相關炎性因子在脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎模型大鼠血清和結腸組織的動態(tài)表達

何蘭娟++朱向東++王燕++郭婷婷++王迪

摘要：目的 觀察脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎模型大鼠血清及結腸組織白細胞介素（IL）-1β、IL-4、干擾素-γ（IFN-γ）及轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達水平的變化，探討其在脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法 采用復合方法建立脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型。75只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型3 d組、模型7 d組、模型14 d組和模型21 d組，ELISA檢測各組大鼠血清和結腸組織IL-1β、IL-4、IFN-γ及TGF-β1的含量。結果 與空白組比較，各模型組大鼠IL-1β、IFN-γ含量明顯升高，IL-4、TGF-β1含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），其中模型7 d組最為明顯（P<0.01）。結論 促炎因子IL-1β、IFN-γ和抑炎因子IL-4、TGF-β1在脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。

關鍵詞：潰瘍性結腸炎；脾腎陽虛；白細胞介素-1β；白細胞介素-4；干擾素-γ；轉化生長因子-β1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.015

中圖分類號：R228 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）01-0059-04

Dynamic Expression of IL-1β， IL-4， IFN-γ and TGFβ1 in Serum and Colon Tissue in Rats with Ulcerative Colitis of Spleen-Kidney Yang Deficiency Type HE Lan-juan， ZHU Xiang-dong， WANG Yan， GUO Ting-ting， WANG Di （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To observe the change rules of expressions of IL-1β， IL-4， IFN-γ and TGF-β1 in serum and colon tissue in rats with ulcerative colitis of spleen-kidney yang deficiency type； To explore the action in the progress of ulcerative colitis of spleen-kidney yang deficiency type. Methods Composite method was used to establish rat models with ulcerative colitis of spleen-kidney yang deficiency type. 75 Wistar rats were randomly divided into blank group， model 3 d group， model 7 d group and model 21 d group. ELISA was used to test the levels of IL-1β， IL-4， IFN-γ and TGF-β1 in serum and colon tissue. Results Compared with the blank group， contents of IL-1β and IFN-γ in model group increased significantly （P<0.05， P<0.01）， and the contents of IL-4 and TGF-β1 content decreased （P<0.05， P<0.01），especially in the model 7 d group （P<0.01）. Conclusion The pro-inflammatory factor IL-1β， IFN-γ and anti-inflammatory factor IL-4 and TGF-β1 play an important role in rats with ulcerative colitis of spleen-kidney yang deficiency type.

Key words： ulcerative colitis； spleen-kidney yang deficiency； IL-1β； IL-4； IFN-γ； TGF-β1； rats

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種反復發(fā)作的炎性腸病，其發(fā)病機制尚不明確。有學者認為細胞因子失衡是發(fā)生UC的關鍵環(huán)節(jié)，且目前抑炎和促炎因子的失衡機制越來越受到重視[1]。余瑩等[2]研究發(fā)現，UC患者大多伴有食欲減退、腰酸背痛、畏寒肢冷等脾腎陽虛的癥狀。曹燕飛等[3]通過文獻檢索對UC中醫(yī)證候分布進行分析，發(fā)現脾腎陽虛型位居第2，提示脾腎陽虛為UC常見證型。本實驗采用

基金項目：國家自然科學基金（81360541）

通訊作者：朱向東，E-mail：zhuxiangdong33@163.com

ELISA檢測促炎因子白細胞介素（IL）-1β、干擾素-γ（IFN-γ）和抑炎因子IL-4、轉化生長因子-β1（TGF-β1）在脾腎陽虛型UC大鼠血清和結腸組織的動態(tài)變化，探討其在脾腎陽虛型UC發(fā)病中的作用。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠75只，體質量（180±20）g，雌雄各半，甘肅中醫(yī)藥大學實驗中心，動物合格證號SYXK（甘）2001-0001。飼養(yǎng)于SPF級實驗室。endprint

1.2 藥物及制備

番瀉葉，購自蘭州惠仁堂藥店，100 ℃蒸餾水浸泡30 min，過濾，乙醇濃縮為1 g/mL（即100%濃度），置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫粴浠傻乃勺⑸湟?，天津藥業(yè)焦作有限公司，批號11080411。

1.3 主要試劑與儀器

2，4，6-TNBS（批號2508-19-2），Sigma公司；大鼠IL-1β（批號12-3012-096）、IFN-γ（批號12-3000-096）、IL-4（批號12-3040-096）、TGF-β1（批號12-3710-096）ELISA檢測試劑盒，深圳達科為公司。iMark酶標儀（美國BIO-RAD公司），臺式高速冷凍離心機（海天美生化儀器設備工程有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

