皺皮香豬3 個基因組拷貝數(shù)變異的多態(tài)性分布

王 州，冉雪琴*，牛 熙，李 升，黃世會，王嘉福,2*

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2. 銅仁學(xué)院，貴州銅仁 554300）

香豬體軀短圓，脂肪沉積能力強，屬于脂肪型豬品種[1]。香豬主產(chǎn)區(qū)位于貴州省從江縣月亮山區(qū)。皺皮香豬是從正常香豬群體分離而來，存在于不同豬場，在香豬群體中呈散發(fā)性存在，皺皮香豬作為親本產(chǎn)生的后代中大約三分之一有皺皮性狀，其主要特征是皺皮香豬軀干部皮膚表皮層和真皮層明顯增厚，皮膚彈性差，背部以后皮下脂肪層變薄，后軀體側(cè)特別是臀部皮膚褶皺明顯。皮膚是動物機(jī)體最大的器官，從外到內(nèi)分為表皮層、真皮層和皮下組織，具有保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、物質(zhì)吸收、感受外界刺激、分泌、排泄、調(diào)節(jié)體溫、參與新陳代謝和免疫反應(yīng)等生理功能[2]。對中國沙皮犬的皮膚表型和周期性發(fā)熱綜合癥進(jìn)行的研究證明，透明質(zhì)酸合成酶2（Hyaluronan Synthase 2，HAS2）基因上游約350 kb 處一段16.1 kb 的不穩(wěn)定重復(fù)是導(dǎo)致沙皮犬周期性發(fā)熱、透明質(zhì)酸沉積、皮膚大量褶皺的主要原因[3]?；蛑械闹貜?fù)變異屬于基因組拷貝數(shù)變異范疇?？截悢?shù)變異（Copy Number Variation，CNV）是與表型變異和疾病易感性相關(guān)的遺傳變異的重要來源[4]。CNV 包括1 kb 到若干Mb 范圍內(nèi)的重復(fù)、插入、缺失和復(fù)雜多位點的微觀和亞微觀結(jié)構(gòu)變異[5]。與單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP） 相 比，CNV 對基因組結(jié)構(gòu)和序列區(qū)域的影響更大，通過改變基因的結(jié)構(gòu)和劑量、影響基因調(diào)控元件和暴露隱性等位基因等方式影響基因的表達(dá)量，并引起表型差異和表型適應(yīng)性變化[6]。過去幾年中，在人、豬、雞、牛和羊等多種生物中進(jìn)行了大量的全基因組CNV 研究[7-13]，多數(shù)CNV 出現(xiàn)在富含基因的區(qū)域，主要與一些復(fù)雜性狀、疾病易感性及物種進(jìn)化相關(guān)。如Agouti 信號蛋白（Agouti Signaling Protein，ASIP）基因編碼區(qū)重復(fù)可能與綿羊的色素沉著有關(guān)[14]。涉及3 個成纖維細(xì)胞生長因子FGF3、FGF4 和FGF19 基因的133 kb 重復(fù)和ORAOV1 的復(fù)制使犬毛發(fā)脊和皮樣竇的易感性增加[15]。SOX5 內(nèi)含子1 的拷貝數(shù)增加導(dǎo)致雞的豌豆冠[16]。在相同遺傳背景的人群中，CCL3L1（MIP-1alphaP）基因拷貝數(shù)下降與人免疫缺陷病毒（HIV）/ 獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）易感性增強相關(guān)[17]，還與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）有顯著關(guān)聯(lián)[18]。KIT 基因拷貝數(shù)增加導(dǎo)致歐洲豬白毛色和白斑表型[19-20]，但榮昌豬的白毛色可能與KIT 基因的CNV 沒有直接聯(lián)系[21]。這些研究提示，基因中的CNV 可能影響動物的生長發(fā)育、疾病易感性，以及飼料利用率、生育力和產(chǎn)奶量等多種表型，但可能具有品種特異性。

