技術(shù)解析了瀘州老窖3種不同窖齡（20年、100年、300年）窖泥中細(xì)菌和古生菌的多樣性和相似性。王明躍等[35]分別對(duì)20年窖、50年窖和150年窖中窖泥構(gòu)建了細(xì)菌的16S rDNA克隆文庫(kù)，通過(guò)文庫(kù)分析濃香型白酒窖泥細(xì)菌隨窖齡的變化規(guī)律，研究發(fā)現(xiàn)隨著窖齡的增加，窖泥細(xì)菌多樣性指數(shù)呈增加的趨勢(shì)，其中20～50年之間變化幅度較大，50年和150年窖泥的菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，此外，該研究對(duì)窖池細(xì)菌群落組成及與窖泥質(zhì)量性狀的關(guān)系進(jìn)行了較為全面系統(tǒng)的分析。湯斌等[36]綜合利用16S rDNA、PCR擴(kuò)增技術(shù)、分子克隆技術(shù)以及序列同源性分析等方法，對(duì)安徽古井貢酒的窖泥進(jìn)行分析，結(jié)果表明，古井窖泥中具有高度的細(xì)菌多樣性。施思等[37]采用PCR-DGGE技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)軟件分析，研究了濃香型白酒中不同窖泥的微生物群落特征分布，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中具有自然老熟的黑色窖池底泥中的細(xì)菌，以及產(chǎn)甲烷古菌菌群隨每一排次發(fā)酵進(jìn)行，其微生物區(qū)系的豐富性逐漸趨于穩(wěn)定，并且發(fā)現(xiàn)瀘州老窖窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌群是梭菌屬中一些不可培養(yǎng)的Bacillus。

除克隆文庫(kù)及DGGE技術(shù)之外，其他分子技術(shù)也均有涉及到窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)中的運(yùn)用。張勁等[38]使用熒光定量PCR技術(shù)研究了3種不同窖齡的（20年、50年、150年）窖泥，發(fā)現(xiàn)甲烷菌的數(shù)量及其變化規(guī)律，并以此為窖泥的老熟程度提供了相關(guān)依據(jù)。劉琨毅[39]針對(duì)窖泥微生物的特殊性，建立了窖泥微生物群落的PLFA指紋圖譜。吳冬梅等[40]利用FISH技術(shù)進(jìn)行了可視化定量表征窖泥中細(xì)菌和古菌的特征，從而在細(xì)胞水平上研究了窖泥微生物群落。何翠榮等[41]對(duì)濃香型白酒窖池細(xì)菌和古菌隨窖齡變化研究中采用了FISH技術(shù)，研究中發(fā)現(xiàn)該技術(shù)為濃香型白酒窖池微生物群落結(jié)構(gòu)的研究提供了一種快速、有效的檢測(cè)手段。能較真實(shí)地反映出窖池中細(xì)菌與古菌的生長(zhǎng)信息。其他現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)中，如涉及到高通量測(cè)序技術(shù)的運(yùn)用，陶勇等[42]使用高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）對(duì)窖泥中細(xì)菌和古菌群落進(jìn)行檢測(cè)，解析了樣品中的優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群及其差異性。鄧依等[43]將ITS-AFLP指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用到貴州某酒廠窖池池壁和池底的窖泥的分析，研究發(fā)現(xiàn)，池壁和池底窖泥中原核微生物呈現(xiàn)出差異性，其中老窖池池底和新窖池池底的原核微生物多樣性具有顯著性差異，而二者的池壁的原核微生物多樣性差異性不大。

