CXCL1在重度腦外傷患者中的表達和意義

劉蘇，孫李穎，孫麗，吳勤峰，沈光宇

CXCL1在重度腦外傷患者中的表達和意義

劉蘇1，孫李穎2，孫麗1，吳勤峰1，沈光宇1

目的研究趨化因子CXCL1在重度腦外傷(TBI)患者腦組織中的細胞定位及在腦組織和血液中的表達，探討其與損傷嚴重程度的關(guān)系。方法2013年9月至2015年10月，選取重度TBI住院、且行開顱手術(shù)患者78例為實驗組，所有患者均收集血液，其中19例收集到腦組織。實驗組根據(jù)入院時格拉斯哥昏迷量表(GCS)評分分為重型TBI組(6～8分，n=35)和特重型TBI組(3～5分，n=43)。10例病例對照組腦組織標本來自摘除的腦血管瘤或良性腫瘤邊緣少量正常腦組織。10例健康對照組血液來自同期在本院健康體檢正常者。采用免疫熒光雙標法檢測重度TBI患者CXCL1在腦組織中的細胞定位；ELISA法檢測損傷后腦組織和不同時間點血液中CXCL1蛋白的表達；Spearman相關(guān)分析對不同時間點外周血中CXCL1蛋白含量與術(shù)后30 d格拉斯哥結(jié)局量表(GOS)評分進行相關(guān)性分析。結(jié)果正常腦組織內(nèi)CXCL1主要表達在星形膠質(zhì)細胞；重度TBI后，CXCL1主要表達在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。特重型TBI組CXCL1蛋白在腦組織中的含量高于重型TBI組(t=-12.58,P＜0.05)。重型TBI組CXCL1蛋白在血液中含量于術(shù)前達高峰，隨后逐漸下降，術(shù)后14 d仍高于健康對照組(P＜0.05)，術(shù)后30 d降至健康者水平(P＞0.05)。特重型TBI組CXCL1蛋白在血液中含量術(shù)前和術(shù)后1 d最高，其后逐漸下降，術(shù)后30 d仍高于健康者(P＜0.05)。術(shù)前至術(shù)后30 d，特重型TBI組CXCL1蛋白含量均高于重型TBI組(P＜0.05)。特重型TBI組術(shù)前血液中CXCL1蛋白含量與GOS評分呈負相關(guān)(r=-0.351,P＜0.05)。結(jié)論重度TBI后CXCL1表達明顯增高，且主要表達在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，同時CXCL1含量在一定程度上可以反映腦損傷的嚴重程度和預(yù)后。

腦外傷；CXCL1；表達；免疫熒光染色；相關(guān)性分析

[本文著錄格式]劉蘇，孫李穎，孫麗，等.CXCL1在重度腦外傷患者中的表達和意義[J].中國康復(fù)理論與實踐,2017,23(8):937-941.

CITED AS:Liu S,Sun LY,Sun L,et al.Expression and role of CXCL1 in patients with severe traumatic brain injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(8):937-941.

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)是致死致殘率最高的疾病之一，常遺留有認知、言語及運動功能障礙，嚴重危害人類生命安全和生活質(zhì)量。TBI造成的腦組織損害分原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，其中神經(jīng)炎癥反應(yīng)是TBI后繼發(fā)性損傷的重要原因之一，可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損[1-2]。

趨化因子是參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)的重要物質(zhì)。我們前期動物研究和文獻報道研究表明，TBI后趨化因子迅速升高誘發(fā)或參與神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，而相關(guān)臨床研究未見報道[3-5]。本研究旨在觀察趨化因子CXCL1 (chemokine(C-X-C motif)ligand 1)在重度TBI患者腦組織中的細胞定位及在腦組織和血清中的表達變化，探討CXCL1在TBI中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2013年9月至2015年10月，選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院因重度TBI住院行開顱手術(shù)患者78例為實驗組。

實驗組納入標準：①明確高空墜落、車禍等外傷史，通過CT或MRI診斷明確；②入院時格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale,GCS)評分3～8分；③入院后當(dāng)天行清除血腫及碎裂腦組織開顱手術(shù)；④無心、肺、肝、腎等重要臟器嚴重病變。

實驗組根據(jù)入院時GCS評分再分為重型TBI組(6～8分，n=35)和特重型TBI組(3～5分，n=43)。所有患者均收集到血液，年齡22～76歲，平均(52.74± 14.44)歲；其中有19例(重型TBI組9例，特重型TBI組10例)收集到腦組織，樣本來自手術(shù)中吸除的碎裂腦組織，年齡25～64歲，平均(49.68±10.73)歲，其中2例患者(特重型TBI組)術(shù)后第2天死亡。

