生肌玉紅膏對(duì)深Ⅱ度燒傷模型大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞及血液循環(huán)影響的實(shí)驗(yàn)研究

于博 董小鵬

·臨床研究·

生肌玉紅膏對(duì)深Ⅱ度燒傷模型大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞及血液循環(huán)影響的實(shí)驗(yàn)研究

于博1董小鵬2

目的探討生肌玉紅膏對(duì)深Ⅱ度燒傷模型大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞及血液循環(huán)的影響。方法96只大鼠被隨機(jī)分為3組（A組、B組、C組），每組各32只，A、B組均制成深I(lǐng)I度燒傷動(dòng)物模型，A組傷后均給予生肌玉紅膏換藥，B組給予凡士林換藥，C組為正常對(duì)照組，比較3組大鼠燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)（7 d、14 d、21 d、28 d）成纖維細(xì)胞增殖指數(shù)與成纖維細(xì)胞數(shù)量、創(chuàng)面微血管數(shù)等相關(guān)指標(biāo)的變化差異。結(jié)果A、B組大鼠燒傷換藥后不同時(shí)間點(diǎn)A、B組成纖維細(xì)胞增殖指數(shù)升高、成纖維細(xì)胞數(shù)量增多、新生微血管數(shù)量增加，A組變化更為明顯（P ＜0．05）。結(jié)論生肌玉紅膏對(duì)深Ⅱ度燒傷模型大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞的增殖及血液循環(huán)重建有明顯促進(jìn)作用。

生肌玉紅膏；深Ⅱ度燒傷；大鼠；成纖維細(xì)胞；血液循環(huán)

本實(shí)驗(yàn)旨為驗(yàn)證、探索生肌玉紅膏的臨床療效與作用機(jī)制，采用大鼠深Ⅱ度燒傷動(dòng)物模型，用以觀察生肌玉紅膏對(duì)燒傷創(chuàng)面的成纖維細(xì)胞及血液循環(huán)的影響，以期為臨床用藥提供更為充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 （1）生肌玉紅膏：由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科提供；（2）白凡士林膏：南昌白云藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；（3）生理鹽水，為自行配制；（4）RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，由Gibico公司生產(chǎn)；（5）胎牛血清，由Gibico公司生產(chǎn)；（6）40 m l/kg復(fù)方乳酸鈉林格氏液，為自行配制；（7）戊巴比妥鈉，為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康清潔級(jí)成年SD大鼠96只，雌雄各48只，體質(zhì)量為（225.6±17.0）g，混合飼料單籠飼養(yǎng)。

1.1.3 器材 千分之一電子天平、生化培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、酒精燈、玻璃瓶、石棉網(wǎng)、鐵架臺(tái)等，均由天津市生物科技有限公司提供。1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立與換藥 A、B組大鼠均制成深I(lǐng)I度燒傷動(dòng)物模型，制作方法如下：剃刀剃去背毛，腹腔內(nèi)給予3%戊巴比妥鈉（0.15 ml/100 g）進(jìn)行麻醉，其后以玻璃瓶裝適量的蒸餾水放在墊有石棉網(wǎng)的鐵架臺(tái)之上，下方以酒精燈加熱煮沸，玻璃瓶蓋上預(yù)開1.5 cm×1.5 cm口，麻醉后大鼠脫毛部位放在玻璃瓶蓋開口處緊貼燙8 s（以秒表計(jì)時(shí)），制成深Ⅱ度燒傷模型（均用病理切片染色診斷證實(shí)），再向大鼠腹腔注射40 ml/kg的復(fù)方乳酸鈉林格氏液。A組傷處涂以生肌玉紅膏，B組涂以白凡士林膏，換藥1次/天，連續(xù)28天。

1.2.2 成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清配成20%胎牛血清完全培養(yǎng)液，參照朱旭東[1]研究的方法以組織塊法行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，再選取第4～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 微血管數(shù)測(cè)定 造模后7 d、14 d、21 d、28 d分別取創(chuàng)面中心肉芽組織，進(jìn)行石蠟固定，肉芽組織平行方向連續(xù)切片，進(jìn)行CD34免疫組化法標(biāo)記毛細(xì)血管，取切片中心及周圍隨機(jī)5個(gè)視野，采用MPAIS200彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 成纖維細(xì)胞數(shù)量測(cè)定 用5 g/L的胰酶對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行消化1 min，將其制備成為單細(xì)胞懸液，控制其細(xì)胞濃度在3.5×104個(gè)/ml，使用96孔板接種（每孔7 000個(gè)），再用50 m l/L CO2孵育至細(xì)胞貼壁伸展，之后換條件培養(yǎng)液，取一板細(xì)胞再孵育4 h后將上清液棄置，每孔加200μl二甲基亞砜振蕩10 min，再在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度A值（A570值），以此值作為成纖維細(xì)胞數(shù)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)，值越高表明成纖維細(xì)胞數(shù)量越多。

1.2.5 成纖維細(xì)胞增殖指數(shù)測(cè)定 細(xì)胞懸液制作、培養(yǎng)同上述步驟，孵育后分別在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞離心并用750 ml/L乙醇進(jìn)行懸浮，再加入碘化丙啶直到終質(zhì)量濃度為50 ng/ml，避光染色10 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞增殖指數(shù)（prolif erative index，PI）的檢測(cè)，此數(shù)值越高表明成纖維細(xì)胞增殖越活躍。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