2.3 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在酒醅微生物中的應(yīng)用

白酒生產(chǎn)釀造過(guò)程中具有“千年窖萬(wàn)年糟”說(shuō)法的酒醅，為窖泥微生物的生長(zhǎng)提供物質(zhì)能源，是微生物生長(zhǎng)的基質(zhì)。酒醅微生物生長(zhǎng)環(huán)境復(fù)雜，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法無(wú)法深入研究其微生物區(qū)系，而采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)則可突破傳統(tǒng)方法的局限性，能夠較為全面、客觀快速的分析研究酒醅中微生物的群落結(jié)構(gòu)。目前，酒醅微生物中的應(yīng)用所使用的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)主要有基因文庫(kù)、PCR-DGGE技術(shù)以及二者相結(jié)合的方式。張文學(xué)等[44]通過(guò)對(duì)酒醅發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行跟蹤取樣，借助PCR擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)窖池中心的酒醅樣品進(jìn)行DGGE和16S rDNA同源性比較，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期微生物分布呈現(xiàn)明顯的多樣性，而整個(gè)酒醅發(fā)酵過(guò)程中，Lactobacillus屬細(xì)菌較為突出，隨后通過(guò)18S rDNA克隆技術(shù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析鑒定糟醅中真菌為優(yōu)勢(shì)菌，研究結(jié)果表明，糟醅中真菌優(yōu)勢(shì)菌群構(gòu)成及其變化趨勢(shì)與濃香型白酒糟醅發(fā)酵中大分子物質(zhì)的降解、白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成有著密切關(guān)系[45]。2007年，張文學(xué)等[46]再次利用PCR-DGGE技術(shù)針對(duì)瀘州老窖發(fā)酵過(guò)程中酒醅細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，研究表明真菌多樣性的變化規(guī)律是隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行其多樣性逐漸降低。

王海燕等[47]采用基因文庫(kù)方法與PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合，對(duì)濃香型和芝麻香型兩種類(lèi)型白酒中微生物群落進(jìn)行了多樣性分析，結(jié)果表明，兩種酒醅中的微生物種屬結(jié)構(gòu)有巨大的差異性。施思等[48]則利用PCR-DGGE及克隆技術(shù)對(duì)習(xí)酒酒醅入窖前后的菌群變化進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，發(fā)酵前微生物群落結(jié)構(gòu)的分布有明顯的多樣性，而發(fā)酵后優(yōu)勢(shì)菌群的改變較為顯著。李德林等[49]利用PCR-DGGE技術(shù)，對(duì)濃香型白酒酒醅細(xì)菌群落DGGE圖譜的相似性進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)各樣品圖譜間相似性指數(shù)較低，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有著較大影響的因素為季節(jié)及進(jìn)水水質(zhì)的不同。

唐潔[50]利用PCR-DGGE技術(shù)分別進(jìn)行了酒醅中細(xì)菌、酵母和霉菌的群落組成的分析。研究結(jié)果表明，清香型酒中主要的產(chǎn)酒酵母和產(chǎn)酯酵母分別是釀酒酵母（S.cerceisiae）和異常畢赤酵母（P.anomala）。黃治國(guó)等[51]利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)四川不同地區(qū)醬香型白酒酒醅細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，醬香型白酒酒醅細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)因不同地區(qū)而出現(xiàn)較大的差異性。邵明凱等[52]則結(jié)合DGGE和RT-PCR技術(shù)，分別對(duì)醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中酵母群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。曾馳等[53]對(duì)白云邊酒高溫堆積酒醅過(guò)程中分離出來(lái)的6株不同細(xì)菌進(jìn)行了鑒定，運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了16S rDNA序列擴(kuò)增、同源對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育分析，研究發(fā)現(xiàn)白云邊酒高溫堆積酒醅過(guò)程中主要細(xì)菌為芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌。

張霞等[54]通過(guò)對(duì)貴州濃香型白酒酒醅中分離的細(xì)菌，運(yùn)用16S rDNA序列分析，結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌（Bacillus Licheniformis）為明顯優(yōu)勢(shì)菌群，占芽孢桿菌屬總數(shù)的32.96%。LI X R等[55]結(jié)合16S rRNA文庫(kù)、焦磷酸測(cè)序以及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，跟蹤分析了汾酒一個(gè)輪次夏季發(fā)酵酒醅，發(fā)現(xiàn)其中超過(guò)16S rRNA基因總序列的91%屬于乳酸桿菌科，而乳酸桿菌科中51%的為耐酸乳酸桿菌，并且檢測(cè)到的化學(xué)成分有著相似的顯著性變化，此外，其中60%真菌為酵母。劉念等[56]運(yùn)用18S rDNA序列同源性分析結(jié)合PCR擴(kuò)增技術(shù)，研究了濃香型白酒糟醅中酵母和絲狀真菌的區(qū)系的菌群構(gòu)成及演變規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在白酒糟醅中的真菌優(yōu)勢(shì)菌中，上層糟醅比下層糟醅的菌群分布較為豐富，發(fā)酵前中期和后期優(yōu)勢(shì)菌群則有不同。劉雯雯[57]基于26S rDNA序列分析，跟蹤了發(fā)酵周期過(guò)程中的菌群變化情況，對(duì)黑龍江某醬香型酒醅中酵母菌進(jìn)行了解析，確定了其種類(lèi)及群落結(jié)構(gòu)。王海燕[58]綜合了集中分析手段，通過(guò)結(jié)合傳統(tǒng)微生物研究方法、PCR-DGGE、QPCR、HS-SPME-GC-MS技術(shù)，對(duì)清香型酒醅微生物進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)表明，研究樣品的主要微生物屬在發(fā)酵后期乳桿菌為最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。除以上對(duì)酒醅微生物的研究中所提到的技術(shù)外，T-RFLP技術(shù)也應(yīng)用于酒醅微生物的多樣性研究中[59-60]。

