膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品中藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)淺析

羅俊霞，李曉臣，范知，董素靜，趙建波

（1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心，河南鄭州450006；

2.鄭州市農(nóng)業(yè)信息中心，河南鄭州450006；

3.鄭州市園藝工作站，河南鄭州450006）

膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品中藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)淺析

羅俊霞1，李曉臣1，范知2，董素靜1，趙建波3

（1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心，河南鄭州450006；

2.鄭州市農(nóng)業(yè)信息中心，河南鄭州450006；

3.鄭州市園藝工作站，河南鄭州450006）

本文通過(guò)翻閱文獻(xiàn)資料并結(jié)合日常的檢測(cè)實(shí)際，分析膠體金免疫層析法快檢產(chǎn)品應(yīng)用于水產(chǎn)品中藥物殘留的檢測(cè)時(shí)假陽(yáng)性和假陰性的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源及產(chǎn)生的原因，提出相應(yīng)的建議和應(yīng)采取的措施，以期提高對(duì)水產(chǎn)品中藥物殘留的快速檢測(cè)的效果。

膠體金免疫層析類(lèi)速測(cè)產(chǎn)品；藥物殘留；假陽(yáng)性；假陰性；風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源

目前膠體金免疫層析技術(shù)已經(jīng)較為廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)品中的藥物殘留（如氯霉素、磺胺類(lèi)藥物、氟喹諾酮類(lèi)藥物、孔雀石綠、硝基呋喃類(lèi)藥物）的速測(cè)產(chǎn)品中，這類(lèi)產(chǎn)品在檢測(cè)過(guò)程中具有快速、準(zhǔn)確、操作方便、定量或者半定量[1,2]的特點(diǎn)，但是在檢測(cè)過(guò)程中也存在著這樣或者那樣的問(wèn)題影響著檢測(cè)結(jié)果，造成假陽(yáng)性或者假陰性檢測(cè)結(jié)果的發(fā)生，嚴(yán)重影響了檢測(cè)質(zhì)量。為此筆者翻閱了大量的文獻(xiàn)資料，結(jié)合平時(shí)的檢測(cè)實(shí)際，以日常使用的水產(chǎn)品的快速檢測(cè)試劑卡為例，淺析這類(lèi)產(chǎn)品在檢測(cè)過(guò)程中假陽(yáng)性或假陰性發(fā)生的原因，供同行參考。

1 膠體金免疫層析法的技術(shù)特點(diǎn)

膠體金免疫層析法的優(yōu)點(diǎn)有易制備、價(jià)格低、使用方便等特點(diǎn)；金顆粒大小可以控制，可進(jìn)行雙重或者多重標(biāo)記，對(duì)組織細(xì)胞的非特異性吸附作用小，具有高特異性和高敏感性，既可以用于光鏡，也可以用于投射電鏡和掃描電鏡；檢測(cè)結(jié)果可以直接用顏色顯示，肉眼判斷直觀可靠，也可配合其它方法進(jìn)行定量和半定量[1,3-5]。但是該方法還存在著一些不足：（1）膠體金顆粒本身的特異性導(dǎo)致了該技術(shù)的應(yīng)用存在一定的限制，如操作過(guò)程中需要的清潔度高；（2）某些膠體金顆粒穩(wěn)定性差，存放時(shí)間短，滲透能力弱，著色不均勻等；（3）有些膠體金顆粒的檢測(cè)靈敏度不高，檢測(cè)限不能滿(mǎn)足監(jiān)控實(shí)際的需要[1]。

2 檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源

2.1 試劑盒的質(zhì)量

試劑盒的質(zhì)量是影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵[6]，而影響試劑盒質(zhì)量的最主要的因素是抗原抗體的質(zhì)量，如果抗原抗體不具有高度特異性，則樣品里與待檢物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)則容易跟非特異性的抗原抗體發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果[6-8]。膠體金試劑盒的特異性常用交叉反應(yīng)率表示，與待測(cè)藥物具有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)都可能和抗原結(jié)合產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)[7]。賴(lài)年悅等[8]認(rèn)為，待檢樣品種類(lèi)繁多，成分復(fù)雜，容易影響抗原抗體反應(yīng)以及膠體金顆粒與蛋白的吸附，有的抗體特異性不強(qiáng)，容易與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似的物質(zhì)有交叉反應(yīng)，所以因樣品基質(zhì)不同，檢出限在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，會(huì)造成假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。用日常檢測(cè)中使用的磺胺類(lèi)藥物的膠體金試劑卡對(duì)水產(chǎn)品中的磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行篩查，該產(chǎn)品可以檢測(cè)如磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺異噁唑等12種磺胺類(lèi)藥物，也就是說(shuō)該檢測(cè)卡所使用的抗體并沒(méi)有對(duì)這12種磺胺類(lèi)藥物中的某一種具有特異性的免疫反應(yīng)，這12種磺胺類(lèi)藥物均可以跟該試劑盒的抗體反應(yīng)，只是生產(chǎn)的抗體對(duì)這12種磺胺類(lèi)藥物敏感的程度不同，所以該試劑盒檢測(cè)這12種磺胺類(lèi)藥物的最低檢測(cè)限不一樣。所以當(dāng)陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)時(shí)，則說(shuō)明該樣本中可能含有高于該試劑盒里說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明檢測(cè)下限的12種磺胺類(lèi)藥物；或者該樣品中含有12種磺胺類(lèi)藥物中的幾種藥物，只是含量未知。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

