尤斯灌流室系統(tǒng)應(yīng)用的研究進(jìn)展

陳立峰，董晗，鄭駿，鄭天怡，宋文鋒

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 a.醫(yī)學(xué)工程科； b.衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植重點實驗室，浙江 杭州 310003；2.浙江省醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)發(fā)展中心，浙江 杭州 310003

尤斯灌流室系統(tǒng)應(yīng)用的研究進(jìn)展

陳立峰1a，董晗2，鄭駿1a，鄭天怡1a，宋文鋒1b

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 a.醫(yī)學(xué)工程科； b.衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植重點實驗室，浙江 杭州 310003；2.浙江省醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)發(fā)展中心，浙江 杭州 310003

尤斯灌流室（Ussing Chamber） 由丹麥學(xué)者Ussing研究NaCl主動轉(zhuǎn)運時首次介紹于世，其簡單實用性使其在生物醫(yī)學(xué)界受到越來越多的關(guān)注。Ussing Chamber為研究離子、營養(yǎng)物質(zhì)、藥物在各種上皮組織的轉(zhuǎn)運提供了一個生理系統(tǒng)，其主要是通過微電極來檢測整個細(xì)胞膜的跨膜電位差、短路電流、跨膜電阻。隨著科技的不斷進(jìn)步，Ussing Chamber的用途也越來越廣泛。本文結(jié)合國內(nèi)外學(xué)者對其研究進(jìn)行了簡單綜述，簡要介紹其基本結(jié)構(gòu)、原理、應(yīng)用及未來發(fā)展趨勢。

Ussing Chamber；胃腸道屏障功能；營養(yǎng)運輸；藥物吸收；胎盤屏障

引言

隨著丹麥學(xué)者Hans H. Ussing將尤斯灌流室（Ussing Chamber）引入科學(xué)研究以來，這項技術(shù)受到越來越多的關(guān)注，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，其應(yīng)用也越來越廣泛，由最初的研究離子的主動轉(zhuǎn)運已擴(kuò)展到藥學(xué)、畜禽營養(yǎng)與生理學(xué)研究等各個領(lǐng)域[1-4]。該技術(shù)的工作原理主要是通過微電極來檢測整個細(xì)胞膜的電生理變化情況，從而測量離子、營養(yǎng)物質(zhì)及藥物在各種上皮組織的轉(zhuǎn)運，幾乎可以應(yīng)用于動物體內(nèi)各種上皮組織，包括生殖道內(nèi)分泌上皮、外分泌腺體上皮、胃腸道上皮、呼吸道上皮、眼以及脈絡(luò)膜等，甚至包括培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的研究[2-3]。本文主要介紹Ussing Chamber的基本構(gòu)造和應(yīng)用原理,并在此基礎(chǔ)上主要論述Ussing Chamber系統(tǒng)在胃腸道屏障功能、營養(yǎng)物質(zhì)及藥物吸收和轉(zhuǎn)運領(lǐng)域、睫狀體房水分泌及體外構(gòu)建胎盤屏障的研究進(jìn)展，以及研究過程中存在的問題和可能的解決方案。

1 Ussing Chamber的結(jié)構(gòu)及工作原理

1.1 Ussing Chamber的結(jié)構(gòu)

Ussing Chamber系統(tǒng)（圖1）主要由灌流室和電路系統(tǒng)兩個部分組成，另外還有配套的組件，其通過電子計算機(jī)來處理分析數(shù)據(jù)結(jié)果。根據(jù)不同的實驗?zāi)康?，灌流室一般分?、4、6、8室4種類型。同時又有兩種灌流方式可供選擇：循環(huán)式和持續(xù)式。循環(huán)式灌流室包括1個U形管道系統(tǒng)和2個半室，管道系統(tǒng)主要用于加熱和充入氣體（CO2、O2或N2），兩個半室中間是一個可嵌合組織樣本且可移動的插件。持續(xù)式灌流室包括兩個溶液貯器，通過聚乙烯管道將溶液引入兩個半室，溶液溫度由配套加熱裝置加以調(diào)節(jié)。電路系統(tǒng)可以測定電流、電壓、電阻、阻抗和電容等。配套系統(tǒng)包括恒溫水浴箱、5% CO2和95% O2混合氣體循環(huán)系統(tǒng)和注射器等[4]。

