酚酸酶法改性殼聚糖及其產(chǎn)物抗菌性能的研究

肖麗靜，楊佳麗，趙希榮

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

?

酚酸酶法改性殼聚糖及其產(chǎn)物抗菌性能的研究

肖麗靜，楊佳麗，趙希榮

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003)

通過酚類物質(zhì)與殼聚糖酶法接枝以提高殼聚糖的抗菌性質(zhì)。利用酪氨酸酶催化氧化酚類接枝至殼聚糖得到殼聚糖-酚類衍生物，通過紅外光譜分析確定衍生物結(jié)構(gòu)，采用抑菌圈法對其抗菌性能進(jìn)行測定。IR表明殼聚糖-酚類衍生物在3400 cm-1、1384 cm-1、1654 cm-1處的吸收均有一定程度的減弱，在1637 cm-1出現(xiàn)C=N的伸縮振動峰。表明酚酸已接枝至殼聚糖分子上；殼聚糖-酚類衍生物的抑菌性能較殼聚糖有明顯的提高。

殼聚糖，酚酸，酪氨酸酶，抑菌

殼聚糖其學(xué)名是β-(1→4)-2-氨基-2脫氧-D-葡聚糖，是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，是自然界中存在的唯一的天然堿性線性多糖。殼聚糖不溶于水和堿溶液，但能夠溶于稀鹽酸、硝酸等以及大多數(shù)的有機(jī)酸中[1]。殼聚糖對人體無毒害作用，且在自然界中易被降解，也有良好的生物相容性。殼聚糖在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品、食品包裝等諸多領(lǐng)域中都有著廣泛應(yīng)用[2-3]。

由于殼聚糖大分子鏈上分布著眾多氨基和羥基，易形成分子間氫鍵，因而殼聚糖的結(jié)晶性較高、水溶性及力學(xué)性能差，生物活性如抗菌活性和抗氧化活性也完全不能令人滿意，一定程度上限制了其應(yīng)用。

為了改善殼聚糖的化學(xué)特性和生物活性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，對殼聚糖進(jìn)行修飾，制備不同性能的殼聚糖衍生物勢在必行。目前，殼聚糖的改性方法主要分為化學(xué)改性和生物改性[4-6]。殼聚搪化學(xué)改性時常用醛、酰氯、酸酐、環(huán)氧化物等活性高、危害性大的試劑，這會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時化學(xué)法還存在著反應(yīng)步驟多，得率低、專一性差等缺點(diǎn)[7]。酶法改性殼聚糖具有催化活性高、專一性強(qiáng)且環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，是一前景廣闊的改性方法。目前，殼聚糖酶法改性所用的酶主要有酪氨酸酶(tyrosinase，tyr)[8]、過氧化物酶[9]等。

Kumar等[10]研究了利用酪氨酸酶催化氧化酚類物質(zhì)接枝到殼聚糖上，酚類物質(zhì)在酪氨酸酶的作用下生成醌類，醌類與殼聚糖上氨基通過席夫堿或者邁克爾加成反應(yīng)進(jìn)行接枝，接枝得到的殼聚糖衍生物其表面性質(zhì)和流變性得到了不同程度的改善。已有諸如沒食子酸、咖啡酸和阿魏酸等酚酸接枝到殼聚糖上從而賦予殼聚糖抗菌性和抗氧化活性的相關(guān)報(bào)道。這些改性物質(zhì)有希望開發(fā)多功能包裝材料和新型抗氧化劑。本文通過酪氨酸酶將酚酸(對香豆酸、香草酸、丁香酚、香芹酚)酶法催化接枝到殼聚糖分子上，以期改善殼聚糖的抗菌活性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

酪氨酸酶(酶活≥1000 U·mL-1)、殼聚糖(Chitosan，CS，分子量20萬，脫乙酰度90%)、對香豆酸(p-Coumaric acid，PCA)、香草酸(Vanillic acid，VA)、丁香酚(Eugenol，EU)、香芹酚(Carvacrol，CA)；甲醇、乙醇、氫氧化鈉、醋酸、氯化鈉均為市售分析純；瓊脂，酵母浸膏為生物試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

