一種改良的原代大鼠乳鼠心肌細胞分離及培養(yǎng)方法*

程俊 曾曉榮 譚曉秋 李鵬云 文靜 陳琳琳 楊艷

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)電生理教育部重點實驗室，四川 瀘州 646000)

論 著

一種改良的原代大鼠乳鼠心肌細胞分離及培養(yǎng)方法*

程俊 曾曉榮 譚曉秋 李鵬云 文靜 陳琳琳 楊艷△

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)電生理教育部重點實驗室，四川 瀘州 646000)

目的：本研究旨在探討一種經(jīng)改良后既穩(wěn)定又高效的分離大鼠乳鼠心肌細胞的原代分離和培養(yǎng)方法，擬建立此種方法，為進一步研究單個心肌細胞上的各種電生理機制等諸多實驗提供有利的前提保障。方法：取出生1-3天內(nèi)SD大鼠心臟，聯(lián)合應(yīng)用胰蛋白酶和Ⅱ膠原酶兩步消化，離心收集到心肌細胞，差速培養(yǎng)，加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷純化后得到原代心肌細胞，經(jīng)高糖DMEM培養(yǎng)，即可得到立體感較強的大鼠乳鼠心肌細胞。結(jié)果：聯(lián)合應(yīng)用胰蛋白酶和Ⅱ膠原酶兩步消化，經(jīng)過高糖DMEM培養(yǎng)后得到的心肌細胞存活率高、純度高、折光性好、立體感較強，有節(jié)律性搏動。結(jié)論：成功建立了一種既簡便高效又穩(wěn)定的分離大鼠乳鼠心肌細胞的方法，為今后研究乳鼠心肌細胞的功能及其基本電生理特性提供良好的單個細胞，可廣泛應(yīng)用于各種心血管疾病的研究中。

乳鼠；心肌細胞

在心血管疾病的臨床和基礎(chǔ)研究中，大鼠乳鼠心肌細胞常常被用作細胞體外實驗的研究模型。雖然Harary等[1]早在1960年就已經(jīng)找到原代乳鼠心肌細胞分離及培養(yǎng)方法，但用這種傳統(tǒng)方法所分離的乳鼠心肌細胞的存活率低、純度不高，不能廣泛應(yīng)用于心血管疾病的基礎(chǔ)性研究。經(jīng)過幾十年的探索和發(fā)現(xiàn)，人們不斷改良方法，力求尋到更適合的乳鼠心肌細胞分離方法，當(dāng)前很多文獻報道的培養(yǎng)方法大多數(shù)都是在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上進行改良[2-10]，總結(jié)起來主要有兩種方法，胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶和膠原酶混合消化法兩種，但是這兩種方法都存在一些問題，因此為了得到純度及活力更高的乳鼠心肌細胞用于心血管疾病的研究，本研究將對傳統(tǒng)分離法改進，探索出一種有效而實用的原代乳鼠心肌細胞分離培養(yǎng)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑胰蛋白酶(HyClone)，II型膠原酶(Sigma)、高糖DMEM(HyClone)、胎牛血清(HyClone)、5-Brdu(5-溴脫氧尿苷)(上海浩然生物技術(shù)有限公司)。

消化酶的配制胰蛋白酶為0.25%，膠原酶溶液由II型膠原酶、小牛血清白蛋白、DMEM培養(yǎng)基按1：5：1組成。

實驗動物新生SD大鼠乳鼠(1-3 d)，由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠乳鼠心肌細胞分離

