沙門氏菌的實驗室檢驗技術

楊 玲 方新元 賈立云 蔡擴軍 徐 敏 蒲敬偉

（1.烏魯木齊市高新區(qū)（新市區(qū)）六十戶鄉(xiāng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務中心，新疆烏魯木齊 830082；2.烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 831400；3.烏魯木齊市天山區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 830001；4.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063；5.新疆生產(chǎn)建設兵團第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆烏魯木齊 830009）

沙門氏菌的實驗室檢驗技術

楊 玲1方新元2賈立云3蔡擴軍4*徐 敏4蒲敬偉5

（1.烏魯木齊市高新區(qū)（新市區(qū)）六十戶鄉(xiāng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務中心，新疆烏魯木齊 830082；2.烏魯木齊市米東區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 831400；3.烏魯木齊市天山區(qū)畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 830001；4.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063；5.新疆生產(chǎn)建設兵團第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆烏魯木齊 830009）

本研究對80份沙門氏菌樣品進行前增菌，然后用熒光PCR方法對前增菌樣品進行檢測，挑取陽性樣品進行后續(xù)的分離、鑒定。結果顯示，本研究在傳統(tǒng)沙門氏菌分離、鑒定方法基礎上增加了熒光PCR初步篩選，提高了檢測的靈敏度與特異性，省工省時，最終分離到12株沙門氏菌。

沙門氏菌 熒光PCR 分離 鑒定

沙門氏菌是最常見的食源性人畜共患病原菌之一[1]。在自然界分布廣泛，血清型種類繁多，該菌的最適生長溫度為37℃左右，在20℃以上即可大量繁殖，在冰箱中可存活3～4個月[2]。消費者食用被沙門氏菌污染的食物12～72 h后即可出現(xiàn)腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等發(fā)病癥狀[3]。近年來，沙門氏菌在全球范圍內(nèi)引起的食源性疾病數(shù)量不斷上升，即便在歐美發(fā)達國家仍然難以控制。在歐洲，每年有超過16萬人感染沙門氏菌，美國每年約發(fā)生感染沙門氏菌病例140萬例。同時，沙門氏菌也是引起我國細菌性食物中毒的首要原因[4-6]。因此，開展對肉樣和環(huán)境中沙門氏菌的檢驗具有重要公共衛(wèi)生學意義。

在有較多樣品量的情況下，完全采用國標傳統(tǒng)檢測程序方法對沙門氏菌進行分離、鑒定，耗時長、靈敏度低、試劑藥品消耗多、工作量大，而熒光PCR方法雖然具有特異性好、靈敏度高、操作簡單、安全、自動化程度高等很多優(yōu)點，但只能檢測到是否存在病原菌，最終分離不到沙門氏菌菌株[7-8]。鑒于此，本研究將二者結合起來，對沙門氏菌檢測技術方法進行了優(yōu)化改進，以期為沙門氏菌的檢驗及該病的防控提供有益參考。

1 材料

1.1 樣品

畜禽糞便、畜禽肉、酮體拭子、環(huán)境拭子各20份，一共80份樣品。

1.2 主要試劑

顯色培養(yǎng)基購自法國科瑪嘉公司；細菌分離鑒定的其他試劑購自北京陸橋公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒購自澳東檢驗檢測科技有限公司；細菌鑒定卡購自美國bioMerieux Inc 公司。

1.3 標準菌株

鼠傷寒沙門氏菌標準菌株購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.4 主要儀器

法國梅里埃全自動微生物鑒定儀VITEK-2-CompactII；恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 檢驗程序

2.2 操作步驟

2.2.1 前增菌

稱取25 g（ml）樣品放入盛有225ml BPW 的無菌均質(zhì)杯中，以8000～10000 r/min 均質(zhì)1～2 min，或置于盛有225ml BPW 的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH 值，用1 mol/ml無菌NaOH或HCl 調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉至500 ml錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)8～18h。如為冷凍產(chǎn)品，應在45℃以下不超過15 min，或2℃～5 ℃不超過18 h 解凍[9]。