實驗大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，待其體質量達到（180±20）g，按隨機數字表法分為空白組、模型3 d組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組，每組15只。大鼠脾腎陽虛型UC模型采用“病-證”結合方法造模[4-5]。除空白組外，其余4組每日予10 mL/kg 100%濃度番瀉葉灌胃、15 mg/kg氫化可的松注射液腹腔注射，空白組予10 mL/kg蒸餾水灌胃、等體積生理鹽水腹腔注射，連續(xù)21 d。21 d后，禁食24 h，乙醚麻醉，取12 cm聚丙烯管，插入肛門8 cm達結腸部位，快速注入TNBS/乙醇溶液（100 mg/kg），再注入約0.4 mL空氣，捏緊肛門，提取大鼠尾巴保持倒立1 min，防注入液倒流，并使藥液與結腸充分接觸，待麻醉清醒后正常喂養(yǎng)。

2.2 標本采集及處理

分別于造模3、7、14、21 d處死相應模型組大鼠并取材。將大鼠乙醚麻醉固定，股動脈取血，室溫靜置20 min，3000 r/min離心15 min，取上層血清，用于檢測血清細胞因子IL-1β、IFN-γ、IL-4、TGF-β1含量。之后將大鼠脫頸處死，剖取病變最嚴重處結腸，生理鹽水清洗，加9倍量生理鹽水勻漿，12 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

2.3 結腸損傷評分

參照文獻[6]肉眼評分。0分：無潰瘍、充血；1分：局部充血，無潰瘍；2分：1處潰瘍不伴充血或腸壁增厚；3分：1處潰瘍伴炎癥；4分：>2處潰瘍伴炎癥；5分：>2處潰瘍和/或炎癥>1 cm；6～8分：潰瘍和/或炎癥>2 cm，病變范圍每增加1 cm則計分增加1分。

2.4 指標檢測

ELISA檢測大鼠血清和結腸組織IL-1β、IFN-γ、IL-4、TGFβ-1含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，根據方差齊性檢驗結果，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 一般狀況

造模后第1日出現懶動、扎推，飲食減少及稀便；3 d后反應遲鈍，體質量開始下降，大便量多質稀，部分有黏液便和膿血便出現；7 d后飲食明顯低于正常，體質量明顯下降，皮毛污穢無光澤，肛周污穢，捕捉時抵抗力減弱，有黏液便或膿血便出現；14 d后活動開始恢復正常，但仍有稀便；21 d后大鼠毛色稍晦黯，反應較靈活，精神活動尚可，飲食逐漸恢復，時有稀便。

4.2 各組大鼠結腸損傷肉眼觀察結果

空白組腸道無增厚粘連，腸黏膜光滑，腸皺襞紋理清晰，未見充血、水腫、糜爛、潰瘍等情況；模型3 d組腸壁明顯充血、水腫、增厚，有潰瘍面形成；模型7 d組腸道粘連嚴重，腸黏膜壞死、呈黑褐色，部分可見腸脹氣；模型14 d組潰瘍面開始愈合，但部分仍有粘連；模型21 d組潰瘍面明顯縮小，部分可見愈合瘢痕；與空白組比較，各模型組結腸均有明顯損傷（P<0.01）；與模型7 d組比較，模型21 d組結腸損傷明顯恢復（P<0.01）。評分結果見表1。

4.3 各組大鼠結腸組織和血清白細胞介素-1β的動態(tài)表達

與空白組比較，各模型組大鼠結腸組織和血清IL-1β明顯升高（P<0.05，P<0.01）；與模型7 d組比較，模型21 d組IL-1β明顯降低（P<0.05）。結果見表2。

4.4 各組大鼠結腸組織和血清干擾素-γ的動態(tài)表達

與空白組比較，各模型組大鼠結腸組織和血清IFN-γ明顯升高（P<0.05，P<0.01），其中模型7 d組最為明顯（P<0.05，P<0.01）；與模型7 d組比較，模型21 d組IFN-γ明顯降低（P<0.01）。結果見表3。

4.5 各組大鼠結腸組織和血清白細胞介素-4的動態(tài)表達

與空白組比較，各模型組大鼠結腸組織和血清IL-4明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與模型7 d組比較，模型21 d組IL-4明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結果見表4。