紅外光譜分析儀、冷凍干燥機(jī)、恒溫?fù)u床。

1.3 殼聚糖酶法改性

將殼聚糖粉末分散于50 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6)中，依次加入6 mL 0.1 mol·L-1酚類物質(zhì)和20 U·mL-1酪氨酸酶，置于25 ℃恒溫?fù)u床上振蕩12 h。反應(yīng)結(jié)束后，分別用乙醇和去離子水對產(chǎn)物進(jìn)行漂洗，冷凍干燥。

1.4 殼聚糖-酚酸衍生物的IR表征

將殼聚糖及其衍生物分別進(jìn)行溴化鉀壓片，用傅立葉紅外光譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，掃描范圍：4000～500 cm-1，分辨率為：4 cm-1，掃描16次。

1.5 殼聚糖-酚酸衍生物的抗菌活性測定

利用滅菌接種針將原始菌種(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌)接種在預(yù)先準(zhǔn)備好的LB液體培養(yǎng)基中，將接種后的液體培養(yǎng)基置于37 ℃的生化箱中培養(yǎng)24 h，得到第二代細(xì)菌，再將第二代細(xì)菌接種、培養(yǎng)獲得第三代細(xì)菌，備用。

采用牛津杯法檢測殼聚糖的抑菌能力。先取出指示菌培養(yǎng)物0.2 mL滴加到LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，之后在其表面均勻的涂上菌培養(yǎng)物，等待其自然干燥，再在每個平板上均勻放上4個消過毒的牛津杯，并滴入通過1%醋酸溶解的改性后的殼聚糖0.2 mL(待測樣品濃度分別為0.2、0.5、0.8、1、2、5、10 mg·mL-1)，將培養(yǎng)皿置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中，24 h后取出測定抑菌圈的直徑。每個樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖與殼聚糖-酚酸衍生物的IR分析

圖1為改性前后殼聚糖及其衍生物的IR光譜圖。

圖1 殼聚糖及其衍生物紅外光譜對照圖

從圖1中可以看出，殼聚糖改性前在3440 cm-1附近為-OH和-NH的伸縮振動的吸收帶，在2875 cm-1是C-H的伸縮振動的吸收峰，1654 cm-1是氨基N-H的變形振動峰；1350 cm-1左右是氨基葡萄糖單元上NH-的彎曲振動，1261 cm-1是C-O和C-C的伸縮振動峰；1155 cm-1是C-O-C的反對稱伸縮振動峰，1083 cm-1是C-O結(jié)構(gòu)的伸縮振動峰；改性后，殼聚糖-酚類衍生物在3400 cm-1，1384 cm-1左右，1654 cm-1處的吸收均有一定程度的減弱，在1637 cm-1出現(xiàn)一個新的吸收峰，這是C=N的伸縮振動峰。這些吸收峰的變化說明殼聚糖上的氨基有所減少，與酪氨酸酶催化氧化酚類物質(zhì)和殼聚糖氨基基團(tuán)之間的發(fā)生共價(jià)反應(yīng)相符，說明酚酸接枝到了殼聚糖分子上。

2.2 殼聚糖-酚酸衍生物抗菌性能的評價(jià)

表1～表4為改性前后殼聚糖及其衍生物的抑菌活性。

表1 殼聚糖及其衍生物對金黃色葡萄球菌抑菌效果

表2 殼聚糖及其衍生物對大腸肝菌抑菌效果

表3 殼聚糖及其衍生物對沙門氏菌抑菌效果

表4 殼聚糖及其衍生物對枯草芽孢桿菌抑菌效果

改性前殼聚糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用，但是抑制作用并不強(qiáng)。改性后，殼聚糖-酚酸衍生物對上述四種菌的抑制能力明顯提高。在較低的濃度范圍內(nèi)，隨著殼聚糖-酚酸衍生物濃度的提高，其抑菌能力也有所提高；其中，殼聚糖-對香豆酸的抑菌能力最強(qiáng)。當(dāng)濃度上升到一定范圍后，殼聚糖-酚酸衍生物的抑菌能力有所下降。這可能是因?yàn)樵谳^低濃度時，殼聚糖的正電荷較易與微生物細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷之間的相互作用，從而改變了微生物細(xì)胞膜的通透性，引起微生物細(xì)胞的死亡[11]；而高濃度的殼聚糖其粘度也會增大，進(jìn)而會出現(xiàn)“再穩(wěn)”現(xiàn)象[12]；還可能是因?yàn)楫?dāng)濃度較高時，殼聚糖細(xì)胞壁表面所帶有的致密包裹層會使得細(xì)胞質(zhì)無法大量漏出。