PBS 15 mL加入P10培養(yǎng)皿，共三枚。取新生SD大鼠浸泡于裝有75%酒精燒杯中進行消毒，時間1 min。四肢固定后，用鑷子從劍突下方成V字剪開皮膚，肋弓正中偏左開胸，從心底部夾取心臟，放入盛有4℃ PBS的P10培養(yǎng)皿中，輕微擠壓，排除血液。沖洗后的心臟移至新的培養(yǎng)皿中，在放大鏡下找到左右心耳和左右心室，用鑷子夾取，PBS清洗2次收集至玻璃培養(yǎng)瓶中，加入0.25%胰蛋白酶3 mL，4 ℃靜置過夜。12-16 h后，再向裝有心臟的消化瓶中加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基3 mL，37℃恒溫水浴箱5 min終止消化。棄上清，加入膠原酶溶液3 mL，置于37℃恒溫水浴箱，1 min用手輕搖，首次消化，消化液中含有較多紅細胞等雜質(zhì)。棄上清，加入膠原酶溶液4 mL，置于37℃恒溫水浴箱，10 min用手輕搖。收集上清移入新的10 mL離心管中。向殘留的組織中加入膠原酶溶液4 mL，37 ℃恒溫水浴箱中繼續(xù)消化，消化10 min，收集上清液?？梢愿鶕?jù)心肌細胞塊殘留情況反復(fù)消化，使心肌組織得到充分的利用。將收集到得細胞上清液離心5 min(1000 r·min-1)，見細胞沉淀于試管底部。棄上清，加高糖DMEM培養(yǎng)基10 mL，輕輕拍打管壁使心肌細胞懸浮其中，而后均勻接種至P10的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放入37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)70 min。倒置顯微鏡下觀察，成纖維細胞折光性弱帖附于培養(yǎng)皿底部，心肌細胞折光性好處于懸浮狀態(tài)，收集細胞懸液，計數(shù)后，均勻接種于6孔板中。如果倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有較多折光性好的心肌細胞殘留可以用DMEM液輕柔沖洗培養(yǎng)皿底部，即使心肌細胞貼壁但是其貼壁程度明顯低于成纖維細胞，輕柔沖洗可將心肌細胞脫離而不影響成纖維細胞。向培養(yǎng)基中加入5-Brdu(100:1)放入37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，5-Brdu可以抑制成纖維細胞的分裂。24 h后換液一次，觀察細胞形態(tài)，貼壁以及搏動情況。

1.2.2 心肌細胞純度鑒定

培養(yǎng)24 h后的心肌細胞用DAPI和а-SA單克隆抗體染色，DAPI染色細胞核后呈藍色，а-SA單克隆抗體染色后呈綠色，并可觀察到心肌具有明顯的橫紋，即為陽性心肌細胞。因此，我們在熒光顯微鏡下，放大倍數(shù)為10×10，隨機觀察5個視野，分別計數(shù)200個細胞，其中陽性心肌細胞占總細胞的百分比即為心肌細胞的純度。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察

剛剛分離下來的大鼠乳鼠心肌細胞在倒置相差顯微鏡下觀察呈圓形或橢圓形，排列較緊密，培養(yǎng)12 h后心肌細胞開始貼壁，活力較好，培養(yǎng)24 h后細胞基本貼壁，較少細胞有自發(fā)性搏動，培養(yǎng)48 h后心肌細胞體積開始增大，基本都有自發(fā)性搏動，培養(yǎng)72 h后細胞伸出偽足，偽足之間相互接觸，交織成網(wǎng)狀，并有細胞集聚成簇，見圖1。

圖1 培養(yǎng)48 h后心肌細胞形態(tài)(10×4)

2.2 心肌細胞純度鑒定

培養(yǎng)24 h后的心肌細胞經(jīng)免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察，見圖2。心肌細胞細胞核經(jīng)DAPI染色后呈藍色，經(jīng)а-SA單克隆抗體染色后呈綠色，具有明顯的橫紋。計算出心肌細胞純度為93.7%±1.6%。

A B C圖2 免疫熒光結(jié)果(10×20)注：A為DAPI染色的心肌細胞細胞核，B為α-SA單克隆抗體染色，C為合成圖。

3 討論

心肌細胞的原代分離及培養(yǎng)是研究心血管疾病的基本方法和手段之一，能提供單一同源心肌細胞，而在制備細胞模型時對心肌細胞的數(shù)量、純度和活性度都有較高的要求。而目前大多數(shù)文獻報道的分離方法都是在單一酶法和混合酶法基礎(chǔ)上改良而成，由于傳統(tǒng)的單一胰酶消化法會過度消化心肌細胞，從而使分離下來的心肌細胞的存活率降低；而混合酶法因為酶的消化能力減弱而造成心肌組織消化的不完全，使心肌細胞的數(shù)目大大較少。從而我們根據(jù)實驗要求和傳統(tǒng)分離法存在的缺點，摸索出了一種穩(wěn)定高效分離大鼠乳鼠心肌細胞的方法。本實驗選取新出生1-3天內(nèi)的大鼠乳鼠的心臟，經(jīng)胰蛋白酶和膠原酶混合，過夜，得到大量活性較高的心肌細胞。胰蛋白酶過夜消化，可以讓胰蛋白酶充分緩慢作用于心肌組織，從而減輕胰蛋白酶作用過快對心肌細胞的損傷，更有利于保持心肌細胞的活性。膠原酶溶液是由II型膠原酶、小牛血清白蛋白以及培養(yǎng)基按照一定比例組成，這樣可以緩解膠原酶的直接作用，使心肌細胞緩慢從心肌組織上松散下來，從而增加心肌細胞的活力度，多次反復(fù)消化組織，這樣可以增加心肌細胞數(shù)量。心肌組織中有大量的成纖維細胞，為了減少成纖維細胞的影響，增加心肌細胞的純度，我們采取了差速培養(yǎng)法，這樣可以更好的將心肌細胞和成纖維細胞分離開，從而增加心肌細胞的純度。即使這樣，仍然有成纖維細胞的殘留，因此，我們加入了成纖維細胞生長抑制劑5-Brdu，5-Brdu為核苷酸類似物，可在成纖維細胞復(fù)制時代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)阻斷DNA復(fù)制而抑制成纖維細胞生長。而5-Brdu對心肌細胞幾乎沒有抑制作用[11]，這樣大大提高了心肌細胞的純度。