為探究香豬皺皮個體產(chǎn)生皮膚褶皺的原因，本文利用香豬皺皮個體全基因組測序數(shù)據(jù)，與豬參考基因組序列、大白豬、長白豬全基因組重測序數(shù)據(jù)相比較，得到5 538 個CNVs，從中選取3 個候選CNVs，研究皺皮香豬個體與正常香豬之間的群體變異規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 CNV 信息 基于重測序數(shù)據(jù)預(yù)測基因組拷貝數(shù)變異，去重得到非冗余的CNVs，從中選取3 個CNVs 進(jìn)行群體比較研究。CNVs 基本信息見表1。

1.2 材料 30 頭正常香豬和30 頭皺皮香豬（圖1）的耳組織采于貴州大山地生態(tài)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司豬場，30頭大白豬血樣采于貴州畢節(jié)。

圖1 皺皮香豬（上）和正常香豬（下）皮膚褶皺比較

1.3 主要試劑 血液/組織基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和熒光染料SYBR 均購自北京天根生化科技有限公司；大腸桿菌DH5α（實驗室保存）；pGEM-T Easy Vector 購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀購自美國Bio Tech 公司；定量PCR儀（CFX96）為美國Bio-Rad 公司設(shè)備。

1.4 DNA 提取 參照基因組提取試劑盒說明書提取樣品基因組DNA，質(zhì)檢合格存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計 根據(jù)豬參考基因組序列（Scrofa 11.1），使用Primer Premier 5.0 設(shè)計檢測CNVs 的特異性引物，以單拷貝的GCG（Glucagon）為內(nèi)參，以DNAstar 分析引物的二級結(jié)構(gòu)，mFold 在線預(yù)測（http：//unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form）目的片段的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，NCBI 網(wǎng)站的Blastn（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）程序分析引物的特異性。引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成（表2）。

表2 引物序列

1.6 基因片段擴(kuò)增與測序 以基因組DNA 為模板，使用20 μL PCR 反應(yīng)體系：基因組DNA 1 μL，10 pmol/L 的上、下 游 引 物 各0.5 μL，2×PCR Mix 10 μL， 三 餾 水8 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。取60 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，連接pGEM-T Easy Vector 載體，轉(zhuǎn)化DH5α 菌，克隆得到陽性菌株，由貴州明涵生物科技有限公司測定核苷酸序列，提取重組質(zhì)粒DNA。

表1 CNVs 基本信息

1.7 qPCR 檢測拷貝數(shù)變異 將重組質(zhì)粒DNA 按10 倍濃度梯度稀釋（10-2～10-7），作為qPCR 擴(kuò)增的模板，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。qPCR 反應(yīng)體系10 μL：2 × SYBR Green Supper mix 5 μL，模板1 μL，濃度為10 pmol/L 的上、下游引物各0.3 μL，三蒸水3.4 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán) 。熔解曲線55℃至95℃，遞增速度為0.5℃/5s。采用相對定量的方法測定樣本基因組中CNVs 的拷貝數(shù)，每個反應(yīng)設(shè)3 次技術(shù)重復(fù)，以GCG 基因作為內(nèi)參基因，利用2-ΔCt進(jìn)行定量分析，依據(jù)文獻(xiàn)[22]方法確定樣品的拷貝數(shù)類型。

1.8 CNV 基因注釋及功能分析 使用Ensembl 的VEP（http：//asia.ensembl.org/Tools/VEP）工具注釋CNV 中的基因，使用Kobas3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php）作KEGG 和GO 富集分析，使用Panther（http：//www.pantherdb.org/）分析基因的功能，使用Animal QTL Database（https：//www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/search）分析CNVs中的QTL 類型。