在痕量分析的過(guò)程中，樣品或者樣品提取物中及其復(fù)雜多變的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、其他的小分子物質(zhì)及鹽溶液會(huì)給檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)較大的影響，叫做基質(zhì)效應(yīng)。在氣相色譜檢測(cè)農(nóng)藥殘留方面，黃寶勇、羅俊霞等[9-12]做了大量基礎(chǔ)性的研究，王秀丹[13]認(rèn)為在免疫檢測(cè)方面也存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，也就是說(shuō)樣品里的非目標(biāo)分析物也會(huì)引起較大的基質(zhì)干擾效應(yīng)，可能會(huì)和特異性的抗原抗體的發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。而李文玲等[14]認(rèn)為，在用膠體金免疫層析法檢測(cè)海參中的呋喃唑酮的過(guò)程中，由于其中蛋白和多糖組份的共同作用對(duì)檢測(cè)性能造成很大影響，造成檢測(cè)結(jié)果無(wú)法判定。

2.3 試劑盒的運(yùn)輸和保存

水產(chǎn)品的膠體金快速檢測(cè)試劑卡受環(huán)境條件的影響較大，確切的說(shuō)是抗原抗體受環(huán)境條件（如溫度）的影響較大，不同的抗原抗體要求的貯存溫度條件略有不同，一般環(huán)境溫度需要控制在10℃左右，溫度過(guò)高或者過(guò)低對(duì)抗原抗體都有影響，如果溫度過(guò)高會(huì)使抗原抗體發(fā)生非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的發(fā)生[6,15,16]。

2.4 結(jié)果判定

陶光燦等[17]對(duì)膠體金方法測(cè)定動(dòng)物組織中的氯霉素的方法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的方法在檢測(cè)過(guò)程中讓金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，增加了體系靈敏度，易于對(duì)樣本中的藥物殘留進(jìn)行分析，但是最后是通過(guò)顏色進(jìn)行結(jié)果判斷，比較主觀，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。

3 檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性的風(fēng)險(xiǎn)來(lái)源

3.1 試劑盒質(zhì)量

在用膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品中各種藥物殘留時(shí)，試劑盒的質(zhì)量是影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵。何華堅(jiān)[18]對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)化的商品試劑盒和進(jìn)口試劑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)試劑盒存在質(zhì)量不穩(wěn)定、檢測(cè)不準(zhǔn)確等缺陷，很多產(chǎn)品抗原不穩(wěn)定，如孔雀石綠抗原在產(chǎn)品保存期就失去了抗原的作用，使用這種試劑盒進(jìn)行檢測(cè)難免會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

3.2 基質(zhì)效應(yīng)

王秀丹[13]認(rèn)為在免疫檢測(cè)方面，樣品里的各種化學(xué)成份可能會(huì)影響到抗原抗體和目標(biāo)分析物結(jié)合，降低競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)的靈敏度，靈敏度降低勢(shì)必導(dǎo)致假陰性檢測(cè)結(jié)果的發(fā)生。Mitchell等[19]針對(duì)不同的添加物和緩沖溶液對(duì)尿液中睪酮免疫的的影響做了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)尿液中的基質(zhì)對(duì)睪酮檢測(cè)結(jié)果有抑制作用從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。而在基質(zhì)效應(yīng)的消除過(guò)程中很多人都采用將樣品進(jìn)行稀釋的方法，但是在對(duì)樣品進(jìn)行的稀釋的時(shí)候同時(shí)待測(cè)物質(zhì)也得到了同樣倍數(shù)的稀釋?zhuān)虼艘步档土藱z測(cè)方法的靈敏度，引起假陰性結(jié)果的發(fā)生[13]。

