高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜法測定海洋微藻藻粉中的8種脂溶性毒素

高莉媛, 王艷龍, 陳軍輝, 王 帥, 史小星, 石洪華, 鄭 立, 2

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高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜法測定海洋微藻藻粉中的8種脂溶性毒素

高莉媛1, 王艷龍1, 陳軍輝1, 王 帥1, 史小星1, 石洪華1, 鄭 立1, 2

(1. 國家海洋局第一海洋研究所, 山東青島266061; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室, 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071)

建立了利用高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜(HPLC-ESI-IT-MS)測定海洋微藻藻粉中8種典型脂溶性毒素的分析方法。藻粉樣品經(jīng)超聲細(xì)胞破碎后, 采用超聲波輔助提取法對藻毒素進(jìn)行提取, 用HPLC-ESI-IT-MS多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式對各種毒素(包括大田軟海綿酸(OA)、鰭藻毒素1(DTX-1)、扇貝毒素2(PTX-2)、蝦夷扇貝毒素(YTX)、原多甲藻酸1(AZA1)原多甲藻酸2(AZA2)、羅環(huán)內(nèi)酯毒素(SPX), 米氏裸甲藻毒素(GYM))進(jìn)行測定。8種脂溶性藻毒素均在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(2均在0.991以上), 檢出限均介于0.085~1.315 pg之間, 加標(biāo)回收率在88.5%~111.4%之間, 方法重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在4.82%~10.17%范圍。應(yīng)用該方法對利瑪原甲藻干藻粉中的毒素進(jìn)行了測定, 分析結(jié)果良好, 說明本方法是海洋微藻藻粉中脂溶性藻毒素測定的有效方法。

高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜; 腹瀉性貝毒; 海洋微藻

海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的最主要初級生產(chǎn)者, 具有種類多、數(shù)量大、繁殖速度快等特點(diǎn), 在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起著極其重要的作用[1]。海洋微藻也是一類十分重要的海洋生物資源, 許多海洋微藻含有豐富的蛋白質(zhì)、天然維生素、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸、多糖以及其他結(jié)構(gòu)獨(dú)特的初級或次級代謝產(chǎn)物。近幾十年來, 人們逐漸注重海洋微藻資源開發(fā), 在生物質(zhì)能源、食品保健品、醫(yī)藥和禽畜養(yǎng)殖業(yè)等方面得到了廣泛的開發(fā)和利用[2-4]。然而, 在種類眾多的海洋微藻中, 有些海洋微藻可以產(chǎn)生生物毒素, 這些生物毒素可以引起人類產(chǎn)生麻痹性、痢疾性、神經(jīng)性和溶血性等中毒癥狀[5]。迄今為止, 已發(fā)現(xiàn)的海洋微藻生物毒素及其衍生物約有200多種[6], 按溶解性質(zhì)可分為水溶性毒素和脂溶性毒素, 其中脂溶性毒素約占90%, 在全球范圍內(nèi)分布廣泛, 影響巨大。在這些脂溶性毒素中, 特別是大田軟海綿酸 (OA)及其衍生物(DTXs), 蝦夷扇貝毒素(YTXs), 原多甲藻酸(AZAs), 扇貝毒素 (PTXs), 和羅環(huán)內(nèi)酯毒素 (SPXs)等脂溶性毒素較為常見, 因此, 建立針對干藻粉中多種典型脂溶性藻毒素進(jìn)行檢測的高效方法, 并用于海洋微藻藻粉中常見脂溶性藻毒素的檢測, 對保障以藻粉為原料開發(fā)的食品、保健品或飼料產(chǎn)品的食用安全性具有重要意義。

用于脂溶性藻毒素檢測的分析方法有小白鼠生物分析法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[7]。其中LC-MS/MS法靈敏度高、選擇性好, 是最理想的脂溶性藻毒素檢測方法。目前, 該方法已用于海產(chǎn)品[8]、海洋赤潮藻[9-10]、海水[11]中多種脂溶性藻毒素的測定, 而針對海洋微藻干藻粉的檢測研究鮮有報(bào)道。本研究以8種常見典型脂溶性藻毒素為目標(biāo)化合物, 通過對樣品前處理實(shí)驗(yàn)條件及 HPLC-ESI-IT-MS分析條件的優(yōu)化, 建立了適用于海洋微藻干藻粉中8種典型脂溶性藻毒素同步測定的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