1.9 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)按CNV 類型進(jìn)行統(tǒng)計，計算各組CNV 類型的分布頻率，包括拷貝數(shù)正常、拷貝數(shù)缺失、拷貝數(shù)增加3 種類型，通過SPSS 20.0 設(shè)置交叉表采用卡方檢驗分析CNVs 類型間的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 基因片段克隆與測序 以樣品基因組DNA 為模板，采用特異性引物擴(kuò)增目的片段，經(jīng)克隆測序，3 個CNVs 擴(kuò)增片段與豬參考基因組（Scrofa11.1）序列的相似性均為99%，GCG 基因為100%。說明獲得的擴(kuò)增片段確實為豬基因組目的序列。

2.2 豬群基因組CNV 檢測

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 以10 倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)qPCR 擴(kuò)增繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。CNV1、CNV2 和CNV3 和GCG 基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性，相關(guān)系數(shù)R2均在大于0.990，擴(kuò)增效率在100%±10%（表3）。3 個CNVs 基因及內(nèi)參GCG 基因定量引物的熔解曲線峰型單一，無雜峰；擴(kuò)增曲線均呈S 形，拐點清楚，曲線整體平行性良好，曲線指數(shù)期的斜率與擴(kuò)增效率呈正比，基線平直（圖2～5）。表明擴(kuò)增產(chǎn)物為單一的特異性產(chǎn)物，無引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生，可以用2-ΔCt方法對基因進(jìn)行相對定量。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率

圖2 CNV1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 CNV2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 CNV3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 GCG 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 3 個CNVs 的群體拷貝數(shù)變異規(guī)律 以基因組DNA為模板，采用熒光定量PCR 對90 頭豬進(jìn)行拷貝數(shù)檢測表明， 3 個CNVs 真實存在，組間CNVs 分布頻率不同，NR 值于0.01～7.4 范圍[22]。3 個群體中，拷貝數(shù)缺失型變異主要以純合缺失為主，拷貝數(shù)增加型變異主要以雙拷貝增加和多拷貝增加為主，單拷貝的缺失或增加在群體中出現(xiàn)頻率較低。

CNV1 在3 個群體中的優(yōu)勢變異類型頻率為（表4），大白豬以拷貝數(shù)缺失為主（72.41%），皺皮香豬群體以拷貝數(shù)缺失為主（83%），正常香豬群體則以拷貝數(shù)正常占優(yōu)勢（63.33%）。對于CNV2（表5），大白豬、正常香豬群體和皺皮香豬群體均以拷貝數(shù)缺失為主，變異頻率達(dá)93%、97%和37%。3 個群體中，大白豬的CNV3 以拷貝數(shù)缺失型變異占主要優(yōu)勢（90%），皺皮香豬群體以拷貝數(shù)增加型變異為主（66.67%），正常香豬拷貝數(shù)增加與拷貝數(shù)正常型較多，變異頻率均為36.67%（表6）。

2.3 CNVs 基因注釋及功能分析使用VEP 注釋3 個CNVs 中的基因（表7），CNV1 內(nèi)有14個基因，分別是SFT2D1、PRR18、RPS6KA2、FGFR1OP、CCR6、UNC93A、MPC1、GPR31、RNASET2、TTLL2、TCP10L2 和3 個Novel基因（ENSSSCG00000034196、ENSSSCG00000036759、ENSSSCG00000040654）；CNV2 包含13個基因：KATNB1、ADGRG3、ADGRG1、DRC7、CCL17、RF00017、CX3CL1、COQ9、POLR2C、ADGRG5、CCDC102A、DOK4 和CIAPIN1；CNV3 有4個基因，其中LOC100513601 的3′ 端不在該CNV3 內(nèi)，SLA-5、RF00001 和ENSSSCG00000001231 處于CNV3 之中。

