無(wú)菌隔離器滅菌效果研究

羅輝艷，嚴(yán)東珍，劉家媛，廖馨涓，曹毅*

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川 成都 610023）

無(wú)菌隔離器滅菌效果研究

羅輝艷1,2，嚴(yán)東珍2，劉家媛2，廖馨涓2，曹毅1*

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川 成都 610023）

目的：確認(rèn)無(wú)菌檢查試驗(yàn)所需物品經(jīng)無(wú)菌隔離器系統(tǒng)滅菌后達(dá)到預(yù)期的滅菌效果要求。方法：通過(guò)過(guò)氧化氫氣體濃度及分布狀態(tài)確認(rèn)、BI挑戰(zhàn)試驗(yàn)、選擇性微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)及隔離器內(nèi)部環(huán)境的微生物檢測(cè)（沉降菌、浮游菌、表面微生物）驗(yàn)證無(wú)菌隔離器的最終滅菌效果。結(jié)論：無(wú)菌隔離器經(jīng)過(guò)過(guò)氧化氫蒸汽滅菌后，艙體內(nèi)物品表面的微生物被殺滅，物品內(nèi)部的微生物均不受影響且過(guò)氧化氫殘留對(duì)微生物無(wú)影響，無(wú)菌隔離器的系統(tǒng)滅菌效果達(dá)到預(yù)期要求。

無(wú)菌檢查；無(wú)菌隔離器；過(guò)氧化氫；滅菌效果

無(wú)菌檢查隔離器 (也稱(chēng)實(shí)驗(yàn)室隔離器，sterility testing isolator)是為無(wú)菌檢查試驗(yàn)提供無(wú)菌環(huán)境的一種設(shè)備，它能較好地防止微生物污染待測(cè)樣品，可以避免試驗(yàn)用物品和輔助設(shè)備被污染，提高了無(wú)菌檢查試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，現(xiàn)已在全球制藥行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。目前無(wú)菌檢查隔離器的滅菌通常是采用過(guò)氧化氫蒸汽滅菌劑來(lái)進(jìn)行。在隔離器內(nèi)部集成有過(guò)氧化氫發(fā)生器，可將高濃度的過(guò)氧化氫溶液經(jīng)發(fā)生器轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，均勻分布在隔離器艙體內(nèi)，在一定濃度及時(shí)間的條件下進(jìn)行滅菌，并在滅菌完成后利用帶高效過(guò)濾器的通風(fēng)系統(tǒng)將艙體內(nèi)殘留的過(guò)氧化氫蒸汽排出分解達(dá)到最終的滅菌效果。無(wú)菌檢查隔離器滅菌完成后艙體內(nèi)部環(huán)境的微生物負(fù)載應(yīng)達(dá)到GMP規(guī)定中A級(jí)潔凈度的要求，且滅菌過(guò)程不對(duì)物品內(nèi)及試驗(yàn)樣品的微生物有影響。

無(wú)菌檢查隔離器的系統(tǒng)驗(yàn)證是保證無(wú)菌檢查所需無(wú)菌環(huán)境的必要條件，而無(wú)菌隔離器的滅菌效果驗(yàn)證更是整個(gè)系統(tǒng)驗(yàn)證中尤為重要的驗(yàn)證項(xiàng)目之一。無(wú)菌隔離器的滅菌效果評(píng)價(jià)不僅包括滅菌對(duì)物品表面的滅菌效果評(píng)價(jià)，還包括滅菌對(duì)物品及待測(cè)樣品內(nèi)部微生物的影響程度評(píng)價(jià)和滅菌殘留物對(duì)物品及待測(cè)樣品微生物的影響程度評(píng)價(jià)。本文就無(wú)菌隔離器在最大裝載量下的滅菌效果進(jìn)行詳細(xì)的驗(yàn)證研究。

1 材料與方法

1.1 材料

STI-2400D 型無(wú)菌隔離器，供應(yīng)商為杭州泰林生物技術(shù)有限責(zé)任公司；過(guò)氧化氫蒸汽化學(xué)指示劑；過(guò)氧化氫蒸汽滅菌生物指示劑；過(guò)氧化氫溶液，各種檢測(cè)用培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)菌株等材料。

1.2 方法

（1）菌懸液的制備。①取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物用 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每 1ml含菌數(shù)小于 100cfu 的菌懸液 15ml；菌懸液平均分裝于 3 小藍(lán)蓋瓶?jī)?nèi)，瓶口密封（包裝形式與無(wú)菌檢查供試品一致），2～8℃冰箱存放，24h 內(nèi)備用。②取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物用 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每 1ml含菌數(shù)小于 100cfu 的菌懸液 15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝及保存。③取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入 3 ～ 5ml含 0.05%（ml/ml）聚山梨酯 80的 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后取孢子懸液至無(wú)菌試管，用含 0.05%（ml/ml）聚山梨酯80 的 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液制成每 1ml含菌數(shù)小于100cfu 的孢子懸液 15ml。菌懸液同金黃色葡萄球菌菌懸液同法分裝，2～ 8℃冰箱存放，2月內(nèi)備用。