1200型高效液相色譜儀, 配有四元泵, 可變波長檢測器(VWD), 自動進(jìn)樣器等(美國Agilent公司); 6320型離子阱質(zhì)譜儀, 配有電噴霧(ESI)離子源(美國Agilent公司); KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司); R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司); Himac CR22GII 高速大容量冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司); BSA224S-CW型電子天平(德國Sartorius公司); Milli-Q(18.2 MΩ) 超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore 公司); JY92-IIDN型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

AZA1、AZA2、SPX1、DTX1、OA、YTX、PTX2和GYM標(biāo)準(zhǔn)備品(購于加拿大國家海洋研究中心), 質(zhì)譜純氨水(Fluka公司); 色譜純乙腈和甲醇(美國ACS公司); 水為自制Milli-Q超純水。實(shí)驗(yàn)所用含有毒素的利瑪原甲藻(干藻粉)(含有OA和DTX-1兩種毒素)和不含毒素的干藻粉(作為樣品空白), 均為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)獲得海洋微藻藻體, 然后通過冷凍干燥得到干藻粉。

1.2 對照品溶液的配置

取8種毒素(OA、YTX、DTX-1、AZA1、AZA2、GYM、SPX1、PTX2)標(biāo)準(zhǔn)品各1瓶(0.5 mL), 分別用甲醇稀釋后轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中準(zhǔn)確定容, 振蕩搖勻, 得到8種典型脂溶性毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(單標(biāo))。按照一定的比例分別吸取相應(yīng)的毒素OA、YTX、DTX-1、AZA1、AZA2、GYM、SPX1和 PTX2單標(biāo)儲備液, 置于10 mL容量瓶中并用甲醇稀釋定容, 得8種典型毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液, 其中OA、YTX、DTX-1、AZA1、AZA2、GYM、SPX1、PTX2濃度分別為6.843、26.30、25.77、123.7、25.66、5.003、56.42、3.436 μg/L, 所有混標(biāo)溶液置于–20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取一定量的海洋微藻干藻粉, 置于10 mL離心管中, 加入6 mL甲醇, 首先采用超聲破碎儀細(xì)胞破碎3 min, 再采用超聲輔助提取30 min, 然后以5000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min, 將藻體與上清液分離, 再對藻體進(jìn)行第二次超聲輔助提取30 min, 合并兩次提取液, 定容到25 mL的容量瓶中, 吸取1 mL 定容液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾并注入樣品瓶中, 進(jìn)樣前根據(jù)藻粉中毒素的含量對樣品溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋, 確保樣品濃度落在線性范圍之內(nèi)。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

液相色譜條件: 采用ZORBAX Extend-C18色譜柱(3 mm×150 mm, 3.5mm, 美國Agilent公司), 流動相A為純水, B為90%的乙腈(均含有6.6 mmoL/L的氨水), 二元梯度淋洗: T: 0-15-20-45-48 min, 流動相B%: 20%-30%-47.5%-100%-20%, 流速: 0.4 mL/min, 進(jìn)樣體積為10 μL, 柱溫: 室溫(20℃±2℃)。

質(zhì)譜條件: 電噴霧電離源, 霧化氣壓力(N2)40 psi, 干燥氣(N2)流速11 L/min, 干燥氣溫度350℃, 毛細(xì)管電壓4000V, 質(zhì)量掃描范圍100~1300。根據(jù)各組分的色譜保留時間和一級、二級質(zhì)譜特征優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù), 按時間分段用多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式對各組分進(jìn)行質(zhì)譜檢測; OA、PTX-2、SPX1、AZA1、AZA2、GYM采用正離子模式(ESI+); DTX-1和YTX采用負(fù)離子模式(ESI-), 各化合物的保留時間、MRM選擇離子以及目標(biāo)離子、碰撞能量等參數(shù)見表1。