4.6 各組大鼠結腸組織和血清轉化生長因子-β1的動態(tài)表達

與空白組比較，各模型組大鼠結腸組織和血清TGF-β1明顯降低（P<0.01）；與模型7 d組比較，模型21 d組明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結果見表5。

5 討論

目前學者多認為UC發(fā)生的主要機制是腸道黏膜免疫系統功能紊亂[7]，而促炎因子和抑炎因子平衡則是腸道黏膜免疫系統平衡的前提。細胞因子作為細胞間信號傳導分子，與靶細胞膜上的特異性受體結合，從而在機體免疫應答和炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用[8]。Asadullah K等[9]研究表明，IL-1β、IFN-γ、IL-4、TGF-β1等因子在UC的炎癥反應中起著重要作用。

IL-1β又名前炎癥反應細胞因子，它能活化CD4+ T細胞，促進B細胞生長、活化以及IL-2R表達，引起炎癥介質的釋放[10]。它還能通過自分泌或旁分泌促進其下游細胞因子的表達和產生，并與其協同作用，使免疫上調和促進炎癥活性，從而引起一系列的腸道炎癥和腸黏膜損傷。IL-1β還通過促進白細胞黏附分子的表達，趨化中性粒細胞等炎性細胞進入腸道病變部位，引發(fā)一系列腸組織破壞和腸道炎癥反應[11]。殷明霞等[12]研究發(fā)現，IL-1β在脾腎陽虛型UC大鼠血清中的水平隨著炎癥的發(fā)展而逐漸升高，姬培震等[13]研究也證實了這一觀點。endprint

IL-4是由Th2細胞分泌的抑炎因子，有研究表明，其在UC中明顯減少[14]。它能刺激B淋巴細胞和T淋巴細胞的增殖，抑制巨噬細胞和T淋巴細胞的產生和移動，從而抑制IL-1的促炎作用[15]。正常狀態(tài)下，人體腸黏膜分泌的IL-4與IL-1β維持動態(tài)平衡。當受到病原刺激后，這種平衡被打破，則發(fā)生腸道炎癥。因此，IL-4和IL-1β在抑制腸道炎癥和維持腸道免疫平衡中起關鍵作用。余瑩等[2]和鄒君君等[16]臨床研究發(fā)現，IL-4含量在脾腎陽虛型UC患者呈下降趨勢。

IFN-γ是一種二聚體糖蛋白，由Th1淋巴細胞和自然殺傷細胞產生，可使Th1細胞擴增、活性增強，抑制Th2細胞增生，是IL-4的拮抗因子[14]。它具有很強的免疫調節(jié)活性，是強有力的吞噬細胞和中性粒細胞激活物，能加重腸黏膜上皮細胞的凋亡和腸道炎癥等，在UC發(fā)病過程中產生了重要的作用[17]。殷明霞等[12]通過脾腎陽虛型UC大鼠模型分析發(fā)現，IFN-γ在模型組中明顯升高；鄒君君等[16]在臨床研究中也發(fā)現IFN-γ在脾腎陽虛型UC患者血清中含量升高。

TGF-β1通過下調過度的免疫反應而抑制炎癥的發(fā)生與發(fā)展，且能促進上皮的修復及血管再生。其還能通過抑制巨噬細胞黏附和遷移，抑制T細胞、B細胞凋亡[18]。作為公認的抑炎因子，其水平的下降還有利于淋巴細胞的激活，從而促進自身抗體和自身致敏T細胞的產生，發(fā)生自身免疫反應[19]。這些因素均能減輕腸黏膜的炎癥反應和損傷，從而促進UC的恢復。王燕等[20]研究發(fā)現，在脾腎陽虛型UC大鼠模型TGF-β1含量明顯低于正常組。

本研究結果顯示，與空白組比較，各模型組IL-1β、IFN-γ明顯升高，IL-4、TGF-β1明顯降低，其表達規(guī)律與結腸的損傷程度一致，表明UC的產生可能是因為抑炎因子和促炎因子平衡的破壞；且在模型7 d組炎癥反應最明顯，表明此時炎癥細胞因子失衡最明顯；而與模型7 d組比較，模型21 d組有所恢復，說明炎癥處于恢復階段，細胞因子逐漸趨于平衡，這與張歆等[21]的研究結論相一致，此時雖然機體自身處于自我修復狀態(tài)，但防御能力很低，容易復發(fā)，所以在此時用藥可以降低復發(fā)的風險。因此，我們認為抑炎和促炎因子的失衡是UC發(fā)病的重要因素，調節(jié)免疫平衡是治療脾腎陽虛型UC的重要思路之一。

參考文獻：

[1] STROBER W， FUSS I， MANNON P. The fundamental basis of inflammatory bowel disease[J]. J Clin Invest，2007，117（3）：514-521.

