氣相色譜法測定依達(dá)拉奉中有機(jī)溶劑的殘留量*

王雪琦，樊 玲，彭兆亮，李 潔，汪電雷，徐曉雅，張 敏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230031)

?

氣相色譜法測定依達(dá)拉奉中有機(jī)溶劑的殘留量*

王雪琦，樊 玲，彭兆亮，李 潔，汪電雷，徐曉雅，張 敏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230031)

建立了依達(dá)拉奉原料藥中乙醇、乙酸乙酯殘留量的測定方法。采用Rtx-5毛細(xì)管柱，程序升溫法，F(xiàn)ID檢測器，以外標(biāo)法進(jìn)行測定殘留溶劑的含量。乙醇、乙酸乙酯在所考察的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.41% (RSD=3.2%)、100.4% (RSD=4.4%)；檢測限分別為3.09 ng、2.88 ng，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD值均小于5%；乙醇，乙酸乙酯殘留含量均符合藥典規(guī)定。該方法簡便、快速、靈敏及重現(xiàn)性好，適用于依達(dá)拉奉原料藥中有機(jī)溶劑殘留量的測定。

依達(dá)拉奉；有機(jī)溶劑殘留量；氣相色譜法；FID檢測器

腦急性缺血性腦卒中(腦梗死)是最常見的腦卒中的類型，占全部腦卒中的60%～80%，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，具有較高的病死率及致殘率，嚴(yán)重危害人類的健康。對于急性腦卒中的處理方法應(yīng)強(qiáng)調(diào)早期診斷，早期治療，早期康復(fù)及早期預(yù)防再發(fā)的措施，是減少死亡和致殘的關(guān)鍵[1-3]。依達(dá)拉奉(edaravone)作為自由基強(qiáng)效清除劑，于2001年在日本上市(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)[4-5]。臨床的研究提示N-乙酰門冬氨酸(NAA)是特異性的存活神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志，在腦梗塞患者的發(fā)病初期其含量急劇減少。當(dāng)給予腦梗塞急性期患者依達(dá)拉奉，可抑制梗塞周圍局部的腦血流量減少，使發(fā)病28天后腦中NAA含量較甘油對照組明顯升高[6-8]。機(jī)理研究提示，依達(dá)拉奉可清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，臨床上主要用于治療急性缺血性腦中風(fēng)等，用于改善急性腦梗塞所致的神經(jīng)癥狀、日常生活活動能力和功能障，其作用機(jī)制不是通過纖溶作用來實(shí)施，故可用于治療具有出血癥狀的腦血栓和腦栓塞[9-13]。由于依達(dá)拉奉原料藥在合成過程中添加使用了乙酸乙酯、乙醇，屬藥品中的第三類規(guī)定應(yīng)限制的溶劑，均需要在產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中加以控制。殘留溶劑是藥品雜質(zhì)檢查的重要組成部分，原料藥的殘留溶劑與用藥安全直接相關(guān)，不僅會影響原料藥的物理化學(xué)性質(zhì)，可能還會對人體健康產(chǎn)生巨大的危害[14]。為了提高藥品的質(zhì)量，保證用藥的安全，按照2015年版藥典四部通則0861殘留溶劑測定法及人用藥品注冊國際技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)中的要求頒布的指導(dǎo)原則Q3C下溶劑殘留檢測項(xiàng)[15-16]，在藥典方法的基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[17-20]，我們對采用毛細(xì)管色相色譜發(fā)對依達(dá)拉奉原料藥進(jìn)行有機(jī)溶劑殘留量的檢查，并規(guī)定含乙醇、乙酸乙酯的含量不得超過0.5%。建立了毛細(xì)管色譜法測定依達(dá)拉奉中乙酸乙酯、乙醇2種有機(jī)溶劑，采用方法簡單、結(jié)果靈敏可靠，方法如下。

圖1 依達(dá)拉奉結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

島津GC-2014氣相色譜儀，檢測器：氫火焰離子檢測器(FID)，GC solution工作站(日本島津有限公司)，Rtx-5毛細(xì)管柱，10 μL微量注射針。