1.5 定性定量方法

通過比較藻粉樣品與毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜 (EIC)峰保留時間及二級質(zhì)譜圖的特征定性離子和定量離子進(jìn)行目標(biāo)化合物的定性。藻粉樣品中目標(biāo)化合物二級質(zhì)譜分析特征離子與標(biāo)準(zhǔn)品二級質(zhì)譜特征離子相吻合。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線, 以外標(biāo)法對藻粉樣品中的毒素進(jìn)行定量。在MRM模式下選擇定量離子計(jì)算目標(biāo)化合物EIC峰面積, 代入線性曲線計(jì)算樣品濃度。試樣溶液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在本方法線性范圍內(nèi)。

表1 8種脂溶性藻毒素離子阱質(zhì)譜分析(MRM模式)參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

在前期研究中[11], 采用HPLC-ESI-IT-MS實(shí)現(xiàn)了對海水中3種典型脂溶性毒素的有效分離和檢測, 該方法采用堿性流動相分離體系, 據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道, 堿性流動相分離體系有利于提高不同系列脂溶性毒素的分離。在此基礎(chǔ)之上, 選用堿性流動相(pH為11)分離體系, 通過對梯度洗脫程序的進(jìn)一步優(yōu)化, 獲得了適用于海洋微藻藻粉中8種典型脂溶性藻毒素有效分離的色譜條件, 在最佳色譜分離條件下, 對8種典型脂溶性藻毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了一級質(zhì)譜全掃描分析, 然后, 以MRM模式二級質(zhì)譜分析定量離子的靈敏度為評價指標(biāo), 對二級質(zhì)譜分析條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化, 以確定各化合物定量分析的最佳儀器參數(shù)(表1), 各化合物MRM模式二級質(zhì)譜分析EICs見圖1, 可以看出各化合物分離良好。

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

為了保證樣品提取優(yōu)化結(jié)果能反映微藻藻粉樣品中毒素的真實(shí)提取效率, 本研究使用含有OA和DTX-1毒素的干藻粉樣品, 以O(shè)A和DTX-1的提取效率為評價指標(biāo), 采用單因子實(shí)驗(yàn)法, 對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

在樣品提取過程中選擇合適的提取溶劑既能促進(jìn)目標(biāo)化合物的提取, 又能消除一些不必要的干擾基質(zhì)的影響。根據(jù)脂溶性藻毒素的化學(xué)性質(zhì), 選取了6種提取劑(異丙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醇、丙酮)在室溫(25℃±2℃)條件下超聲波輔助提取30 min, 對微藻藻粉中的OA和DTX-1毒素進(jìn)行了提取。提取結(jié)果(圖2)顯示, 甲醇對這2種脂溶性藻毒素的總體提取效果最好, 要明顯高于其它提取溶劑, 所以選擇甲醇作為提取劑。

在提取過程中為了降低藻細(xì)胞壁對目標(biāo)化合物包裹的影響, 使目標(biāo)毒素提取效果更充分, 考察了在提取之前增加超聲細(xì)胞破碎處理對2種毒素提取效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 當(dāng)細(xì)胞破碎時間達(dá)到3?min時, 2種目標(biāo)毒素能得到充分提取, 與不采用細(xì)胞破碎處理相比, 2種目標(biāo)化合物的提取率分別增加了34.93%和30.19%, 說明微藻細(xì)胞壁的存在會影響細(xì)胞內(nèi)毒素的溶出, 因此, 有必要在提取過程中增加細(xì)胞破碎處理。

在以上的提取條件下通過一次超聲提取, 目標(biāo)化合物并不能得到完全提取, 因此, 考察了不同提取次數(shù)對提取效果的影響, 結(jié)果如表2所示?？梢钥闯霎?dāng)提取2次后, 兩種毒素提取效率均達(dá)到98.0%以上, 為了節(jié)約提取時間和提取溶劑, 最后選擇超聲提取2次。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 儀器精密度

取毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液于進(jìn)樣小瓶中, 連續(xù)進(jìn)樣6次, 每次進(jìn)樣10 μL, 得到各化合物提取離子峰的峰面積及保留時間, 算出6次進(jìn)樣分析的峰面積及保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD), 8個化合物峰面積RSD均小于等于9.57%, 保留時間的RSD均小于等于1.20%, 說明儀器方法具有較好的精密度。