圖1 Ussing Chamber基本原理

1.2 Ussing Chamber的應(yīng)用原理

上皮組織由密集排列的上皮細(xì)胞和少量細(xì)胞間質(zhì)組成,具有極性和緊密連接，這也是區(qū)別于其他組織的兩大特征。緊密連接又稱閉鎖小帶，屬于不通透連接，普遍存在于脊椎動物體內(nèi)各種上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，多見于胃腸道上皮細(xì)胞之間的連接部位。在相鄰的兩個細(xì)胞有緊密連接的區(qū)域，質(zhì)膜形成索條，索條呈圓筒狀，借助特定的蛋白質(zhì)和二價陽離子，使兩個索條緊密并列在一起，從而封閉了細(xì)胞之間的間隙，使大分子物質(zhì)難以通透，而只允許水分子和離子從索條銜接處的小孔透過。

緊密連接的形狀和滲透性決定上皮組織的完整性以及對物質(zhì)的阻抗力（Rt），因此在實際試驗中，通常測量Rt來檢測或者評價組織完整性以反映組織的活性。上皮組織Rt可用以下公式[5]描述：

其中r為組織電阻系數(shù)，L為組織長度或厚度，而A為組織面積。

而對于組織阻抗Rt，在實際操作中，通過電路系統(tǒng)向上皮組織施加一個電壓V，相應(yīng)的會引起電流的變化ΔI，通過歐姆定律就可以得出組織的電阻，這就是所謂的電壓鉗，如果向上皮組織施加電流則為電流鉗。

跨上皮電壓（Vt）是測量組織活性的另一個指標(biāo)，通常認(rèn)為Vt＜4 mV的腸黏膜被認(rèn)為是活性弱的組織。上皮細(xì)胞膜頂側(cè)和基底側(cè)離子的非均勻分布是產(chǎn)生Vt的先決條件。就某一具體上皮組織而言，Vt的計算公式為：

其中Va為細(xì)胞膜頂側(cè)電勢，Vb為基底側(cè)電勢。

短路電流（Isc）是反映組織吸收和分泌離子能力的另一個指標(biāo)。當(dāng)試驗裝置中被測組織短路時，即Vt被鉗制為0 mV時，產(chǎn)生的電流即為Isc。這種電流因生物膜上離子流動而產(chǎn)生，故產(chǎn)生的Isc即為穿越上皮組織的主動離子流總和。因此有學(xué)者認(rèn)為單位時間的離子流量能更準(zhǔn)確地反映組織活性。

Ussing Chamber系統(tǒng)的基本功能是進(jìn)行上皮細(xì)胞膜離子泵功能和抗?jié)B阻抗的測定。

2 Ussing Chamber的應(yīng)用

2.1 Ussing Chamber在胃腸道屏障功能中的運用

腸道屏障功能主要是由腸黏膜屏障來實現(xiàn)的。腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障與生物屏障共同構(gòu)成，其中最為關(guān)鍵的是機(jī)械屏障和免疫屏障。完整的腸道屏障是防止腸道內(nèi)有害物質(zhì)和病原體進(jìn)入機(jī)體內(nèi)環(huán)境并維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障，是機(jī)體防御功能的一道重要防線。

易非躺在飄著雪花的非易閣里，睜眼看著窗外，有雪花映照，并不算太黑，還能朦朦朧朧看得見從天而降的飛舞著的雪花。這飄忽而至的冬天的精靈啊，你是那么輕快、灑脫、自由，可惜我不能。

機(jī)械屏障又稱為物理屏障，主要由腸黏膜表面的粘液層、腸上皮細(xì)胞及其緊密連接、黏膜下固有層等組成。腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性決定腸黏膜機(jī)械屏障功能的健全程度。

化學(xué)屏障是腸道分泌的胃酸、膽汁、各種消化酶、溶菌酶、粘多糖、糖蛋白和糖脂等化學(xué)物質(zhì)，也具有屏障作用。

免疫屏障即腸道的免疫防御系統(tǒng)，其主要由腸道相關(guān)淋巴組織構(gòu)成。腸道相關(guān)淋巴組織分為組織性淋巴樣組織及散在于整個腸壁的淋巴細(xì)胞，主要包括PP結(jié)、腸黏膜孤立淋巴小結(jié)、彌散于腸黏膜的巨噬細(xì)胞、T輔助細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞等[6]。腸道免疫系統(tǒng)中起核心作用的是分泌性IgA。