本研究探索的原代大鼠乳鼠心肌細胞培養(yǎng)方法，是一種高效而穩(wěn)定的方法，運用此方法可以獲得搏動良好、純度較高的心肌細胞，雖然較以往的心肌細胞培養(yǎng)方法在操作上稍微復(fù)雜些，但是能得到較為理想的心肌細胞，完全能滿足心血管疾病研究中對心肌細胞的實驗要求。

1 Harary L, Farley B. In vitro studies of single isolated beating heart cells[J]. Science, 1960, 131(3414): 1674-1675.

2 張曉京,張建東,來麗娜,等. SD乳鼠原代心肌細胞培養(yǎng)方法的改進[J]. 長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2012, 3(26): 171-173.

3 柳梅,張剛成,姚藝,等. 乳鼠心肌細胞的體外培養(yǎng)[J]. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 1(8): 3-4.

4 張麗娜,金國琴,郭煒,等. 原代乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)方法[J]. 中藥藥理與臨床, 2010, 26(5): 148-150.

5 伍長學(xué),范英,李新,等. 新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法的改進[J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2009, 1(32): 1-4.

6 張琳,李東野,王志榮,等. 新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法的改良[J]. 徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2008, 28(5): 303-306.

7 李博,吳慧穎,樸虎林,等. 新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法的改良[J]. 中國實驗診斷學(xué), 2012, 2(16): 200-203.

8 龐勇軍,孫莉,謝文君,等. 新生大鼠心肌細胞分離、純化及培養(yǎng)方法的改進[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報, 2014, 4(31): 520-523.

9 李志軍,曹雪濱. 新生大鼠原代心肌細胞的培養(yǎng)[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2012, 1(29): 11-17.

10陶靜,馬依彤,李曉梅,等. 原代乳鼠心肌細胞培養(yǎng)方法的改進[J]. 中華心血管病雜志, 2014, 42(1): 53-56.

11Simpson P, Savion S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol[J]. Circ Res,1982,50(1): 101-116.

An improved method of isolation and culture myocardial cells in neonatal rat*

Cheng Jun, Zeng Xiao-rong, Tan Xiao-qiu, Li Peng-yun, Wen Jing, Chen Lin-lin, Yang Yan△

(Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, and the Institute of Cardiovascular Research, South-West Medical University, Sichuan Luzhou 646000)

Objective：To investigate a stable and efficient isolation and culture rat myocardial cells in rat neonatal, to provide premise and guarantee for many experiments to study various kinds of electrophysiological mechanism on single myocardial cells. Methods: Rat myocardial cells were digested using two step method with trypsin and collagenase II in newborn SD rat aged 1-3 days. All collected myocardial cells were differential cultured, added 5-5-bromodeoxyuridine, and cultured in high glucose DMEM to get the strong three-dimensional sense of rat myocardial cells. Results: Myocardial cells with high survival rate, high purity, good refraction, good refraction,strong dimensional sense and rhythmic beat could be obtained after trypsin and collagenase digestion and high glucose DMEM cultivation. Conclusion: We have successfully established a simple effective and stable method for the isolation of neonatal rat cardiac muscle cells, which provides a good single cell for the future study of the function and basic electrophysiological properties of neonatal rat cardiac muscle cells, which can be widely used in various heart disease studies.

Neonatalrat; Cardiac muscle cells

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：81173661)，瀘州市-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合專項(編號：2013LZLY-J49)

程俊，女，副研究員，主要從事心血管電生理研究，Email：lzcj1221@sina.com。

△通訊作者：楊艷，女，研究員，主要從事心肌電生理、藥理學(xué)研究，Email：wyangyan@gmail.com。

2016-9-7)