表2 提取次數(shù)對兩種脂溶性藻毒素提取效率的影響(n=3)

2.3.2 專屬性

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下, 測定甲醇, 空白藻粉, 以及加入毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的空白藻粉, 結(jié)果只在添加了脂溶性藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品的藻粉樣品中檢測出了8種脂溶性藻毒素, 說明該方法具有良好的專屬性。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

海洋微藻粉成分復(fù)雜, 其中包含的雜質(zhì)可能會影響目標(biāo)分析物的離子化效率, 造成目標(biāo)化合物質(zhì)譜信號的抑制或增強(qiáng), 影響方法檢測的靈敏度和結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了評價粗提液中基質(zhì)對目標(biāo)化合物質(zhì)譜分析的影響, 采用空白藻粉樣品的提液配制8種脂溶性藻毒素混標(biāo), 以甲醇配制的同一濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對比, 通過MS/MS分析測得各目標(biāo)化合物的峰面積?；|(zhì)效應(yīng)(ME)按公式計(jì)算:

(%)=(s–x)/s×100 (1)

式中,x為空白藻粉提取液配制毒素混標(biāo)中目標(biāo)化合物的峰面積;s表示相同濃度水平甲醇配置標(biāo)準(zhǔn)溶液中毒素的峰面積。基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3, “–”表示信號增強(qiáng), “+”表示信號抑制, 基質(zhì)對YTX和GYM檢測的影響較大, 對GYM 的信號抑制率為27.01%, 對YTX 的信號增強(qiáng)率為29.47%, 而對其他6種毒素的影響相對較小(均未超過7.19%)。說明藻粉提取液中的基質(zhì)組分對各目標(biāo)化合物有不同程度的抑制作用, 基質(zhì)影響不可忽略。

2.3.4 檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線

由于基質(zhì)效應(yīng)不可忽視, 標(biāo)準(zhǔn)品在甲醇溶液中的質(zhì)譜響應(yīng)與其在實(shí)際樣品基質(zhì)中的響應(yīng)不同, 因此, 采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量, 以降低基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。取8種脂溶性毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, 使用空白干藻粉提取液對其進(jìn)行梯度稀釋, 稀釋倍數(shù)分別為1、2、5、10、20、50、100, 獲得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。以所測毒素的峰面積為縱坐標(biāo), 所測毒素的質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。將信噪比為3對應(yīng)的質(zhì)量作為方法的檢出限(LOD), 信噪比為10對應(yīng)的質(zhì)量作為方法的定量限(LOQ)。

表3給出了8種毒素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、LOD、LOQ等。從表3結(jié)果可以看出, 各種毒素相關(guān)系數(shù)(2)均大于0.991, 表明各化合物在定量線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好, 能對目標(biāo)化合物準(zhǔn)確定量。整體而言方法的靈敏度能滿足實(shí)際藻粉樣品測定的靈敏度要求。

表3 線性范圍、靈敏度、重復(fù)性、回收率和基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 回收率和重復(fù)性

方法回收率的測定采用標(biāo)準(zhǔn)加入法, 平行稱取6份空白藻粉樣品, 分別添加一定量的毒素標(biāo)準(zhǔn)品(OA: 1.0 μg, YTX: 4.0 μg, DTX-1: 4.0 μg, AZA1: 4.0 μg AZA2: 1.0 μg, GYM: 1.0 μg SPX1: 1.0 μg, PTX-2: 2.0 μg),然后按2.3節(jié)樣品溶液的制備方法處理, 用2.4節(jié)色譜-質(zhì)譜條件測定加標(biāo)回收率和重復(fù)性, 測定結(jié)果見表3, 可以看出, 8種毒素的回收率在88.5%~111.4%之間, 重復(fù)性 RSD在4.82%~10.17%范圍內(nèi), 表明該方法具有較好的回收率和重復(fù)性, 能滿足實(shí)際干藻粉樣品中各種脂溶性藻毒素的測定要求。