生物屏障是動物腸道內(nèi)存的著多種大量的正常微生物，這些共生的菌群通過與腸黏膜黏附或者結(jié)合，形成生物屏障。正常菌群在動物內(nèi)環(huán)境中的定居、繁殖與宿主保持著共生的關(guān)系，為宿主提供營養(yǎng)成分，維持腸道微生態(tài)平衡[7]。

很多研究者認(rèn)為Ussing Chamber是研究胃腸道屏障功能的金標(biāo)準(zhǔn)[2,8-9]，胃腸屏障功能通?？蓮碾x子分泌、滲透性和黏液分泌等3個方面進(jìn)行評價[2-3,10-12]。用Ussing Chamber對胃腸屏障功能進(jìn)行的離體研究主要集中在胃腸道上皮通透性、內(nèi)毒素及細(xì)菌移位的途徑和機(jī)制以及谷氨酰胺（Gln）和益生菌對腸道屏障功能的改善等方面[10]；通過檢測同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的大分子物質(zhì)通過胃腸道上皮的比例已成為研究胃腸道通透性的主要途徑。趙博欣等[13]利用體外Ussing Chamber，分別評價50 μmol/L芹菜素及柚皮素經(jīng)空腸、回腸和結(jié)腸黏膜經(jīng)時吸收方向（M-S）與分泌方向（S-M）的累計透過率和表觀滲透系數(shù)（Papp），為芹菜素和柚皮素口服制劑的開發(fā)以及臨床合理用藥提供依據(jù)。Sun等[14]利用Ussing Chamber研究全腸外營養(yǎng)（Total Parenteral Nutrition，TPN）對大鼠小腸通透性的影響，其試驗結(jié)果表明TPN將提高大鼠小腸對3H-甘露醇的通透率。TPN增加胃腸道對大分子物質(zhì)的通透性與胃腸道免疫類物質(zhì)的下降密切相關(guān)。陳紅旗等[15]利用Ussing Chamber研究酪酸梭菌二聯(lián)活菌對結(jié)直腸癌患者圍手術(shù)期的腸道通透性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，試驗組結(jié)直腸黏膜跨上皮電阻無顯著升高[(28.3±5.2)Q·c∶(22.1±4.7) Q·c，P=0.1302]，結(jié)直腸黏膜2 h甘露醇通透率顯著降低[(0.91±0.17)%∶(1.65±0.33)%，P＜0.001]。該研究表明，結(jié)直腸癌患者圍手術(shù)期應(yīng)用益生菌制劑（酪酸梭菌二聯(lián)活菌）能增強腸黏膜屏障功能。宋娟[16]利用Ussing Chamber測定腸道電阻值、熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖通透性從而來探討益生菌和寡糖對熱應(yīng)激肉雞腸道功能屏障的影響。饒艷霞等[17]利用Ussing Chamber來研究低蛋氨酸飲食對實驗性結(jié)腸炎大鼠腸粘膜通透性的影響。

2.2 Ussing Chamber在藥物吸收研究中的應(yīng)用

2.3 Ussing Chamber在營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運中的應(yīng)用

Ussing Chamber為研究胃腸道物質(zhì)轉(zhuǎn)運效率提供了快捷且有效的途徑，研究主要集中在葡萄糖、氨基酸以及礦物元素等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運方面[24-35]。葡萄糖經(jīng)腸道上皮細(xì)胞頂膜Na+-葡萄糖-載體蛋白主動轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞，并由基底膜葡萄糖轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運進(jìn)入血液。葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中Na+跨膜轉(zhuǎn)運產(chǎn)生的離子電流，為Ussing Chamber技術(shù)在葡萄糖轉(zhuǎn)運研究中的應(yīng)用創(chuàng)造了條件，葡萄糖的轉(zhuǎn)運可誘導(dǎo)短路電流的形成，且Isc的產(chǎn)生與Na+依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運載體有關(guān)。Garcia-Amado等[36]利用Ussing Chamber技術(shù)研究了鵪鶉腸道D-葡萄糖轉(zhuǎn)運，在黏膜側(cè)加入D-葡萄糖，之后加入根皮苷（phloridzin），試驗記錄Isc，發(fā)現(xiàn)D-葡萄糖增加Isc；根皮苷降低Isc，抑制D-葡萄糖轉(zhuǎn)運。氨基酸經(jīng)腸道上皮細(xì)胞頂膜Na+-氨基酸-載體蛋白主動轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞，Albin等[37]用改良Ussing Chamber研究了胃腸道上皮對谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、L-蘇氨酸在小腸組織（十二指腸，空腸，回腸）的轉(zhuǎn)運。與葡萄糖的轉(zhuǎn)運類似，脂肪酸的轉(zhuǎn)運也需要脂肪酸轉(zhuǎn)運載體的介導(dǎo)，Kirat等[38]用該系統(tǒng)研究表明，山羊瘤胃中單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1對短鏈脂肪酸的吸收起著直接的作用。