A、B組大鼠燒傷換藥后不同時(shí)間點(diǎn)A、B組成纖維細(xì)胞增殖指數(shù)升高、成纖維細(xì)胞數(shù)量增多、新生微血管數(shù)量增加，A組變化更為明顯（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1～表3。

表1 三組大鼠造模后不同時(shí)間新生微血管數(shù)指標(biāo)變化（n=32，±s，條）

表1 三組大鼠造模后不同時(shí)間新生微血管數(shù)指標(biāo)變化（n=32，±s，條）

注：與A組比較，＊P＜0.05

組別 7 d 1 4 d 2 1 d 2 8 d A 1 5 . 0 1 ± 1 . 4 2 2 0 . 0 6 ± 1 . 6 1 2 3 . 3 5 ± 2 . 4 3 2 4 . 8 2 ± 2 . 6 5 B 8 . 7 5 ± 1 . 2 2 ＊ 9 . 3 7 ± 1 . 3 3 ＊ 1 0 . 5 4 ± 1 . 0 9 ＊ 1 1 . 2 5 ± 1 . 5 2 ＊C 0 ＊ 0 ＊ 0 ＊ 0 ＊

表2 三組大鼠造模后不同時(shí)間PI值的變化（n=32，±s，%）

表2 三組大鼠造模后不同時(shí)間PI值的變化（n=32，±s，%）

組別 7 d 14 d 21 d 28 d A 29.31±0.71 31.28±0.53 31.82±1.25 32.62±0.71 B 26.12±1.21＊ 27.53±1.12＊ 27.72±0.83＊ 27.20±1.11＊C 25.91±1.35＊ 27.28±0.70＊ 27.02±1.58＊ 26.85±0.81＊

表3 三組大鼠造模后不同時(shí)間A570值的變化（n=32，±s）

表3 三組大鼠造模后不同時(shí)間A570值的變化（n=32，±s）

組別 7 d 14 d 21 d 28 d A 0.34±0.01 0.36±0.02 0.38±0.02 0.37±0.03 B 0.31±0.02＊ 0.32±0.01＊ 0.32±0.03＊ 0.33±0.036＊C 0.28±0.03＊ 0.30±0.02＊ 0.31±0.05＊ 0.32±0.02＊

3 討論

局部良好的血供對(duì)于燒傷創(chuàng)面預(yù)后的改善能起到關(guān)鍵性的作用，實(shí)踐證明通過(guò)改善創(chuàng)傷局部微循環(huán)，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，是臨床行之有效的方法之一[2]。成纖維細(xì)胞為構(gòu)成疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞，具有功能活動(dòng)旺盛的特點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)具有明顯的蛋白質(zhì)合成及分泌等活動(dòng)，其可在一定條件下實(shí)現(xiàn)與纖維細(xì)胞互相轉(zhuǎn)化，對(duì)于燒傷導(dǎo)致的不同程度的細(xì)胞變性、壞死及組織缺損修復(fù)都有著十分重要的作用[3-5]。

生肌玉紅膏原載于明代陳實(shí)功《外科正宗》，其主要藥物包含當(dāng)歸、白芷、紫草、血竭、甘草、輕粉等，為中醫(yī)外科常用收斂藥[6-8]。本研究通過(guò)建立深Ⅱ度燒傷大鼠模型，旨在分析生肌玉紅膏對(duì)深Ⅱ度燒傷模型大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞及血液循環(huán)的影響。研究結(jié)果表明，大鼠燒傷換藥后不同時(shí)間點(diǎn)A、B組成纖維細(xì)胞增殖指數(shù)升高、成纖維細(xì)胞數(shù)量增多、新生微血管數(shù)量增加，A組變化更為明顯，證明生肌玉紅膏對(duì)深Ⅱ度燒傷模型大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞的增殖及血液循環(huán)重建有明顯促進(jìn)作用，值得臨床參考借鑒。

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The Influence of Ointment of Shengji Yuhong to Fibroblast and Blood Circulation of Deep II-degree Burn Rats’ Model

YU Bo1DONG Xiaopeng21 Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou Gansu 730000, China, 2 School of Clinical Medicine, Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou Gansu 730000, China

ObjectiveTo explore the effect of ointment of Shengji Yuhong to fibroblast and blood circulation of deep II-degree burn rats’ model.Methods96 rats were random ly divided into three groups (A group, B group, C group) for 32 rats. A group and B group was taken With deep II-degree burn rats’ model. A group was taken ointment of Shengji Yuhong, B group for vaseline. C group was control group. The proliferation index of fibroblast, the numbers of fibroblast and the number of m icrangium in 7 d, 14 d, 21 d and 28 d were compared.ResultsIn A group and B group, the proliferation index of fibroblast, the numbers of fibroblast and the number of micrangium increased. The more remarkable change was in A group (P＜0.05).ConclusionOintment of Shengji Yuhong can obviously promote the fibroblast proliferation and blood supply reconstruction for deep II-degree burn rats.

Ointment of Shengji Yuhong, Deep II-degree burn, Rats, Fibroblast, Blood circulation

R285．5

A

1674-9308（2016）35-0155-02

10．3969/j．issn．1674-9308．2016．35．086

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81260543）

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000