3.3 反應(yīng)的條件苛刻

用膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品的快速檢測(cè)產(chǎn)品的前處理一般都比較簡(jiǎn)單，但是由于某些藥物的特殊結(jié)構(gòu)，需要將該物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硗庖环N物質(zhì)才能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。例如水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物的檢測(cè)則需要將樣品在65℃的條件下進(jìn)行衍生30min，衍生成另外一種物質(zhì)后才能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，如果衍生時(shí)的溫度恒溫控制不好或者衍生的時(shí)間不夠，就會(huì)引起衍生不完全，從而導(dǎo)致假陰性檢測(cè)結(jié)果的出現(xiàn)。

3.4 樣品的前處理過(guò)程復(fù)雜

一般在進(jìn)行微量或者痕量分析時(shí)，稱(chēng)取樣品的時(shí)候，為了提高樣品中藥物的提取效果，需要將樣品粉碎成糜狀，樣品粉碎的越細(xì)，則樣品顆粒的比表面積越大，提取的效果就會(huì)越好。目前使用快速檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于樣品量或者儀器配置的原因，粉碎、處理水產(chǎn)樣品時(shí)，多數(shù)使用剪刀剪取一定量的樣品，而沒(méi)有將樣品進(jìn)行粉碎處理，這樣大塊樣品進(jìn)行提取處理，不易將樣品里的藥物提取出來(lái)，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。其次，在對(duì)樣本進(jìn)行藥物的提取的過(guò)程中，往往進(jìn)行均質(zhì)或者渦旋，均質(zhì)或者渦旋的目的也是將樣本進(jìn)行充分粉碎或者使有機(jī)溶劑和樣本顆粒進(jìn)行充分而有效的接觸，從而提高提取的效果，假如這一步?jīng)]有進(jìn)行充分而有效的處理則樣本中的藥物就有可能不會(huì)完全提取出來(lái)，從而導(dǎo)致假陰性檢測(cè)結(jié)果的發(fā)生。另外，在進(jìn)行樣品的濃縮之前，需要吸取一定體積的樣品提取液，如果稱(chēng)取樣品的時(shí)候使用的離心管體積較大（如50mL），因?yàn)樵撾x心管較粗，往往在吸取的時(shí)候就取不夠說(shuō)明書(shū)上所需要的體積或者在吸取的時(shí)候吸到了水相，造成所濃縮的樣本里藥物的含量比實(shí)際樣品中的含量低，從而導(dǎo)致假陰性的檢測(cè)結(jié)果發(fā)生。最后在氮吹的時(shí)候氮?dú)忾_(kāi)的過(guò)大或者水浴鍋的溫度設(shè)的過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)藥物隨著有機(jī)溶劑的揮發(fā)而揮發(fā)，引起樣本里目標(biāo)檢測(cè)物的含量降低，造成假陰性檢測(cè)結(jié)果的出現(xiàn)；氮吹后需要用有機(jī)溶劑對(duì)試管壁進(jìn)行充分的清洗和溶解，如果溶解不充分，也會(huì)造成樣本里的目標(biāo)藥物損失，導(dǎo)致假陰性樣本的發(fā)生。

4 檢測(cè)過(guò)程中的注意事項(xiàng)

4.1 選用質(zhì)量好的試劑盒

試劑盒質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量，所以，在檢測(cè)過(guò)程中選用質(zhì)量較優(yōu)的試劑盒是必須的，必要時(shí)還應(yīng)適時(shí)對(duì)試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證、把關(guān)。劉歡等[20-22]對(duì)孔雀石綠、硝基呋喃類(lèi)代謝物、氯霉素等三類(lèi)藥物多種產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行了比較和評(píng)價(jià)，認(rèn)為孔雀石綠殘留的膠體金快檢產(chǎn)品穩(wěn)定性較差，建議在用膠體金類(lèi)快檢產(chǎn)品應(yīng)用于水產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)管之前，有必要全面考察產(chǎn)品的質(zhì)量，包括產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

4.2 加強(qiáng)研究，降低基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)

膠體金免疫檢測(cè)中的基質(zhì)效應(yīng)是一個(gè)棘手的問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)外這方面的文獻(xiàn)還較少，因此加大這方面的科研很重要。如果能夠找到引起這種效應(yīng)存在的根本原因，同時(shí)開(kāi)發(fā)出有效、簡(jiǎn)便的消除基質(zhì)效應(yīng)的方法，將是膠體金免疫快檢產(chǎn)品的重大突破。隨著研究的不斷進(jìn)行，有望能夠減小乃至消除膠體金免疫檢測(cè)過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng)，使該產(chǎn)品真正實(shí)現(xiàn)在水產(chǎn)品安全品質(zhì)監(jiān)管方面的作用。

