大鼠ILK-RNAi慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

白志勛 陸靜 楊亦彬△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，貴州 遵義563000；2.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563000)

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·論 著·

大鼠ILK-RNAi慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

白志勛1陸靜2楊亦彬1△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，貴州 遵義563000；2.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州 遵義 563000)

目的 構(gòu)建大鼠整合素連接激酶-RNAi(ILK-RNAi)慢病毒表達(dá)載體，為下一步干預(yù)研究細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及其信號通路奠定基礎(chǔ)。方法 針對大鼠ILK基因RNAi有效靶序列，合成4條干擾(KD)序列。與pGCSIL-GFP 載體連接產(chǎn)生shILK-RNAi慢病毒載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備完畢的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性克隆，測序驗(yàn)證。包裝慢病毒，以綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)水平驗(yàn)證病毒滴度。慢病毒載體感染大鼠NRK-52E細(xì)胞后，RT-PCR、WB檢測及熒光顯微鏡觀察ILK在其細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果 測序驗(yàn)證成功構(gòu)建3條大鼠ILK-RNAi慢病毒載體，滴度分別為5×108，2.5×108，3.5×108pfu/mL。分別以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)感染NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)源篩靶，熒光觀察80%細(xì)胞的綠色熒光蛋白，RT-PCR、WB檢測ILK的表達(dá)明顯下降。相對于陰性對照序列，KD2，KD3在高M(jìn)OI組中對ILK表達(dá)的敲減達(dá)到65%以上(P<0.05)，為有效靶點(diǎn)。其中KD2及KD3的ILK 2-△△Ct值分別為0.337，0.217。KD2序列為對ILK的表達(dá)抑制最顯著。結(jié)論 成功構(gòu)建大鼠ILK-RNAi慢病毒表達(dá)載體。

NRK-52E； 整合素連接激酶； 慢病毒載體

整合素連接激酶(integrin-linked kinase, ILK)是一種生物學(xué)活性多樣化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，共由452個氨基酸組成，其基因在人體位于染色體11p15.5-p15.4，cDNA 全長1.8 kb，分子量59 KD[1]。ILK在人體多個臟器及組織中具有廣泛的表達(dá)，通過介導(dǎo)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白與整合素的連接參與多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來研究顯示ILK可能是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個重要效應(yīng)因子，在TGF-β介導(dǎo)的EMT中發(fā)揮一定作用[2]。為了進(jìn)一步研究TGF-β1/Smads/ILK信號通路中ILK的功能機(jī)制，本研究通過構(gòu)建大鼠ILK-RNAi慢病毒表達(dá)載體，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 引物設(shè)計(jì)及合成、干擾序列及對照序列DNA片段、慢病毒載體(GV115)由上海吉凱提供，慢病毒包裝系統(tǒng)主要包括pHelper 1.0、pHelper 2.0 載體以及pGC-LV-GFP載體，其中pGC-LV-GFP載體中有能持續(xù)表達(dá)的綠色熒光蛋白。Taq polymerase(Takara)、QIAGN plasmid (QIAGN)、T4 DNA ligase、Age I、EcoR I(NEB)及陰性對照序列(TTCTCCGAACGTGTCACGT)由吉凱公司設(shè)計(jì)提供。

1.2 方法

1.2.1 siRNA干擾序列構(gòu)建框架 根據(jù)Genbank中大鼠ILK基因序列(NM_133409)，利用美國英杰生命分析技術(shù)有限公司網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)4對引物，見表1。

表1 siRNA干擾序列構(gòu)建框架

將合成的引物干粉溶解于退火緩沖液中，在90 ℃水浴15 min，室溫下冷卻，引物形成雙鏈DNA。

1.2.2 ILK慢病毒載體構(gòu)建 載體酶切位點(diǎn)為Age I，EcoR I，質(zhì)粒經(jīng)單酶切消化后，會呈現(xiàn)均一的電泳條帶，此時可與Marker對比判斷其分子量大小，通過T4-DNA連接酶將雙酶切后的載體與DNA片段在合適的buffer中進(jìn)行連接反應(yīng)，連接后的產(chǎn)物在16 ℃溫度下過夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。連接后產(chǎn)物將轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coil DH 5α(在含80 μg/mL氨芐青霉素抗性平板上涂抹均勻，在37 ℃的溫度下培養(yǎng)6 h)。之后選取克隆菌落進(jìn)行PCR檢測及測序鑒定。