3 結(jié) 論

本文利用酪氨酸酶催化氧化酚酸改性殼聚糖得到殼聚糖-酚酸衍生物，并進(jìn)一步考察了它們對常見菌的抑制能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改性后的殼聚糖-酚酸衍生物的抑菌性較改性前有明顯地提高。較低濃度時，殼聚糖-對香豆酸的抑菌性能最強(qiáng)。

[1] 蔣挺大.殼聚糖.2版[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2001.

[2] Arvanitoyannis I S, Kassaveti A. Fish industry waste: Treaments, environment impacts, current and potential uses [J]. International Journal of Food Science and Technology, 2008,34(4):726-745.

[3] 余成華.漆酶催化氧化促進(jìn)殼聚糖勘類物質(zhì)接枝的研究[D].天津:天津科技大學(xué), 2014.

[4] 馬寧,汪琴,孫勝玲,等.甲殼素和殼聚糖化學(xué)改性研究進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展,2004,16(4)：643-653.

[5] Ma N, Wang Q, Sun S L, ei al. Progress in chemical modification of chitin and chitosan [J].Progress in Chemistry, 2004,16(4):643-653

[6] 張美云,郭惠萍.季銨鹽殼聚糖的制備及其在抗菌紙中的應(yīng)用[J].中國造紙,2008,27(2):14.

[7] Ilyina A V, Tikhonov V E, Albulov A I, et al. Enzymic preparation of acid-free-water-soluble chitosan [J]. Process Biochemistry, 2000, 35(6):563-568

[8] 薛麗群,馬秀玲,羅志敏,等.殼聚糖-對羥基苯甲酸酶法接枝及表征[J].化學(xué)通報(bào),2007,70(9)：703-706.

[9] Vachoud L, Chen T, Payne G F, et al. Peroxide catalyzed grafting of gallate esters onto the polysaccharide chitosan [J]. Enzyme and Microbial Technology,2001,9:380-385.

[10]Kumar G, Bristow J F, Smith P J, et al. Enzymatic gelation of the natural polymer chitosan [J]. Polymer,2000,41:2157-2168.

[11]Helander I M, Nurmiaho-Lassila E L, Ahvenainen R, et al. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of gram-negative bacteria [J]. International Journal of Food Microbiology, 2001,71: 235-244.

[12]Sudharshan N R, Hoover D G, Knorr D. Antibacterial action of chitosan [J]. Food Biotechnol, 1992, 6: 257-272.

Study on Chitosan Enzymatic Modified by Phenolic Acids and Antimicrobial Activity of Products

XIAOLi-jing,YANGJia-li,ZHAOXi-rong

(College of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Jiangsu Huaian 223003, China)

To improve the antimicrobial activities of chitosan, phenolic acid was grafted onto chitosan by enzymatic method. Phenolic acid was grafted onto chitosan by tyrosinase-catalyzed oxidation. The FTIR spectroscopy was used to character the structural changes of chitosan-phenolic acids derivatives, and the antimicrobial activities of the derivatives were analyzed. The FTIR spectroscopy presented an absorption decreased at 3400 cm-1, 1384 cm-1, 1654 cm-1, and a new band appeared at 1637 cm-1corresponding to C=N vibrations. Phenolic acids were grafted onto chitosan molecule successfully. Compared with that of nature chitosan, the antimicrobial activities of chitosan-phenolic acids derivatives were improved.

chitosan; phenolic acid; tyrosinase; antibacterial activities

肖麗靜(1991-)，女，研究生，專業(yè)方向：化學(xué)工程領(lǐng)域應(yīng)用化學(xué)，殼聚糖改性與應(yīng)用。

O636 1

A

1001-9677(2016)024-0063-03