與正常香豬和大白豬相比，CNV1 在皺皮香豬中以拷貝數(shù)缺失為主，KEGG 富集分析提示CNV1 中的基因參與調(diào)節(jié)多條信號通路（表8），包括多個疾病相關(guān)的通路（如I 型糖尿病、病毒性心肌炎和自身免疫性甲狀腺疾?。⒃型閷?dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、胰島素抵抗、抗原加工和遞呈等。皺皮香豬的CNV2 和CNV3 以拷貝數(shù)增加占優(yōu)勢，KEGG 富集分析得出（表9），二者參與趨化因子信號通路以及多條與CNV1 相同的疾病相關(guān)通路、RNA 聚合酶、抗原加工和遞呈等。GO 富集分析表明，3 個CNVs 主要參與生物調(diào)節(jié)、發(fā)育、免疫、代謝和刺激反應(yīng)等生物學(xué)過程，且具有多種分子功能，主要涉及抗原結(jié)合、受體結(jié)合、酶活性（水解酶活性、連接酶活性和蛋白激酶活性）、G 蛋白偶聯(lián)受體活性、細(xì)胞因子受體活性以及細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)成分等。

表4 組間CNV1 拷貝數(shù)變異分析

表5 組間CNV2 拷貝數(shù)變異分析

表6 組間CNV3 拷貝數(shù)變異分析

將3 個CNVs 與豬QTL Database 進(jìn)行重疊分析，CNV1 區(qū)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何QTL 重疊；CNV2 和CNV3 2個區(qū)與125 個QTL 重疊，包括免疫能力、肉質(zhì)和肉色、生長和繁殖、肩部皮下脂肪厚度和肌內(nèi)脂肪含量等性狀。

3 討 論

3.1 貴州地方豬品種的皮膚比歐洲豬品種厚 皮膚是哺乳動物最大的器官，在保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和抵御外界病原物入侵等方面起著重要的屏障作用。研究表明，皮膚厚度會直接影響皮膚的感覺、防御、分泌、排泄等功能[23]。本實驗結(jié)果表明，貴州地方豬品種的皮膚比歐洲豬品種厚。大白豬背部皮下脂肪平均厚度為14 mm，其表皮和真皮層平均厚度為2.54 mm[24]；本實驗中經(jīng)實際測定，2 頭正常香豬背部皮下脂肪平均厚60 mm，表皮和真皮層平均厚5 mm；2 頭皺皮香豬背部皮下脂肪平均厚24 mm，表皮和真皮層平均厚8 mm。

3.2 CNV1 中的基因拷貝數(shù)缺失可能影響豬的脂肪代謝皺皮香豬具有皮下脂肪薄的優(yōu)良特性，其脂肪代謝可能與CNV1 中的基因拷貝數(shù)缺失有關(guān)。群體檢測結(jié)果表明，CNV1 在皺皮香豬群體和大白豬群體主要以拷貝數(shù)缺失（Deletion）型變異為主，變異頻率分別為83.00% 和72.41%，而正常香豬群體的拷貝數(shù)缺失型變異頻率為23.33%。卡方檢驗表明，皺皮香豬和大白豬的CNV1缺失型頻率極顯著高于正常香豬，皺皮香豬和大白豬之間差異不顯著。線粒體丙酮酸載體1（Mitochondrial Pyruvate Carrier 1，MPC1，ENSSSCG00000032916）基因存在于CNV1 中，是控制丙酮酸通過線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵因子，對碳水化合物、脂肪和氨基酸分解代謝以及合成代謝途徑起重要作用。MPC1 基因被敲除或活性受抑時，線粒體丙酮酸代謝受阻，ATP 合成量下降，促進(jìn)脂肪分解代謝[25]。Zou 等[26]研究證明，抑制MPC1 的活性可以促進(jìn)脂肪酸氧化。MPC1±小鼠表現(xiàn)出脂解代謝加強、脂肪合成代謝下降[27]。MPC1 基因發(fā)生拷貝數(shù)缺失可能抑制其活性，繼而促進(jìn)脂解代謝和降低脂肪合成代謝。對CNV1 進(jìn)行KEGG 富集分析表明，核糖體蛋白S6 激酶2（Ribosomal protein S6 Kinase A2，RPS6KA2/RSK3）富集到胰島素抵抗信號通路，在該通路中RSK3 由胰島素前體激活，然后磷酸化蛋白磷酸酶1，蛋白磷酸酶1 去磷酸化糖原合成酶，促進(jìn)糖原合成。RSK3 基因的拷貝數(shù)缺失可能導(dǎo)致RSK3 酶活性下降，繼而影響糖原的合成與存儲，機(jī)體的能量需求轉(zhuǎn)而由脂肪酸氧化提供。CNV1 中MPC1 和RSK3 基因發(fā)生拷貝數(shù)缺失，可能是影響皺皮香豬皮下脂肪變薄的原因之一。