4.3 加強(qiáng)試劑盒在運(yùn)輸和貯存中的管理

因?yàn)槟z體金快速檢測(cè)卡有存放時(shí)間短的缺點(diǎn)，所以在試劑盒的運(yùn)輸和貯存過(guò)程中如果冷藏不好或者日常工作中反復(fù)凍融則會(huì)降低抗原抗體的特異性，導(dǎo)致試劑盒的靈敏度降低。因此在貯運(yùn)過(guò)程中加強(qiáng)管理，或者減少試劑盒的流通中轉(zhuǎn)環(huán)節(jié)，盡可能的減少試劑盒的庫(kù)存量，從而提高抗原抗體的壽命，以減少假陽(yáng)性或者假陰性檢測(cè)結(jié)果的發(fā)生。

4.4 加強(qiáng)學(xué)習(xí)，提高檢測(cè)人員的檢測(cè)水平

快速檢測(cè)工作看似簡(jiǎn)單，但是卻細(xì)致而繁瑣，不僅要求檢測(cè)人員有一定的學(xué)歷作為鋪墊，而且要求檢測(cè)人員應(yīng)該具有化學(xué)分析的專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)培訓(xùn)考核，操作熟練規(guī)范，同時(shí)要求檢測(cè)人員在檢測(cè)工作中要細(xì)致認(rèn)真，在工作中能夠發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題、解決問(wèn)題。所以，在日常工作中加強(qiáng)學(xué)習(xí)，提高檢測(cè)人員的檢測(cè)水平很重要。

4.5 在檢測(cè)過(guò)程中做好質(zhì)量控制，提高檢測(cè)質(zhì)量

對(duì)于在最后判定上面出現(xiàn)的檢測(cè)誤差，建議在檢測(cè)過(guò)程中制備選取陰性樣品，用陰性樣品制備一定濃度的陽(yáng)性樣品，了解該產(chǎn)品陰性樣品和陽(yáng)性樣品最終的檢測(cè)效果，不僅對(duì)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制，也對(duì)最后結(jié)果的判定進(jìn)行統(tǒng)一，提高最終的檢測(cè)質(zhì)量。

5 小結(jié)

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品中藥物殘留的快速檢測(cè)方面的產(chǎn)品得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，以膠體金為代表的方法被全球很多先進(jìn)的國(guó)家廣泛使用，建立適合我國(guó)、快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感度高，同時(shí)又準(zhǔn)確可靠的水產(chǎn)品中藥物殘留的快速檢測(cè)產(chǎn)品尤為重要。加強(qiáng)科學(xué)研究，提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性是檢測(cè)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急，這對(duì)加強(qiáng)水產(chǎn)品的安全品質(zhì)，提高人民群眾的身體健康、促進(jìn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、維護(hù)社會(huì)的穩(wěn)定有著重要的意義。

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［20］劉歡,郭萌萌,李晉成,等.免疫膠體金快速檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的質(zhì)量分析與評(píng)價(jià)［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2015（5）:1675-1682.

［21］劉歡,邢麗紅,宋擇,等.水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留快速檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量分析和評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn),2013（3）:2.73-79.

［22］劉歡,孫偉紅,馬兵,等.水產(chǎn)品中氯霉素快速檢測(cè)產(chǎn)品的質(zhì)量分析和評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn),2012（3）: 55-61.

Risk Analysis of Drug Residues in Aquatic Product by Colloidal Gold Immunoassay

LUO Jun-xia1,LI Xiao-chen1,FAN Zhi2,DONG Su-jing1,ZHAO Jian-bo3
（1.Agricultural Products Quality Inspection Center,Zhengzhou 450006,China;
2.Agricultural Information Center,Zhengzhou 450006,China;
3.Horticultural Workstation,Zhengzhou 450006,China）

Pass through document,find inform,combined with routine testing,the risk sources and causes of false positive and false negative were analyzed by using colloidal gold immunoassay for rapid detection of drugs in aquatic products，and corresponding suggestions and measures was taken.Expect to improve the effect of the rapid detection of drug residues in aquatic products.

aquatic product of colloidal gold immunoassay;drug residues;false positive;false negative;risk sources

X835

A

1005-3832（2017）02-0046-04

2016-09-21

羅俊霞（1972-），女，高級(jí)農(nóng)藝師，學(xué)士，從事農(nóng)產(chǎn)品安全品質(zhì)檢測(cè)研究.E-mail:71819@163.com

趙建波（1971-），高級(jí)農(nóng)藝師.