停乳鏈球菌isp基因的克隆與原核表達(dá)

劇慧棟，李月穎，馬 寧，李曉麗，趙寶華，秦麗云，呂國(guó)平，郭玉梅，王 莧，徐保紅*

(1.石家莊市疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050011;2.河北師范大學(xué)，河北 石家莊 050024;3.石家莊市環(huán)境檢測(cè)中心，河北石家莊 050000)

停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)為革蘭陽(yáng)性球菌，是奶牛乳房炎主要致病菌之一，給奶牛養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)能引起人類菌血癥、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、呼吸道和皮膚感染。停乳鏈球菌廣泛存在于畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)所，在?？谇?、皮膚、墊草、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)所均能檢測(cè)出［1］。能引起隱性和臨床的奶牛乳房炎，常規(guī)的抗生素治療效果不佳，因此未來(lái)防治停乳鏈球菌的辦法，應(yīng)該從停乳鏈球菌保守的細(xì)胞毒力分泌免疫因子作為潛在的疫苗靶點(diǎn)入手［2］。與停乳鏈球菌的黏附或侵襲以及抗調(diào)理吞噬或抵抗機(jī)體吞噬作用有關(guān)的表面蛋白有IgG、白蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白等［3-5］。致病物質(zhì)A群鏈球菌產(chǎn)生多種侵襲性酶和外毒素，鏈球菌致熱外毒素B就是A群鏈球菌以酶原形式分泌到胞外后形成的活性巰基蛋白酶。其能降解宿主胞外基質(zhì)、免疫球蛋白和補(bǔ)體成分以及A群鏈球菌自身表面黏附素M蛋白、F1蛋白、C5α肽酶和其他一些分泌蛋白，破壞宿主防御系統(tǒng)，幫助細(xì)菌逃避免疫清除，協(xié)助A群鏈球菌最初感染部位的擴(kuò)散和入侵宿主深層組織［6］。SignalP算法基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法和隱馬科夫模型2種算法，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)N端信號(hào)肽的有無(wú)?？缒^(qū)螺旋預(yù)測(cè)軟件(TM-HMM)用于預(yù)測(cè)分析蛋白跨膜螺旋的數(shù)目。若跨膜數(shù)目等于0，則可認(rèn)定該蛋白為分泌蛋白［7］。本研究首先是對(duì)停乳鏈球菌的基因組應(yīng)用SignalP和TMHMM互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器聯(lián)合進(jìn)行篩選，篩選出在國(guó)內(nèi)外從未報(bào)道過(guò)的免疫分泌蛋白基因(Immunogenic secreted protein)isp并從停乳鏈球菌中克隆到isp基因，進(jìn)行原核表達(dá)，為蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供依據(jù)，驗(yàn)證分子信息學(xué)對(duì)isp蛋白基因的預(yù)測(cè)正確與否提供了可能，為下一步探討其分子致病機(jī)制、檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)和疫苗的研制奠定基礎(chǔ)［8-9］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 停乳鏈球菌、受體菌BL21(DE3)、表達(dá)質(zhì)粒pET-25b由河北師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 儀器與試劑 PCR儀(美國(guó)PE公司);克隆載體pMD19-T、T4 DNA連接酶、dNTPs、TaqDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶(NdeI，XhoI)購(gòu)自大連寶生物公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker購(gòu)自北京全式金公司;DNA凝膠回收純化試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自威格拉斯生物公司;丙烯酰胺、N N'-亞甲雙丙烯酰胺、Tris Base、Glycine、過(guò)硫酸銨、2-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自寶泰克生物科技公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔酶標(biāo)抗體IgG、兔抗組氨酸標(biāo)簽(his)購(gòu)自Promega。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)停乳鏈球菌isp基因(GenBank:CP002215.1)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物詳見(jiàn)表1。