3 總結(jié)與展望

中國(guó)白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的行業(yè)，有著厚重的文化積淀和人文情懷，是中華民族文明的象征。探究解密白酒釀造過(guò)程中微生物的重要作用及其環(huán)境微生物區(qū)系的生態(tài)變化規(guī)律，對(duì)中國(guó)白酒的發(fā)展有著不可估量貢獻(xiàn)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，及其他相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步結(jié)合，對(duì)中國(guó)白酒生產(chǎn)中釀造微生物的應(yīng)用更加廣泛，更加深入?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可在種屬水平上對(duì)白酒釀造微生物進(jìn)行系統(tǒng)分析，可綜合分析大曲、窖泥、酒醅中的微生物區(qū)系，適用于整個(gè)環(huán)境微生物的菌群分析，能進(jìn)一步挖掘白酒釀造中的微生物菌種、菌群多樣性、白酒風(fēng)味物質(zhì)特征分析等方面的研究，對(duì)白酒實(shí)際生產(chǎn)不僅能提供深入的理論基礎(chǔ)及指導(dǎo)方向，為解決實(shí)際生產(chǎn)中面臨的釀造微生物的難題而溯源，也為創(chuàng)新傳統(tǒng)模式下的白酒研發(fā)等方面提供更加具體詳見(jiàn)的目標(biāo)性，為進(jìn)一步推動(dòng)中國(guó)白酒的快速?gòu)?qiáng)勁的發(fā)展提供巨大的技術(shù)支撐作用。

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Research Progress of Baijiu-Making Microbes Based on Modern Molecular Biological Technology

ZHOU Qingwu1,CAO Runjie1,2,HE Hongkui1,2, TANG Youhong1,2,LIU Guoying1,2and LI Anjun1,2
(1.Gujing Gongjiu Co.Ltd.,Bozhou,Anhui 236820;2.Anhui Engineering Technology Research Center for Solid-state Fermentation,Bozhou,Anhui 236820,China)

The modern molecular biological technology applied in the research on Baijiu-making microbes,including PCR clone library technology,PCR-denaturing gradient gel electrophoresis,single-strand conformation polymorphism technology,nucleic acid probe in situ hybridization technology,phospholipid fatty acid,restriction fragment length polymorphism amplification technology and terminal restriction fragment length polymorphism analysis technology,real-time fluorescent quantitative PCR technology,and high-throughput sequencing technologies,were introduced.The research progress of modern biological technology in the study of Daqu,pit mud and fermented grains in recent years was summed up,which laid the foundations for further research on the relations between microbes and the formation of liquor body and liquor flavor.

modern molecular biological technology;Baijiu-making microbes;identification;detection;microbial community structure

Q93-3；TS261.1；TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2017）06-0095-08

10.13746/j.njkj.2016319

2016-10-31

周慶伍，男，高級(jí)工程師，碩士生導(dǎo)師；安徽古井貢酒股份有限公司總經(jīng)理，白酒國(guó)家評(píng)委，從事釀酒發(fā)酵技術(shù)研究與管理，發(fā)表論文20余篇、取得專(zhuān)利20余項(xiàng)。

曹潤(rùn)潔，女，碩士，安徽古井貢酒股份有限公司技術(shù)中心研究員，E-mail：18756766056@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-05-18；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170518.1059.006.html。