1.2 試 藥

依達(dá)拉奉原料藥3批(合肥九諾醫(yī)藥科技有限公司提供，批號：150601，150602，150603；含量均>99%)；乙醇、乙酸乙酯(分析純，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，批號：20160108,20160210 )；N,N-二甲基乙酰胺(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20150426)，純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Rtx-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×2.5 μm，固定液為5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷)，進(jìn)樣口溫度為200 ℃；柱溫：程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持8 min，然后以20 ℃/min升溫至180 ℃，保持4 min；檢測器：氫焰離子化檢測器(FID)，250 ℃；載氣：高純氮?dú)?，分流比?0:1；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備

取乙醇、乙酸乙酯各約500 mg，精密量取，采用N,N-二甲基乙酰胺定量稀釋成每1 mL中含乙醇、乙酸乙酯各4.950 mg和 4.614 mg，作為對照品貯備液。精密量取乙醇、乙酸乙酯對照品貯備液各1.0 mL，置10 mL量瓶中，用N,N-二甲基乙酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取依達(dá)拉奉原料藥約1.0 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加N,N-二甲基乙酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密量取混合對照品溶液和供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀中，記錄色譜圖，測定乙醇、乙酸乙酯有機(jī)溶劑的分離度及其柱效。結(jié)果表明，相鄰殘留溶劑峰的分離度均符合要求，系統(tǒng)適應(yīng)性良好。對照品溶液的色譜圖見圖2，同法測定空白溶劑(N,N-二甲基乙酰胺)及供試品溶液(見圖 2)。

圖2 殘留溶劑氣相色譜圖

2.4 線性范圍的考察

分別精密量取乙醇、乙酸乙酯對照品貯備液1 mL，0.6 mL，0.2 mL，0.1 mL，0.05 mL，分別置于 10 mL 量瓶中，用N,N-二甲基乙酰胺至刻度搖勻，制成一系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，在上述“2.1色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)樣測定，以待測成分質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1，結(jié)果表明，乙醇、乙酸乙酯在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性良好。

表1 殘留溶劑的線性范圍及回歸方程(n=5)

2.5 最低檢測限

取乙酸乙酯、乙醇對照品貯備液，用N,N-二甲基乙酰胺逐漸稀釋至適當(dāng)濃度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，以每種殘留溶劑信噪比(S/N)≥3作為最低檢測限(LOD)，當(dāng)信噪比約為3時(shí)，乙酸乙酯、乙醇的進(jìn)樣濃度分別為6.18 μg/mL、5.76 μg/mL，即乙醇、乙酸乙酯檢測限分別為3.09 ng、2.88 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密移取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下中間濃度1 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣測定6次。計(jì)算乙醇、乙酸乙酯的RSD值分別為3.5%，2.9%，結(jié)果表明本法的精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取混合對照溶液，分別于0、2、4、6、8 h取樣，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，并計(jì)算峰面積，結(jié)果表明峰面積均無明顯差別，乙醇、乙酸乙酯的RSD分別為2.3%、2.7%，表明溶液在 8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取依達(dá)拉奉原料藥150601樣品1 g，置于10 mL容量瓶中，共6份，由于樣品中未檢出乙酸乙酯，分別精密量取加入混合對照品儲備液溶液適量，作為供試品來進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，用N,N-二甲基乙酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定并計(jì)算乙醇的含量。結(jié)果，乙醇、乙酸乙酯的加樣回收率分別為2.2%、1.9%，表明重復(fù)性好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知?dú)埩羧軇悠芳s100 mg，置于10 mL容量瓶中，精密稱定，共9份，分別精密加入上述對照品貯備液適量，再加N,N-二甲基乙酰胺使溶解并稀釋至刻度，搖勻；再取混合對照溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定并計(jì)算其加樣回收率。得乙醇、乙酸乙酯平均回收率(n=3)分別為98.41%、100.4%，RSD值分別為3.2%、4.4%，結(jié)果表明樣品的回收率良好。

2.10 樣品結(jié)果

取對照品溶液和供試品溶液各1 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，檢查本品3批，記錄色譜圖，計(jì)算樣品中殘留李溶劑的含量，色譜圖見圖2。結(jié)果表明依達(dá)拉奉原料藥樣品中乙醇的溶劑殘留量殘留量為0.43%，未檢出乙酸乙酯，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表2。

