溫清飲軟膏對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎皮損表皮中間絲聚合蛋白表達(dá)的影響

于春水 楊和榮 周建瓊 胥興文

(遂寧市中心醫(yī)院皮膚科,四川 遂寧 629000)

溫清飲軟膏對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎皮損表皮中間絲聚合蛋白表達(dá)的影響

于春水 楊和榮 周建瓊 胥興文

(遂寧市中心醫(yī)院皮膚科,四川 遂寧 629000)

目的 探討溫清飲對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎模型皮損表皮中間絲聚合蛋白(FLG)蛋白表達(dá)的影響。方法 構(gòu)建小鼠特應(yīng)性皮炎模型，檢測(cè)溫清飲作用前后皮損表皮中FLG蛋白的變化。結(jié)果 溫清飲作用后小鼠特應(yīng)性皮炎模型皮損表皮中FLG蛋白的表達(dá)增高，表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。結(jié)論 溫清飲上調(diào)小鼠特應(yīng)性皮炎模型皮損表皮中FLG蛋白的表達(dá)。

溫清飲；絲聚蛋白

特應(yīng)性皮炎(AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，該病病因和發(fā)病機(jī)制不明，研究表明，AD的發(fā)病機(jī)制涉及皮膚屏障功能、天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的相互作用、相互影響和相互制約〔1〕。中醫(yī)藥在治療AD、濕疹等皮膚功能障礙性皮膚病方面療效獨(dú)特。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可抑制HaCaT細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)10 mRNA的表達(dá)〔2〕。當(dāng)歸多糖(當(dāng)歸的主要成分)對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用〔3,4〕。而當(dāng)歸、川芎是溫清飲的組成成分之一，本文探討溫清飲對(duì)小鼠AD模型皮損表皮中間絲聚合蛋白(FLG)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料 7周齡健康小鼠32只(質(zhì)量約20 g，雌雄隨機(jī))由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨意飲水、飲食。中藥材溫清飲(白芍、當(dāng)歸、熟地黃、川芎、黃連、黃柏、黃芩、梔子)、單純基質(zhì)以及溫清飲軟膏由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科提供及制備。FLG 抗體(Goat anti mouse FLG antibody，美國(guó)Abcam公司)。

1.2 動(dòng)物造模 小鼠分組及皮損誘導(dǎo)：將32只7周齡小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只：正常對(duì)照組、AD模型組、溫清飲治療組、鹵米松治療組。參考DNCB誘導(dǎo)小鼠AD模型形成相關(guān)文獻(xiàn)并稍加改進(jìn)〔5〕，模型組、溫清飲治療組、鹵米松治療組小鼠足墊及脫毛后背部外涂0.1%DNCB溶液100 μl，1次/w。6 w后取正常對(duì)照組和模型組背部皮膚，做HE染色，顯示模型構(gòu)建成功。

1.3 給藥及皮損取材 將上述動(dòng)物模型分組處理，溫清飲治療組給予溫清飲軟膏，2次/d，持續(xù)治療2 w；鹵米松治療組給予鹵米松乳膏，2次/d，持續(xù)治療2 w；正常對(duì)照組和模型組仍外涂丙酮。治療2 w后觀察各小組小鼠皮損情況，取背部脫毛處皮膚做HE染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)。免疫組化染色步驟按試劑盒說明。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)分及判定 根據(jù)小鼠皮膚表皮角質(zhì)層和顆粒層FLG陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行評(píng)分從而對(duì)其結(jié)果進(jìn)行半定量的評(píng)估〔6〕。顯微鏡下觀察每張切片的整體染色情況：① 200倍視野下選擇5個(gè)具有代表性的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域共計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分為0～3分，若無陽性細(xì)胞記0分；陽性細(xì)胞<25%計(jì)1分；陽性細(xì)胞在25%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞>50%計(jì)3分。②著色強(qiáng)度計(jì)分：不著色計(jì)0分；輕微著色(呈淡棕黃色)計(jì)1分；中等著色計(jì)2分；強(qiáng)著色(呈明顯棕黃色)及3分。最后，將以上兩部分評(píng)分分?jǐn)?shù)相加，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析。FLG表達(dá)陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

免疫組化檢測(cè)小鼠表皮FLG表達(dá):①正常對(duì)照組及模型組皮膚表皮中均有FLG陽性表達(dá)的棕褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，以細(xì)胞質(zhì)為主；正常對(duì)照組小鼠表皮FLG彌漫分布于其表皮的角質(zhì)層及顆粒層，并向棘層延伸，染色強(qiáng)度明顯減弱，而模型組小鼠皮損角質(zhì)層及顆粒層FLG的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，且在棘細(xì)胞層上部也有少量表達(dá)。溫清飲治療組及鹵米松治療組小鼠皮損FLG表達(dá)量明顯較模型組增高，甚至幾乎接近正常水平。②模型組與正常對(duì)照組陽性表達(dá)評(píng)分之間差異顯著(1.80±0.262、4.80±0.185，P<0.01)；溫清飲治療組(4.22±0.128)及鹵米松治療組(4.34±0.207)與模型組之間差異顯著(P<0.01)，但溫清飲治療組及鹵米松治療組和正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討 論