表1 引物設(shè)計(jì)Table1 Primer design

1.2.2isp基因 PCR擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建以停乳鏈球菌基因組DNA作為模板。反應(yīng)條件:94℃ 5 min、94℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用長(zhǎng)波紫外燈觀察并記錄結(jié)果和拍照。利用DNA快速純化/回收試劑盒回收陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，將isp基因PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E-.coliDH5α，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布到含X-gal和IPTG的氨芐青霉素平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取適量平板中白色菌落，提取質(zhì)粒。用NdeI和XhoI雙酶切鑒定，并挑取陽(yáng)性克隆送測(cè)序。將重組質(zhì)粒pMD19-T-isp和原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-25b均用NdeI和XhoI雙酶切，將回收的isp基因片段與pET-25b/NdeI+XhoI片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌BL21中。提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pET-25b-isp。

1.2.3 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá) 將含空質(zhì)粒pET-25b的大腸埃希菌BL21和重組菌株(BL21)(pET-25b-isp)接種于5 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃搖培過(guò)夜后，按體積比1%接種于卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)液中，在37℃搖床培養(yǎng)OD600達(dá)到0.4～0.6，加IPTG至終濃度為0.5和1 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜。于誘導(dǎo)前后取菌液1 mL，離心集菌重懸于50 μL dH2O中。誘導(dǎo)后樣品經(jīng)超聲裂菌，離心后分別收集上清和沉淀，加入等體積2倍上樣緩沖液。將樣品煮沸10 min。取15 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE，凝膠于考馬斯亮藍(lán)液中染色。以pET-25b空載體為表達(dá)陰性對(duì)照。

1.2.4 isp蛋白的純化 將陽(yáng)性重組菌株大量培養(yǎng)后超聲破碎，離心去上清，向上清液中加入2 mL 50%Ni-NTA agrose slurry，4℃低速混勻1 h，使目的蛋白與填充柱材充分結(jié)合，將溶液轉(zhuǎn)入Ni-NTA Column中，濾去結(jié)合液。向Ni-NTA Column中加入5 mL漂洗緩沖液洗柱，洗滌3次，充分除去未結(jié)合的雜蛋白。加入0.5 mL洗脫緩沖液，反復(fù)洗脫4～6次，收集洗脫液。洗脫液收集后采用Amicon Ultra-15離心濃縮管(30 K MWCO，Millipore)濃縮蛋白，并將溶液更換為標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(10 mmol/L 磷酸鉀溶液，pH 8.0，0.5 mmol/L EDTA，0.01%(v/v)2-mercaptoethanol)，同時(shí)添加10 μmol/L PLP和10%甘油，取5 μL進(jìn)行SDSPAGE。

1.2.5 isp蛋白的Western blot鑒定 將純化后的產(chǎn)物分別經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜上75 V，20 min。轉(zhuǎn)好的膜放入封閉液中封閉過(guò)夜。取出膜，TBST洗4次。一抗為兔抗組氨酸標(biāo)簽(his)，用封閉液稀釋的一抗孵育2 h。TBST洗4次，每次10 min。用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，孵育二抗2 h。TBST洗4次，每次10 min。用TMB顯色，出現(xiàn)特異條帶立即停止顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 isp基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用特異性引物，以停乳鏈球菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增出約1 500 bp大小的片段，與目的基因isp大小一致，見(jiàn)圖1。

圖1 isp基因的PCR結(jié)果Fig.1 Amplification of isp gene by PCR

2.2 克隆載體重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

將上述片段克隆入pMD19-T中，經(jīng)NdeI/XhoI雙酶切得到1 500 bp的片段，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定和BLAST后，結(jié)果表明所獲片段與停乳鏈球菌isp基因序列的同源性為98.57%，表明克隆載體構(gòu)建正確。陽(yáng)性克隆命名為pMD19-T-isp。

圖2 重組質(zhì)粒pMD19-T-isp的酶切結(jié)果Fig.2 Identification of clone plasmid pMD19-T-isp gene

2.3 表達(dá)載體重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

將isp基因片段與表達(dá)載體pET-25b連接，轉(zhuǎn)化后提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，得到結(jié)果如圖3所示的載體片段和1 500 bp左右的isp片段。酶切結(jié)果表明isp基因的原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pET-25b-isp。

圖3 停乳鏈球菌isp基因表達(dá)載體重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-25b-isp