1.2.3 慢病毒的包裝及滴度的測定 重組的慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后8 h內(nèi)更換為完全培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)染48 h。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液應(yīng)用超濾法濃縮病毒分裝后放于-80 ℃冰箱中保存。將10 μL的病毒原液放置在第1個EP管中混勻，再從第1管中取10 μL混合液于下一EP管中混勻，后依次稀釋病毒顆粒至第8管，將96孔板中的培養(yǎng)基吸出，每孔加90 μL病毒顆粒稀釋液，培養(yǎng)24 h后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)量。

1.2.4 目的細(xì)胞NRK-52E慢病毒感染 將NRK-52E的細(xì)胞懸液接種于12孔板中，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待目的細(xì)胞融合度達(dá)到約30%左右時，加入病毒。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基培養(yǎng)，感染5 d后收集目的細(xì)胞，進(jìn)行PCR檢測。病毒感染前1天將NRK-52E 接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。感染當(dāng)天將細(xì)胞分為三個大組：(1)正常細(xì)胞組(未感染任何病毒)；(2)陰性對照組(正常目的細(xì)胞加陰性對照病毒)；(3)病毒感染組(正常目的細(xì)胞加RNAi靶點(diǎn)病毒感染，包括ILK-KD-1、ILK-KD-2、ILK-KD-3、ILK-KD-4共四組)。

1.2.5 內(nèi)源篩靶RT-PCR驗(yàn)證 感染5 d后收集以上6個實(shí)驗(yàn)組對數(shù)生長期細(xì)胞1×107加入1 mL Trizol 勻漿后按照說明書提取總RNA。采用M-MμLV基因mRNA拷貝數(shù)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，按2-△△Ct法計(jì)算。

1.3 PCR陽性克隆進(jìn)行測序分析 由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié) 果

RT-PCR及WB檢測顯示4條靶點(diǎn)干擾序列中，ILK-RNAi(2)、ILK-RNAi (3)敲減效率均>65%，本實(shí)驗(yàn)選用ILK-RNAi(2)為靶點(diǎn)干擾序列，以下就 ILK-RNAi(2)的構(gòu)建結(jié)果做一說明：WB檢測ILK-RNAi(2)、ILK-RNAi(3)在細(xì)胞中的敲減效率(見圖1)。根據(jù)RT-PCR檢測結(jié)果提示NRK-52E細(xì)胞中ILK基因?yàn)?.522，NC對照組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞ILK的2-△△Ct為1.00，KD2組細(xì)胞ILK的2-△△Ct為0.217，KD4組細(xì)胞ILK的2-△△Ct為0.337。(2)載體酶切結(jié)果：病毒經(jīng)酶切后產(chǎn)物以1.2%瓊脂凝膠電泳后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)，可見病毒經(jīng)酶切后為單一條帶，大小約8 kb(圖2)。(3)陽性克隆PCR結(jié)果：根據(jù)測序結(jié)果以堿基形式表示ILK-RNAi(2) 序列為：CCGGAAGCTGTTGCAATACAAGGCTCTCGAGAGCCTTGTATTGCAACAGCTTTTTTTG(圖3)。(4)慢病毒轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞后，鏡下觀察熒光表達(dá)情況：慢病毒感染NRK-52E細(xì)胞72 h后，能夠觀察到GFP穩(wěn)定表達(dá)，空白對照組無綠色熒光表達(dá)，陰性對照序列病毒(NC-ILK)轉(zhuǎn)染后未出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)，細(xì)胞生長形態(tài)正常，GFP表達(dá)正常。有效序列病毒(KD-ILK)轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞生長形態(tài)正常，GFP表達(dá)最強(qiáng)(見圖4a～f)。