表2 殘留溶劑測定結(jié)果

3 討 論

3.1 溶劑的選擇

依達(dá)拉奉原料藥在水中溶解度較低，易溶于二甲基亞砜及N,N-二甲基乙酰胺中，考慮到N,N二甲基乙酰胺的低毒性，故選擇其作為配制的溶劑。

3.2 色譜柱的選擇

已有文獻(xiàn)報(bào)道依達(dá)拉奉的溶劑殘留測定[21]，其采用極性較強(qiáng)的TG-624色譜柱，由于乙醇、乙酸乙酯的極性接近，極性強(qiáng)的色譜柱造成分離效果不好，本法則選用弱極性的Rtx-5毛細(xì)管柱，可以將2種有機(jī)溶劑分離完全，在本試驗(yàn)條件下，各物質(zhì)均可達(dá)到有效分離。

3.3 柱溫及進(jìn)樣方式的選擇

由于N,N-二甲基乙酰胺沸點(diǎn)較高，若采用等柱溫法，出峰時(shí)間長，為了縮短分析時(shí)間，改用程序升溫法，整個(gè)分析過程在10 min內(nèi)完成，方便快捷，有機(jī)溶劑基本按照沸點(diǎn)順序出峰，乙醇、乙酸乙酯有機(jī)溶劑出峰順序依次為2.432 min、3.404 min。文獻(xiàn)[21]采用不分流進(jìn)樣，操作條件優(yōu)化較為復(fù)雜，對操作技術(shù)的要求高，而本法采用的分流進(jìn)樣具有保證樣品完全汽化，減小分流歧視，同時(shí)也是為了防止固體顆粒和不揮發(fā)的樣品組分進(jìn)入色譜柱的優(yōu)勢，很大程度上防止了柱污染，同時(shí)起到了簡化操作的目的，因此本法顯著優(yōu)于改法。

3.4 結(jié)果分析

依達(dá)拉奉作為一種自由基清除劑，具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，可以抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦神經(jīng)細(xì)胞的過氧化作用及延遲性神經(jīng)細(xì)胞的死亡，并且通過減輕腦缺血及其所引起的腦水腫和組織損傷，具有良好的耐受性，具有較好的治療效果[5-7]。當(dāng)藥品中的所含的殘留溶劑水平高于規(guī)定值后，將對人體或環(huán)境產(chǎn)生一定的危害[14]。乙醇和乙酸乙酯均為三類有機(jī)溶劑，其限度均為0.5%，本法采用毛細(xì)管氣相色譜法進(jìn)行測定，依達(dá)拉奉原料藥3批樣品的有機(jī)殘留量均符合《中國藥典》2015 版和 ICH 中的規(guī)定。采用外標(biāo)法得到方法學(xué)滿意結(jié)果，系統(tǒng)適應(yīng)性強(qiáng)，線性關(guān)系良好，精密度，重復(fù)性，穩(wěn)定性均符合《中國藥典》的要求(RSD < 5%)[15]，具有分析時(shí)間短，具有簡便、可靠的優(yōu)勢。因此該方法應(yīng)用于適用于依達(dá)拉奉原料藥中乙醇、乙酸乙酯的溶劑含量測定準(zhǔn)確、可信，本法通過毛細(xì)管氣相色譜法建立溶劑殘留，可對乙醇、乙酸乙酯兩種有機(jī)溶劑的測定提供了幫助，為藥品的質(zhì)量控制、制劑生產(chǎn)提供了科學(xué)保障。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2010[J].中國臨床醫(yī)生,2011,39(3):67-73.

[2] 段云霞,陳小玉,張梓倩,等.缺血性腦卒中治療藥物研究進(jìn)展[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,21(2):65-70.

[3] 李慧,姜亞芳.腦卒中患者早期康復(fù)護(hù)理干預(yù)措施的研究進(jìn)展[J].中華護(hù)理雜志,2010,45(2):187-189.

[4] 張?jiān)破?黃繼紅,黃岱斌,等.9.4T高場磁共振頻譜對急性缺血缺氧早期小鼠腦代謝物N-乙酰門冬氨酸變化的研究[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,28(3):157-159.

[5] 王欣.依達(dá)拉奉聯(lián)合氯吡格雷治療急性腦梗死的療效觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011,17(20):140-141.