2.4 重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果

isp基因誘導(dǎo)后制備蛋白樣進(jìn)行SDS-PAGE，可見(jiàn)分子量為53 ku左右的目的條帶，這與預(yù)期的蛋白表達(dá)的分子量一致，結(jié)果見(jiàn)圖4，表明目的蛋白可在宿主菌中得以高效表達(dá)。純化后蛋白SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed protein in E.coli

圖5 純化的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the pure expressed protein in E.coli

2.5 Western blot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物結(jié)果

純化蛋白經(jīng)Western blot分析，在53 ku左右出現(xiàn)特異性雜交條帶，證實(shí)表達(dá)目的蛋白為特異性表達(dá)產(chǎn)物，見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot結(jié)果Fig.6 Western blot analysis

3 討論

分泌蛋白質(zhì)是一大類介導(dǎo)與細(xì)胞外環(huán)境之間相互作用的蛋白質(zhì)，如受體、黏附素、運(yùn)載蛋白，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)復(fù)合物如菌毛、分泌性酶類、毒素和毒力因子等。但由于目前的蛋白檢測(cè)技術(shù)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上新基因的數(shù)量，因此利用生物信息學(xué)工具快速預(yù)測(cè)基因組信息具有較大的理論指導(dǎo)和實(shí)踐價(jià)值。通過(guò)生物信息學(xué)的手段，高通量地捕獲生物中某一類型的重要蛋白，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步選擇感興趣的蛋白，是一種較為快速、有效的研究方法。本研究首先對(duì)停乳鏈球菌的基因組應(yīng)用SignalP和TMHMM互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器聯(lián)合進(jìn)行篩選，篩選出在國(guó)內(nèi)外未報(bào)道過(guò)的免疫分泌蛋白基因(isp)并預(yù)測(cè)該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性、免疫反應(yīng)性和分泌功能，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)該基因原核表達(dá)后進(jìn)行二維凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較驗(yàn)證。陳建森等［10］對(duì)幽門螺桿菌分泌蛋白應(yīng)用SignalP和TMHMM互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并在實(shí)驗(yàn)室對(duì)該蛋白二維凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，結(jié)果與生物信息學(xué)技術(shù)的預(yù)測(cè)一致。DebRoy等［11］預(yù)測(cè)了嗜肺軍團(tuán)桿菌中部分未被實(shí)驗(yàn)證實(shí)的分泌蛋白。劉玉嶺等［12］對(duì)粟酒裂殖酵母基因組中含信號(hào)肽的分泌蛋白做了預(yù)測(cè)，獲得了該物種分泌蛋白組的較全面的資料。因此，利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的研究手段將加速發(fā)現(xiàn)停乳鏈球菌致病的分子機(jī)制，并有助于挖掘出具備停乳鏈球菌特異性診斷和保護(hù)性免疫的候選抗原。而isp基因成功地克隆與原核表達(dá)為驗(yàn)證生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性奠定了基礎(chǔ)。本文以停乳鏈球菌基因組DNA作為isp構(gòu)建的模板，成功擴(kuò)增出isp基因，經(jīng)測(cè)序檢測(cè)，與GenBank公布的停乳鏈球菌(AF354651)中利用SignalP和TMHMM互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器聯(lián)合預(yù)測(cè)的isp的基因序列有98.57%的同源性，說(shuō)明其保守性很強(qiáng)。在試驗(yàn)中觀察到，對(duì)成功構(gòu)建的菌株BL21(pET-25b-isp)表達(dá)條件經(jīng)優(yōu)化后，在溫度37℃，誘導(dǎo)時(shí)間12 h，IPTG濃度為1 mmol/L時(shí)，得到較高的蛋白表達(dá)量。Western blot分析結(jié)果顯示，原核表達(dá)得到的融合蛋白具有良好的抗原性，為實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證該蛋白的結(jié)構(gòu)功能奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于研究停乳鏈球菌的分子致病機(jī)制、檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)和疫苗的研制均具有較好的實(shí)踐運(yùn)用價(jià)值。

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