若為環(huán)境拭子樣品。將盛有6mL BPW的離心管直接帶到采樣地點，采集環(huán)境拭子后快速打開蓋子，將拭子放進后，迅速蓋上蓋子，帶回實驗室，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)8～18 h。

若為糞便樣品。將盛有6 mLBPW離心管直接帶到采樣地點，采集糞便拭子后快速打開蓋子，將拭子放進后，迅速蓋上蓋子，帶回實驗室，于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)8～18 h。

2.2.2 PCR初篩

用細菌DNA基因組提取試劑盒，參照說明書提取細菌核酸。用沙門氏菌熒光PCR檢測試劑盒，參照說明書進行熒光PCR檢測。

2.2.3 增菌

取PCR陽性的前增菌液1mL接種于10mlTTB，于42 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。

2.2.4 分離

接種環(huán)取TTB 1環(huán)，劃線接種于一個XLD平板，一個顯色培養(yǎng)基，觀察各個平板上生長的菌落。

2.2.5 革蘭氏染色鏡檢

對分離鑒定培養(yǎng)基上的可疑菌落進行純化，革蘭氏染色，鏡檢。

2.2.6 全自動微生物鑒定儀進行生化鑒定

根據(jù)革蘭氏染色情況，選擇對應細菌鑒定卡，用法國梅里埃全自動微生物鑒定儀VITEK-2-CompactII進行鑒定。

3 結果

3.1 熒光PCR擴增結果

經(jīng)熒光PCR檢測，一共出現(xiàn)了12份陽性，圖1。

3.2 分離平板上菌落顏色及形態(tài)

典型的沙門氏菌在XLD 瓊脂菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心（圖2）。典型的沙門氏菌在顯色培養(yǎng)基呈現(xiàn)紫紅色。

3.3 革蘭氏染色鏡檢

沙門氏菌呈革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌（0.7～1.5μm）×（2～5μm）（比大腸桿菌細），散在，無莢膜和芽孢，圖3。

3.4 全自動微生物鑒定儀進行生化鑒定

經(jīng)全自動微生物鑒定儀進行生化鑒定，一共分離出12株沙門氏菌。

4 討論

傳統(tǒng)食源性人畜共患細菌檢測檢驗程序復雜煩瑣，尤其在樣品量較大的情況下，耗時費力，而熒光PCR法具有快速簡便、敏感特異等優(yōu)點，在臨床疾病診斷、動物疾病檢測、食品安全等領域的應用越來越廣泛[10]。本研究用熒光PCR方法對樣品進行初步篩選，選取陽性樣品再進行下一步分離鑒定，提高了沙門氏菌的檢出率和工作效率，為食源性細菌的快速檢測提供了科學依據(jù)。但值得注意的是，由于熒光定量PCR只檢測病原的核酸，并不能區(qū)分病原菌是否具有生物學活性。因此，如果樣品中沙門氏菌物無生物學活性，PCR檢測為仍陽性率，但并不能分離到沙門氏菌菌株。

[1] Newell D G，Koopmans M，Verhoef L，et al. Food-borne diseases-the challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge [J].International Journal of Food Microbiology，145（2-3）：493.

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[7] 封莉，黃繼超，劉欣，等.食源性致病菌快速檢測技術研究進展[J].食品科學，2012，33（21）：332-339.

[8] 楊娟，許美玲，張麗，等. 5種方法檢測食品中沙門氏菌的結果比較[J].中國食物與營養(yǎng)，2013，19（9）：18-20.

[9] 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.4-2010.食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

[10] 任秀.食品中沙門氏菌快速檢測方法的研究[D].吉林大學，2011.

新疆維吾爾自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程（qn2015jc058）；烏魯木齊市科技局現(xiàn)代服務業(yè)促進計劃項目（Y141310002）；兵團現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技攻關與成果轉化計劃項目（2015AC026）；新疆生產(chǎn)建設兵團動物疾病防控重點實驗室開放課題

楊玲（1974-），女，本科，獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防治工作。

蔡擴軍（1985-），男，碩士，獸醫(yī)師，主要從事食源性人畜共患病原菌及動物疫病防控工作。