[2] 余瑩，朱瑩.潰結寧膏穴位貼敷治療脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎臨床療效及其對血清白細胞介素-4的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2011， 18（10）：11-13.

[3] 曹燕飛，朱向東.基于文獻學方法對潰瘍性結腸炎的中醫(yī)證候要素分布規(guī)律及治法研究[J].中醫(yī)研究，2013，26（10）：73-76.

[4] 鄒忠杰，龔夢鵑，謝媛媛，等.氫化可的松誘導的腎陽虛大鼠尿液代謝組學研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（8）：133-136.

[5] 呂愛平，李德新，崔家鵬，等.脾腎陽虛模型大鼠肝細胞線粒體磷脂組分變化的比較研究[J].中醫(yī)藥學刊，2003，21（1）：78.

[6] 朱向東，王燕，何蘭娟，等.四神丸對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸組織Toll樣受體2、4表達的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2016，23（10）：67-71.

[7] YU Y， SITARAMAN S， GEWIRTZ A T. Intestinal epithelial cellregulation of mucosal inflammation[J]. Immunol Res，2004，29：55-68.

[8] 汪斌，朱向東，段永強，等.芍藥苷對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織病理形態(tài)及血清抗炎和促炎因子平衡的影響[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志， 2013，21（1）：1-4.

[9] ASADULLAH K， STERRY W， VOLK H D. Interleukin-10 therapy-review of a new approach[J]. Pharmacol Rev，2003，55（2）：241-269.

[10] REGUEIRO M， CURTIS J， PLEVY S. Infliximab for hospitalized patients with severe ulcerative colitis[J]. J Clin Gastroenterol， 2006，40（6）：476-481.

[11] HUE S， AHERN P， BUONOCOR S， et al. Interleukin-23 drives in nate and T cell mediated intestinal inflammation[J]. J Exp Med， 2006，203：2473-2483.

[12] 殷明霞，許雅清，李海龍，等.IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ在脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎模型大鼠血清及組織中的表達[J].中國實驗動物學報，2015，23（2）：139-142.

[13] 姬培震，張怡，李雪萍.附子理中湯灌腸對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠NF-κB，TNF-α，IL-1β表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2015， 21（14）：124-128.

[14] 王雪茜，王新月.潰結飲2種給藥途徑對大鼠潰瘍性結腸炎血清IFN-γ和IL-4的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2010，33（7）：468-470.

[15] 趙建學，郭海燕，陸瑋婷，等.芍藥苷對肝纖維化模型大鼠血清TNF-α、IL-6與IL-10的影響[J].醫(yī)藥導報，2010，29（2）：168-170.

[16] 鄒君君，朱瑩，張曉江，等.潰結寧膏穴位敷貼對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎的臨床療效及其對血清γ干擾素、白細胞介素-4的影響[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志，2013，21（6）：305-307.

[17] 張志軍，劉懿，王磊，等.TLR4mAb對急性期潰瘍性結腸炎小鼠結腸黏膜中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影響[J].復旦學報（醫(yī)學版）， 2008，35（2）：176-180.

[18] 王覓柱，黨彤，孟憲梅.潰瘍性結腸炎組織IL-8、TNF-α和TGF-β1的表達及其意義[J].內蒙古醫(yī)學雜志，2012，44（6）：641-644.

[19] 王磊，劉懿，張志軍，等.TLR4mAb對急性期潰瘍性結腸炎小鼠結腸黏膜中細胞因子IL-17、IL-10及TGF-β的影響[J].復旦學報：醫(yī)學版， 2008，35（6）：892-896.

[20] 王燕，何蘭娟，朱向東，等.四神丸對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠血清TGFβ1、IL-6及結腸組織TLR-4mRNA表達的影響[J].中醫(yī)藥學報， 2015，43（5）：118-122.

[21] 張歆，柯曉，陳錦團，等.IL-1β、IL-4在濕熱證潰瘍性結腸炎大鼠模型中的動態(tài)表達及意義[J].西安交通大學學報：醫(yī)學版，2015，36（5）：697-701.

（收稿日期：2015-11-23）

（修回日期：2015-12-29；編輯：華強）endprint