（2）無(wú)菌隔離器的準(zhǔn)備。以無(wú)菌隔離器最大裝載量的要求將無(wú)菌檢查所需物品擺放到無(wú)菌隔離器內(nèi)部相對(duì)應(yīng)的位置；無(wú)菌隔離手套及艙體密封性測(cè)試合格；運(yùn)行參數(shù)已確認(rèn)。

（3）過(guò)氧化氫氣體濃度及分布狀態(tài)確認(rèn)。取19支過(guò)氧化氫蒸汽化學(xué)指示劑編號(hào)，放入無(wú)菌隔離器的手套部位、進(jìn)出風(fēng)口、風(fēng)扇背部、艙體上下四角及垃圾桶底部，滅菌完成后觀(guān)察變色情況。

（4）BI挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。取 13 支過(guò)氧化氫滅菌生物指示劑（嗜熱脂肪芽孢菌片）分布于無(wú)菌隔離器的8個(gè)手套部位、左右艙門(mén)、艙體操作臺(tái)面的左右及垃圾桶底部，滅菌完成后菌片取出接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，56℃培養(yǎng)，培養(yǎng) 7 天，觀(guān)察培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況，同時(shí)取未經(jīng)滅菌的生物指示劑3片同法接種，作為陽(yáng)性對(duì)照。

（5）無(wú)菌隔離器開(kāi)啟滅菌。開(kāi)啟無(wú)菌隔離器的自動(dòng)運(yùn)行程序，依次按照“自動(dòng)除濕”、“自動(dòng)調(diào)節(jié)”、“自動(dòng)滅菌”、“自動(dòng)通風(fēng)”、“自動(dòng)保壓”五個(gè)階段完成運(yùn)行程序。

（6）沉降菌檢測(cè)。取胰酪大豆胨瓊脂平皿培養(yǎng)基 15個(gè)，擺放在隔離器艙體操作臺(tái)面上，臺(tái)面兩側(cè)各放置6個(gè)平皿，臺(tái)面左右兩側(cè)各放置1個(gè)平皿，垃圾桶底部放置1個(gè)平皿。平皿暴露采樣4小時(shí)，同時(shí)取3只培養(yǎng)基作空白對(duì)照，采集完的培養(yǎng)基及空白對(duì)照培養(yǎng)基置于 20 ～ 25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入 30 ～ 35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 小時(shí)，記錄培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量。

（7）浮游菌檢測(cè)。取樣點(diǎn)為隔離器操作平臺(tái)的左右各1個(gè)點(diǎn)，使用胰酪大豆胨瓊脂平皿，在取樣點(diǎn)工作區(qū)附近放置取樣器，進(jìn)行空氣取樣，各取樣點(diǎn)的取樣量為 1000 升，同時(shí)取 3 只培養(yǎng)基作空白對(duì)照，采集完的培養(yǎng)基及空白對(duì)照培養(yǎng)基置于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入 30 ～ 35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48小時(shí)，記錄培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量。

（8）表面微生物的檢測(cè)。取胰酪大豆胨瓊脂接觸碟培養(yǎng)基6個(gè)分別對(duì)隔離器艙體內(nèi)表面的上部、下部、左部、右部、前部、后部進(jìn)行接觸10秒采樣；取胰酪大豆胨瓊脂接品平皿培養(yǎng)基（TSA）分別對(duì)8個(gè)手套指模進(jìn)行取樣，同時(shí)取3只培養(yǎng)基作空白對(duì)照，采集完的培養(yǎng)基及空白對(duì)照培養(yǎng)基置于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 小時(shí)后，再轉(zhuǎn)入 30 ～ 35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48小時(shí)，記錄培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量。

（9）選擇性微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)。①試驗(yàn)組一：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經(jīng)無(wú)菌隔離器過(guò)氧化氫蒸汽滅菌，接種計(jì)數(shù)。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各 1ml接種于TSA上，平行接種兩次，30～35℃培養(yǎng)48～72小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)，取平均值；取白色念珠菌、黑曲霉菌懸液 1ml接種至沙氏葡萄瓊脂培養(yǎng)基上，平行接種兩次，30 ～35℃培養(yǎng)3～ 5 天，菌落計(jì)數(shù)，取平均值。②試驗(yàn)組二：選擇性微生物菌懸液，小瓶密閉分裝后經(jīng)無(wú)菌隔離器過(guò)氧化氫蒸汽滅菌，并在滅菌完成后拆開(kāi)菌懸液瓶口，使內(nèi)容物在無(wú)菌隔離器內(nèi)暴露5min，然后同試驗(yàn)組一同法接種計(jì)數(shù)。