圖1 KD-ILK有效序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的WB圖

圖2 載體酶切后電泳圖 圖3 陽性克隆電泳圖

3 討 論

目前，ILK作為細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中的重要細(xì)胞因子，其作用機(jī)制的研究越來越受關(guān)注，作為一種新興技術(shù)，RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)是一種通過由外源性或內(nèi)源性雙鏈小分子RNA特異性抑制靶蛋白的生成表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)蛋白合成的減少，從而達(dá)到基因表達(dá)沉默的調(diào)控技術(shù)[1]。慢病毒(lentivirus)載體介導(dǎo)RNAi作為現(xiàn)在常用的實(shí)驗(yàn)方式[3-5]。正是通過整合進(jìn)入宿主基因組，進(jìn)而達(dá)到長期穩(wěn)定調(diào)控載體基因的表達(dá)。近年來在轉(zhuǎn)基因動物、基因治療等研究中得到廣泛運(yùn)用，并在這些領(lǐng)域中擔(dān)任重要角色。

D.Zhang等[6]觀察到在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型腎小管間質(zhì)纖維化過程中存在TGF-β1/Smads/ILK信號通路蛋白分子表達(dá)上調(diào)，趙敬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的過程中存在著TGF-β1-Smad2/3-ILK信號通路。R.Ortega-Velazquez等[8]通過干預(yù)后下調(diào)TGF-β1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)也同時會伴隨ILK表達(dá)的相應(yīng)變化，以上研究提示ILK不僅參與TGF-β1介導(dǎo)的信號通路，而且其表達(dá)受到TGF-β1的影響。TGF-β/Smads信號通路作為腎間質(zhì)纖維化中的研究熱點(diǎn)，目前多項(xiàng)研究正在尋找有效抑制該通路信號傳導(dǎo)途徑中的細(xì)胞因子及其下游產(chǎn)物表達(dá)的siRNA，嘗試運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，從而抑制或減緩腎間質(zhì)纖維化過程，起到保護(hù)腎臟的作用。為了進(jìn)一步研究TGF-β1/Smads/ILK信號通路中ILK的功能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)使用RNA干擾技術(shù)獲得穩(wěn)定降低ILK基因表達(dá)的NRK-52E細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)中通過設(shè)計(jì)構(gòu)建病毒干擾序列，經(jīng)過酶切測序驗(yàn)證后成功構(gòu)建ILK慢病毒載體。通過RT-PCR及WB驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞后可引起ILK基因表達(dá)的下調(diào)，這次實(shí)驗(yàn)將為后續(xù)在腎間質(zhì)纖維化等相關(guān)信號通路的機(jī)制研究中，提供重要的研究基礎(chǔ)。

[1] 白志勛. TGF-β1/Smads/ILK信號通路在環(huán)孢素誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用[D]. 遵義醫(yī)學(xué)院, 2013：5.

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Construction and characterization of RNAi lentiviral vector targeting rat ILK gene

BaiZhixun1,Lujing2,YangYibin1.

1.DepartmentofNephrology&Rheumatology,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,Guizhou,China. 2.ZunyiFachhochschulofMedicine,Zunyi563000,Guizhou,China.

Objective To lay the basis for the following study on epithelial-mesenchymal transition and signal pathway through construction of RNA interference (RNAi) lentiviral vector targeting rat integrin-linked kinase (ILK)gene. Methods The complementary oligo DNA containing target sequence was designed, synthesized and cloned into the pGCSIL-GFP vector according to the effective sequence of small interfering (siRNA) targeting ILK gene. The obtained lentiviral vector which expressed short hairpin RNA containing ILK was confirmed by PCR and sequencing. All virus stocks were produced and then transfect into NRK-52E cells in vivo, the titer virus was tested according to the expression level of GFP. ILK expression was assayed by Real-time PCR and Western blotting. Results ILK interference vector was successfully constructed. The titer virus with was 5×108, 2.5×108, 3.5×108pfu/mL. ILK expression in NRK-52E cells could be knockdown by virus infection as characterized by more than 65% decrease of ILK mRNA. Compared with negative control lentivirus, the value expression of KD-2 and KD-3 were 0.337 and 0.217 respectively, the function of ILKsiRNA-2 was significant. Conclusion The recombinant lentiviral shRNA expressing vector targeting rat ILK gene has been successfully constructed and packaged.

NRK-52E; ILK; Lentiviral

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目( NO: 黔教科2010044),[遵市科合社字(2012)42號]

R392

A

1000-744X(2016)07-0675-03

2016-03-09)

△通信作者，E-mail:yyb1011@sina.com