AD以劇烈瘙癢和皮膚炎癥為主要特征。AD病因十分復(fù)雜，包括遺傳、皮膚屏障功能缺陷和免疫調(diào)節(jié)異常等〔7〕。皮膚屏障功能異常在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)AD患者都有FLG基因的表達(dá)降低，考慮FLG缺陷是AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素〔8〕。

近年來，學(xué)者們對(duì)表皮功能屏障形成中不可或缺的表皮終末分化蛋白FLG有了更深一步的認(rèn)識(shí)。AD和銀屑病是兩種常見的炎癥性皮膚病，均表現(xiàn)為皮膚屏障功能受損〔9〕和皮損處與外周血中IL-17表達(dá)增加〔10〕。AD表皮屏障功能受損，親水性和親脂性物質(zhì)的滲透增多，經(jīng)皮水分丟失(TEWL)過多，使得皮膚變得干燥，缺少水分，因此維持正常的皮膚屏障功能是相當(dāng)關(guān)鍵的。

小鼠FLG基因位于3號(hào)染色體，其結(jié)構(gòu)與人類高度相似，且屬于EDC成員，Howell等〔11〕通過免疫組化檢測(cè)正常人及AD患者皮損處FLG表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，AD患者皮損處角質(zhì)層和顆粒層FLG的表達(dá)明顯低于正常人，而AD患者皮損區(qū)FLG的表達(dá)比非皮損區(qū)更低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明正常小鼠皮膚表皮FLG蛋白的表達(dá)明顯高于模型組，這與Howell等〔11〕研究結(jié)果一致。FLG在維持皮膚屏障功能中發(fā)揮著重要的作用，表達(dá)降低甚至缺失與AD的發(fā)生明顯相關(guān)。經(jīng)溫清飲治療后小鼠皮膚表皮FLG蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，說明溫清飲對(duì)FLG的表達(dá)發(fā)揮著積極的作用，溫清飲對(duì)AD模型小鼠的皮損有明顯的抑制作用，能上調(diào)表皮FLG蛋白的表達(dá)，從而使得皮膚屏障功能得以更快的修復(fù)。

1 Mc Grath JA.Profilaggrin,dry skin and atopic dermatitis risk:size matters〔J〕.J Invest Dermatol,2012;132(1):98-104.

2 于春水,譚升順,眭維恥,等.川芎嗪對(duì)HaCaT細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2007;21(3):141-3.

3 于春水,牟韻竹,熊 芬,等.當(dāng)歸多糖對(duì)HaCaT細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2010;9(2):87-9.

4 于春水,牟韻竹,蘇江維,等.當(dāng)歸多糖誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2010;9(3):143-5.

5 Borowski LC,Lopes RP,Gonzalez TP,etal.Is steroid resistance related to multidrug resistance-Ⅰ(MDR-Ⅰ)in rheumatoid arthritis〔J〕.Int Immunopharmacol,2007；7(6):836-44.

6 Oh SH,Bae BG,Park CO,etal.Association of stress with symptoms of atopic dermatitis〔J〕.Acta Derm Venereol,2010;90(6):582-8.

7 Kasraise S,Werfel T.Role of macrophages in the pathogenesis of atopic dermatitis〔J〕.Mediat Inflamm,2013;2013(3):942-5.

8 Sandilands A,Terron-Kwiatkowski A,Hull PR,etal.Comprehensive analysis of the gene encoding filaggrin uncovers prevalent and rare mutations in ichthyosis vulgaris and atopic eczema〔J〕.Nat Genet,2007;39(5):650-4.

9 Hvid M,Vestergaard C,Kemp K,etal.IL-25 in atopic dermatitis:a possible link between inflammation and skin barrier dysfunction〔J〕.J Invest Dermatol,2011;131(1):150-7.

10 Gutowska -Owisiak D,Schaupp AL,Salimi M,etal.IL-17 downregulates filaggrin and affects keratinocyte expression of genes associated with cellular adhesion〔J〕.Exp Dermatol,2012;21(2):104-10.

11 Howell MD,Kim BE,Gao P,etal.Cytokine modulation of AD filaggrin skin expression〔J〕.J Allergy Clin Immunol,2007;120(1):150-5.

〔2015-08-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

四川省科技廳資助課題(2016JY0214)；四川省衛(wèi)計(jì)委資助課題(150243)；遼寧市中心醫(yī)院資助課題(2015S23)

于春水(1969-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事皮膚屏障功能障礙。

R733.7

A

1005-9202(2017)02-0282-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.010