[6] 郭忠,趙晉,馬建秀,等.依達(dá)拉奉的臨床應(yīng)用及進(jìn)展[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2009,30(3):72-75.

[7] 張躍利.依達(dá)拉奉聯(lián)合銀杏葉提取物治療急性腦梗死的療效觀察[J].山西醫(yī)藥雜志,2015,44(18):2149-2151.

[8] 常春紅.依達(dá)拉奉對急性腦出血患者炎性細(xì)胞因子水平及神經(jīng)功能的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2014,17(17):43-45.

[9] 侯晞,梁楓,李愛劍,等.銀杏葉提取物聯(lián)合依達(dá)拉奉對氣虛血瘀型腦缺血/再灌注大鼠血液學(xué)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2010,26(8):1049-1053.

[10]馬利萍,孫建國,彭英,等.依達(dá)拉奉清除自由基機(jī)制及臨床應(yīng)用[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2011,16(3):341-348.

[11]Watanabe T, Tahara M, Todo S. The novel antioxidant edaravone: from bench to bedside[J]. Cardiovasc Ther,2008,26(2):101-114.

[12]蔣明勇,何舉名,王漢蛟.依達(dá)拉奉聯(lián)合醒腦靜治療成人急性腦梗死療效的系統(tǒng)評價(jià)[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志,2012,12(11):1339-1346.

[13]Liu S,Li R,Ni X,et al. Perfluorocarbon-facilitated CNS oxygen toxicity in rats: reversal by edaravone[J].Brain-Res,2012,1471(3):56-65.

[14]胡昌勤.化學(xué)藥品雜質(zhì)控制的現(xiàn)狀與展望[J].中國科學(xué):化學(xué),2010,4(6):679-687.

[15]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典.四部[S].北京.中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[16]ICH指導(dǎo)委員會.藥品注冊的國際技術(shù)要求(質(zhì)量部分)[M].周海鈞譯.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:82-85.

[17]謝所.頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定拉夫替丁中的殘留溶劑[J].安徽醫(yī)藥,2015,19(11):2085-2087.

[18]宋梅.HS-GC法測定草酸艾司西酞普蘭中有機(jī)溶劑殘留量[J].廣州化工,2014,42(19):113-115.

[19]趙曉亞,王躍飛,楊帆,等.氣相色譜法快速分析人唾液中7種短鏈脂肪酸[J].分析化學(xué),2016,44(7):1009-1014.

[20]嚴(yán)拯宇,劉新穎,王瑞,等.毛細(xì)管氣相色譜法測定甲磺酸伊馬替尼中殘留有機(jī)溶劑[J].藥學(xué)進(jìn)展,2014,38(8):761-764.

[21]殷曉華,陳瑩瑩.毛細(xì)管氣相色譜法測定依達(dá)拉奉原料藥中有機(jī)溶劑的殘留量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,31(10):789-792.

Determination of Organic Acetate Solvents in Edaravone by Gas Chromatography*

WANGXue-qi,FANLing,PENGZhao-liang,LIJie,WANGDian-lei,XUXiao-ya,ZHANGMin

(School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Hefei 230031, China)

A method for determination of ethanol and ethyl acetate residual in edaravone was established. A Rtx-5 capillary column, a temperature program and the flame ionization detector were used for the separation and quantitative analysis. A capillary gas chromatography method for determining residual organic solvents was established by external standard method. Ethyl alcohol and ethyl acetate had good linear relationship in the concentration range investigated. The recoveries were 98.41% and 100.4%, RSD were 3.2% and 4.4%, respectively, the limit of detection were 3.09 ng and 2.88 ng, respectively, both RSD of precision, reproducibility and value stability were less than 5%, the residual solvent amount of ethanol and ethyl acetated in line with the pharmacopoeia. The method is simple, fast, sensitive and with good reproducibility. It can be used as a method for the determination of edaravone residual organic solvents.

edaravone; residual organic solvents; gas chromatography; FID detector

國家自然科學(xué)基金(81473536)；安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(1301042097)；校級探索性科研項(xiàng)目(2016ts070)。

王雪琦(1994-)，女，在讀研究生，主要研究方向?yàn)樗幬锎x動力學(xué)。

汪電雷(1977-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樗幬锎x動力學(xué)。

R917

A

1001-9677(2016)024-0078-04