表8 CNV1 內(nèi)基因參與的信號通路

表9 CNV2 和CNV3 內(nèi)基因參與的信號通路

3.3 CCL17 和CX3CL1 基因拷貝數(shù)增加可能通過劑量效應(yīng)引起豬皮膚產(chǎn)生褶皺 皺皮香豬具有皮膚表皮和真皮層增厚、褶皺明顯和發(fā)紅等特征，其可能與CNV2 和CNV3 中的CCL17 和CX3CL1 基因拷貝數(shù)增加有關(guān)。CNV2 和CNV3 在皺皮香豬群體中拷貝數(shù)增加型變異所占的比率顯著高于正常香豬和大白豬群，正常香豬與大白豬群的構(gòu)成比差異不顯著。趨化因子CX3CL1（C-X3-C Motif Chemokine Ligand 1，CX3CL1/fractalkine）和胸腺和活化調(diào)節(jié)趨化因子（Thymus and Activation Regulated Che-mokine，TARC/CCL17）存在于CNV2 中，其參與調(diào)節(jié)趨化因子信號通路，參與各種皮膚炎癥的發(fā)生[28-29]，促進(jìn)炎癥部位白細(xì)胞的募集過程，可能與香豬皺皮性狀的發(fā)生有關(guān)。Fractalkine 和CX3CR1 基因在系統(tǒng)性硬化癥（SSc）患者受影響的皮膚中表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)CX3CR1 陽性細(xì)胞向受影響組織的募集，導(dǎo)致皮膚炎癥和血管損傷[30]；Fractalkine 和CX3CR1 mRNA 表達(dá)在注射TGF-β 的WT 小鼠中增加，導(dǎo)致小鼠皮膚膠原蛋白過量、引發(fā)皮膚纖維化增生[31]。CCL17 由樹突細(xì)胞（DC）、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，參與炎癥浸潤，被指定為Th2 型趨化因子，誘導(dǎo)Th-2 型淋巴細(xì)胞向皮膚募集，啟動Th2 細(xì)胞相關(guān)皮膚炎癥的發(fā)展[32]。CX3CL1 和CCL17 基因的表達(dá)量在銀屑病患者的受損部位皮膚中升高[33-34]，CCL17 基因在急性過敏性接觸性皮炎（ACD）患者的表達(dá)水平增加90 倍，CCL17 蛋白增加50 倍[35]。這些研究表明，趨化因子的表達(dá)水平與皮膚病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，提示皺皮豬CX3CL1 和CCL17 基因發(fā)生拷貝數(shù)增加，其可能通過劑量效應(yīng)引起豬皮膚產(chǎn)生褶皺。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果提示，3 個CNVs在豬群中呈現(xiàn)出多態(tài)性變化。CNV1 在皺皮香豬群中以拷貝數(shù)缺失型為主，其中的MPC1 和RSK3 基因拷貝數(shù)缺失可能與皺皮豬脂肪代謝有關(guān)；CNV2 和CNV3 在皺皮香豬群中以拷貝數(shù)增加型占優(yōu)勢，其中的趨化因子CCL17 和CX3CL1 基因可能通過劑量效應(yīng)引起豬皮膚產(chǎn)生褶皺。