2.4 利瑪原甲藻藻粉中毒素含量測定

采用已建立的分析方法, 對實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)獲得的利瑪原甲藻干粉進(jìn)行檢測, 干藻粉中OA和DTX-1的HPLC-ESI-IT-MS分析提取離子流圖見圖3, 對應(yīng)的二級質(zhì)譜圖見圖4, 由圖3和圖4可以看出干藻粉提取液中OA和DTX-1的保留時間以及二級質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)對照品一致, 說明干藻粉中檢測到的這兩個化合物為OA和DTX-1。干藻粉中OA和DTX-1定量結(jié)果表明, 干藻粉中OA的含量為0.33 mg/g, DTX-1的含量為0.26 mg/g, 表明利瑪原甲藻干粉中這兩種脂溶性藻毒素含量較高。OA和DTX-1是典型的腹瀉性藻毒素, 人類食用含有這兩種毒素的食物后會引起腹瀉、腹痛等腸胃疾病[8]。因此, 用于食品、保健品和醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)的海洋微藻中即使含有少量有毒藻, 也會對人類健康造成威脅, 而針對干藻粉中多種脂溶性藻毒素進(jìn)行檢測, 對降低人類中毒風(fēng)險具有重要意義。

A. OA標(biāo)準(zhǔn)品; B.藻粉提取液中OA; C. DTX-1標(biāo)準(zhǔn)品; D. 藻粉提取液中DTX-1

A. OA standard; B. OA in the crude extract of microalgae powder; C. DTX-1 standard; D. DTX-1 in the crude extract of microalgae powder

3 結(jié)論

建立了一種高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜檢測海洋微藻干藻粉中8種脂溶性毒素的方法, 該方法操作簡單、回收率高、重復(fù)性好, 具有較強(qiáng)的適用性, 對于海洋微藻干藻粉中8種脂溶性毒素檢測能提供可行的方法。

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Determination of eight typical lipophilic algae toxins in marine microalgae powder using high-performance liquid chromato-graphy-ion trap mass spectrometry

GAO Li-yuan1, WANG Yan-long1, CHEN Jun-hui1, WANG Shuai1, SHI Xiao-xing1, SHI Hong-hua1, ZHENG Li1, 2

(1. The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 266061, China; 2. Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China)

A method involving high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization–ion trap mass spectrometry (HPLC–ESI–IT–MS) was developed to determine eight typical lipophilic algae toxins (okadaic acid (OA), dinophysistoxin-1 (DTX-1), pectenotoxin-2 (PTX-2), yessotoxin (YTX), azaspiracid1, 2 (AZA1, AZA2), spirolidel1 (SPX1), gymnodimine (GYM)) in marine microalgae powder. The powder was extracted using ultrasound-assisted extraction after the algae cell-breaking process was performed using ultrasonication. The crude extracts were then analyzed using HPLC–ESI–IT–MS in the multiple reaction monitoring mode. The results showed that the calibration curve for each lipophilic algae toxin was obtained with a good correlation coefficient (2>0.991) in its linear concentration. The detection limits of the eight target toxins ranged from 0.85 to 1.315 pg. The average recoveries of these toxins ranged from 88.5% to 111.4% with relative standard deviations in the range of 4.82%–10.17%. The proposed method was applied to determine typical lipophilic algae toxins inmarine microalgae powder, and good results were obtained. The results also indicated that this method is a useful tool for determining lipophilic algae toxins in marine microalgae powder.

High-performance liquid chromatography-ion trap mass spectrometry; Diarrhetic shellfish poisoning; Marine microalgae

(本文編輯: 康亦兼)

Dec. 25, 2015

[Shandong Provincial Natural Science Foundation, No.ZR2015PD003; National Natural Science Foundation of China-Shandong Joint Funded Project, No.U1406403; National Science & Technology Pillar Program of China, No.2013BAK12B00]

Q503 ; O657.7+2

A

1000-3096(2016)10-0113-07

10.11759/hykx20151225002

2015-12-25;

2016-05-16

山東省自然科學(xué)基金(ZR2015PD003); 國家基金委-山東省聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1406403); 國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAK12B00)

高莉媛(1991), 女, 山東海陽人, 碩士研究生, 主要從事海洋環(huán)境化學(xué)相關(guān)研究, E-mail: gaoliyuan316@foxmail.com; 陳軍輝, 通信作者, 博士, 副研究員; 電話: 0532-88966705, E-mail: jhchen@ fio.org.cn