陽(yáng)性對(duì)照組：取保存在冰箱內(nèi)同批制造的選擇性微生物菌懸液，同試驗(yàn)組一同法接種數(shù)。

陰性對(duì)照組：另取 0.9% 無(wú)菌氯化鈉同法接種于TSA 及沙氏葡萄瓊脂培養(yǎng)基上，作為陰性對(duì)照組。

2 結(jié)果及分析

2.1 過(guò)氧化氫氣體濃度及分布狀態(tài)確認(rèn)結(jié)果

結(jié)果顯示編號(hào)1～19的過(guò)氧化氫蒸汽化學(xué)指示劑均由綠色變?yōu)辄S色，且各指示條變色后顏色基本一致，無(wú)肉眼可見(jiàn)的顯著性差異。表明過(guò)氧化氫氣態(tài)濃度在隔離器艙體內(nèi)均勻分布，且達(dá)到滅菌濃度。2.2 BI挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示編號(hào)1～13的過(guò)氧化氫滅菌生物指示劑接種于 TSB 中培養(yǎng) 7 天后培養(yǎng)基無(wú)渾濁，無(wú)菌生長(zhǎng)；陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)7天后培養(yǎng)基渾濁，有菌生長(zhǎng)。表明無(wú)菌隔離器經(jīng)過(guò)滅菌后能殺滅 106 個(gè) cfu的嗜熱脂肪芽孢桿菌。

2.3 沉降菌檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示無(wú)菌隔離器內(nèi)部各采樣點(diǎn)的沉降菌菌落數(shù)均為 0cfu/ 皿。表明滅菌后的無(wú)菌隔離器內(nèi)部環(huán)境達(dá)到A級(jí)潔凈度下沉降菌的相關(guān)規(guī)定。

2.4 浮游菌檢測(cè)結(jié)果

隔離器操作平臺(tái)的左右各1個(gè)點(diǎn)的浮游菌最終菌落數(shù)均為 0cfu/皿。表明滅菌后的無(wú)菌隔離器內(nèi)部環(huán)境達(dá)到A級(jí)潔凈度下浮游菌的相關(guān)規(guī)定。

2.5 表面微生物檢測(cè)結(jié)果

表面微生物檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)菌隔離器內(nèi)部各采樣點(diǎn)的表面微生物菌落數(shù)均為 0cfu/皿。表明滅菌后的無(wú)菌隔離器內(nèi)部環(huán)境達(dá)到A級(jí)潔凈度下表面微生物檢測(cè)的相關(guān)要求。

2.6 選擇性微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示試驗(yàn)組一的回收率依次為 95.8%、94.7%、97.0%、94.3%、95.5%，均在 90% 以上；試驗(yàn)組二的回收率依次為 92.9%、92.0%、95.5%、96.2%、97.0%，均在 90% 以上。見(jiàn)表 1 和表 2。

結(jié)果表明：①無(wú)菌隔離器的滅菌過(guò)程未對(duì)物品內(nèi)部微生物造成影響，即過(guò)氧化氫蒸汽滅菌不會(huì)殺滅現(xiàn)有包裝形式的物品及供試品內(nèi)部的微生物。②無(wú)菌隔離器艙體內(nèi)的過(guò)氧化氫殘留對(duì)微生物無(wú)影響。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)布點(diǎn)化學(xué)指示劑對(duì)過(guò)氧化氫蒸汽濃度分布狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確認(rèn)了無(wú)菌隔離器內(nèi)的滅菌劑是均勻分布的，且達(dá)到了滅菌所需有效殺滅濃度；通過(guò)布點(diǎn)生物指示劑對(duì)過(guò)氧化氫蒸汽殺滅物品表面微生物的效力進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)了無(wú)菌隔離器的滅菌對(duì)表面微生物的殺滅是有效的；進(jìn)而通過(guò)對(duì)滅菌后的無(wú)菌隔離器進(jìn)行內(nèi)部環(huán)境的浮游菌檢測(cè)、沉降菌檢測(cè)及表面微生物檢測(cè)確認(rèn)了滅菌后無(wú)菌隔離器能達(dá)到A級(jí)潔凈級(jí)別要求下的微生物水平；最后通過(guò)選取一些具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)菌株，制成菌懸液，模擬試驗(yàn)樣品在無(wú)菌隔離器內(nèi)的整個(gè)過(guò)程。滅菌完成后，分暴露與不暴露兩種狀態(tài)，分別對(duì)各選擇性菌株的菌懸液進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，計(jì)算回收率，以此來(lái)確認(rèn)了無(wú)菌隔離器的滅菌過(guò)程不會(huì)對(duì)物品內(nèi)部的微生物造成影響，以及無(wú)菌隔離器滅菌完成后的過(guò)氧化氫殘留亦不會(huì)對(duì)微生物造成影響。綜合分析得以證明無(wú)菌隔離器現(xiàn)有滅菌程序的有效性。

各試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次可驗(yàn)證滅菌程序具有良好的重復(fù)性或重現(xiàn)性。通過(guò)本試驗(yàn)，為無(wú)菌隔離器的滅菌效果驗(yàn)證提供一種具體可行且設(shè)計(jì)優(yōu)化的研究手段，能全面評(píng)價(jià)無(wú)菌隔離器的滅菌效果。

TH788

A

1671-0711（2017）03（下）-0078-02

*為通訊作者