2.4 Ussing Chamber在眼睫狀體上皮離子轉(zhuǎn)運中的應(yīng)用

睫狀體上皮細(xì)胞是房水生成的部位，由兩層頂端相對的細(xì)胞構(gòu)成，分別是位于房水一側(cè)的非色素上皮細(xì)胞（NPE）和位于睫狀體基質(zhì)一側(cè)的色素上皮細(xì)胞（PE）。目前人們認(rèn)為睫狀體上皮跨細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運是房水主動分泌的動力之一，基質(zhì)中的溶質(zhì)（離子）從基質(zhì)進(jìn)入色素上皮細(xì)胞，然后通過縫隙連接進(jìn)入非色素上皮細(xì)胞，最后被分泌進(jìn)入房水。而水分子則隨著離子的運輸被動地進(jìn)入房水[39]。凌運蘭[40]采用改良的Ussing Chamber連續(xù)灌注系統(tǒng)電生理檢測方法，對新鮮離體的人眼睫狀體上皮進(jìn)行電參數(shù)的測量，并應(yīng)用不同離子濃度液體替代、Na+-K+-ATP酶阻滯劑、Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運體抑制劑、Cl-通道阻滯劑及縫隙連接阻滯劑等對睫狀體血液側(cè)和/或房水側(cè)進(jìn)行灌注，觀察這些藥物對人眼睫狀體上皮電參數(shù)的影響。

2.5 Ussing Chamber在體外胎盤屏障建立中的應(yīng)用

胎盤屏障是胎盤絨毛組織與子宮血竇間的屏障，胎盤是由母體和胎兒雙方的組織構(gòu)成的，由絨毛膜、絨毛間隙和基蛻膜構(gòu)成。絨毛膜內(nèi)含有臍血管分支，從絨毛膜發(fā)出很多大小不同的絨毛，這些絨毛分散在母體血之中，并吸收母血中的氧和營養(yǎng)成分，排泄代謝產(chǎn)物。大部分藥物透過胎盤的機(jī)制仍是被動擴(kuò)散，但葡萄糖等可按促進(jìn)擴(kuò)散的方式轉(zhuǎn)運，一些金屬離子如Na+、K+，內(nèi)源性物質(zhì)（如氨基酸等），維生素類及代謝抑制劑可按主動轉(zhuǎn)運的方式通過胎盤。Song等[41]用該技術(shù)建立了體外胎盤屏障模型。該研究顯示β-人絨毛膜促性腺激素（β-hCG）在Ussing Chamber里面的分泌水平是（274.13±13.52）mIU/mL，顯著地高于在培養(yǎng)皿中的水平，并且β-hCG在48 h內(nèi)持續(xù)分泌。RHO123的表觀滲透系數(shù)值從母體測到胎兒側(cè)是（26.34±1.87）nm/s，但是在加入維拉帕米之后增加到（289.55±6.02）nm/s。熒光素的表觀滲透系數(shù)值是（3.42±0.24）×10-3nm/s。相比之下，異硫氰酸熒光素-葡聚糖的Papp值是（3.93±0.08）×10-5nm/s。這表明在Ussing Chamber里的胎盤片有胎盤的活性，因此是一種有價值的體外胎盤模型。

2.6 Ussing Chamber在其他方面的應(yīng)用

Ussing Chamber系統(tǒng)的研究對象為上皮組織，而上皮組織廣泛分布在身體表面和體內(nèi)各種囊、管、腔的內(nèi)表面。上皮組織具有保護(hù)、分泌、吸收和排泄等功能，不同部位的不同上皮，其功能各有差異。因此，Ussing Chamber的研究對象可擴(kuò)展到機(jī)體任一上皮組織。就某一具體上皮組織而言，可研究的內(nèi)容也多樣化，從藥物篩選到屏障功能、免疫功能、物質(zhì)吸收與代謝以及分泌和排泄等。Brockmeier等[42]研究了子宮上皮對離子的轉(zhuǎn)運；Lennern?s[43]用該系統(tǒng)預(yù)測人類體內(nèi)口腔藥物吸收的情況；Nadine等[44]用該系統(tǒng)研究了視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運。

3 討論Ussing Chamber存在的問題及解決方案

Ussing Chamber的一個主要問題就是用一個相對較少較簡單的數(shù)據(jù)結(jié)果去描述較復(fù)雜的腸粘膜的生理系統(tǒng)。腸黏膜通過各種方式相互影響。例如，細(xì)胞接觸、分泌體液因子等，而這些在應(yīng)用Ussing Chamber進(jìn)行測量的時候都不會被察覺甚至考慮到[33,45]，因此測量結(jié)果與體內(nèi)實際情況還是有很大出入。

其次，從獲取腸道上皮到進(jìn)行Ussing Chamber檢測通常需要至少1 h，但是離體的腸道上皮經(jīng)過一段時間后，因缺乏血液及神經(jīng)供應(yīng)，在手術(shù)及鑲嵌過程中其形態(tài)結(jié)構(gòu)容易遭到破壞，因而生物活性不可避免會有所下降[10]。孫志洪等[10]建議，在轉(zhuǎn)運溶液中添加組織活性保鮮劑從而保持或減緩腸道上皮組織形態(tài)學(xué)和生理活性的下降。有其他學(xué)者提出對轉(zhuǎn)運溶液進(jìn)行腸道上皮生理環(huán)境（溫度、pH、離子平衡等）的模擬也許能有效解決這一問題[6]。但實際效果還有待進(jìn)一步研究。

利用Ussing Chamber研究物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程中存在轉(zhuǎn)運溶液滲漏情況，這對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性有很大的影響。Kottra等[46]專門進(jìn)行過Ussing Chamber邊緣滲漏的定量與校正研究，其得出的校正公式具有較好的參考意義。

此外，在實驗過程中Ussing Chamber系統(tǒng)通常采用放射性同位素對所研究的物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。然而，放射性同位素的高昂價格及其種類限制，也使得Ussing Chamber的研究對象受到制約。可以考慮用非同位素物質(zhì)進(jìn)行示蹤，比如熒光素、探針等[6]。

4 結(jié)論

Ussing Chamber是一種首先用于研究離子通道而逐步發(fā)展起來的技術(shù)。由于它能比較真實地反映各種上皮細(xì)胞在體內(nèi)的實時狀態(tài),并且具有簡單、快捷的特點，相信隨著廣大學(xué)者對這一技術(shù)的關(guān)注，Ussing Chamber必將在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。

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Progress in Research on the Application of Ussing Chamber

CHEN Li-feng1a, DONG Han2, ZHENG Jun1a, ZHENG Tian-yi1a, SONG Wen-feng1b
1. a. Department of Medical Engineering; b. Key Laboratory of Combined Multi-Organ Transplantation, the First Aff liated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou Zhejiang 3100032, China; 2. Medicine Economic Development Center of Zhejiang Province, Hangzhou Zhejiang 310003, China

The Ussing Chamber was developed by the Danish biologist Ussing as a mean to understand the phenomenon of active NaCl transport, which had attracted more and more attention among the biomedical industry for its simplicity and practicability. The Ussing Chamber provided a physiological system to measure the transport of ions, nutrients and drugs across various epithelial tissues. It measured the trans-epithelial potential, short-circuit current and trans-epithelial resistance of the plasm membrane through microelectrodes. With the progress of science and technology, the Ussing Chamber had become more and more widely applied. This paper reviewed the researches about Ussing Chamber from national and international studies in recent years, and introduced the design, structure, principle, and its application in the field of biomedicine, as well as its application and development trend.

Ussing chamber; gastrointestinal barrier function; nutrition transport; drug absorption; placental barrier

R574

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.11.018

1674-1633(2016)11-0073-05

2015-11-10

2016-01-11

作者郵箱：clf_521414@163.com