口岸的工作在一年四季中都沒有停歇的時刻，堅守口岸工作崗位的各類工作人員是口岸運行得以暢通、平穩(wěn)、高效的基礎(chǔ)。這份工作責(zé)任重大，每一次邊檢不僅僅是代表從一地區(qū)進入另一地區(qū)的簡單檢查，更代表的是國家形象，是國家能力、國家技術(shù)水平和國家形象的綜合體現(xiàn)。而常年駐守在這里的另一批人，是來自全國各地的邊防戰(zhàn)士和武警官兵，二連浩特的冬天是十分寒冷的，即使是大白天提著杯子出去走一圈杯子里的水也會結(jié)冰。二連浩特口岸是距離祖國偉大首都最近的陸上口岸，是保衛(wèi)首都安危的重要門戶，即使環(huán)境在如何艱苦，他們都無怨無悔，駐守在祖國北方的門戶，忠誠守護著祖國的北大門，保衛(wèi)著祖國北方領(lǐng)土、主權(quán)的完整和安全。

病例對照組腦組織樣本來自于同期本院神經(jīng)外科診斷為腦血管瘤或良性腫瘤需行開顱手術(shù)且排除TBI及其他中樞出血、梗死、惡性腫瘤等疾病的患者，術(shù)后已經(jīng)病理檢查明確診斷，取摘除的血管瘤或良性腫瘤邊緣少量正常腦組織，共10例，年齡39～62歲，平均(50.50±6.60)歲。

健康對照組血液來自同期在我院健康體檢正常者，共10例，年齡23～65歲，平均(51.22±12.09)歲。

腦組織及血液標本的獲取均經(jīng)患者或其家屬同意，并通過南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 腦組織中CXCL1的細胞定位

采用免疫熒光雙標染色法檢測腦組織中CXCL1的細胞定位。將甲醛固定后腦組織進行蔗糖梯度脫水和冰凍切片，于0.01 mol/L PBS溶液中清洗，加入5%羊血清封閉液室溫孵育2 h后，加入2.5%羊血清抗體稀釋液稀釋的一抗，4℃過夜。具體一抗如下：兔抗人CXCL1(1∶50，武漢博士德)和小鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)(1∶6000，MERCK MILLIPORE)或小鼠抗人NeuN(1∶1000，MERCK MILLIPORE)或大鼠抗人CD11b(1∶50，ABD SEROTEC)。

用0.01 mol/L PBS清洗玻片后加入0.01 mol/L PBS稀釋的二抗，室溫下避光孵育2 h。具體二抗如下：Alexa Fluor 488-羊抗小鼠-IgG(1∶1000，INVITROGEN)、Alexa Fluor 488-羊抗大鼠-IgG(1∶1000，INVITROGEN)和Cy3-羊抗兔-IgG(1∶1000，INVITROGEN)。避光條件下用0.01 mol/L PBS清洗，行組織切片裱片，于熒光顯微鏡下觀察并攝片。

1.3 腦組織和外周血中CXCL1蛋白表達

采用ELISA法檢測腦組織和外周血中CXCL1蛋白表達。分別在術(shù)前，術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d及30 d檢測外周血中CXCL1蛋白含量。將ELISA試劑盒(武漢博士德)放在室溫平衡30 min，直接加已用樣品稀釋液稀釋的樣本。嚴格按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟加入生物素抗人CXCL1抗體工作液、ABC工作液、TMB顯色液，最后用TMB終止液終止反應(yīng)。用酶標儀測定各孔在450 nm波長下的光密度(optical density,OD)值。根據(jù)標準品制備的標準曲線，計算各樣本中的CXCL1蛋白。

采用格拉斯哥結(jié)局量表(Glasgow Outcome Scale, GOS)在術(shù)后30 d進行評估以判斷預(yù)后，分為1分(死亡)、2分(持續(xù)性植物狀態(tài))、3分(重度殘疾)、4分(中度殘疾)和5分(恢復(fù)良好)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均以(xˉ±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，組間分析采用雙因素方差分析。采用Spearman相關(guān)分析對不同時間點外周血中CXCL1蛋白含量與術(shù)后30 d GOS評分進行相關(guān)性分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦組織內(nèi)CXCL1的細胞分布

本實驗采用免疫熒光法分別對CXCL1及神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞進行染色，通過熒光顯微鏡攝片，發(fā)現(xiàn)CXCL1在正常腦組織中主要與星形膠質(zhì)細胞的標記物GFAP共標，與神經(jīng)元的標記物NeuN和小膠質(zhì)細胞的標記物CD11b沒有共標(見圖1)；重度TBI后與星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元標記物均有共標(見圖2)。

2.2 腦組織CXCL1蛋白表達

特重型TBI組CXCL1蛋白在腦組織中的含量高于重型TBI組(P＜0.05)。見表1。

2.3 血液中CXCL1蛋白表達

重型TBI組CXCL1蛋白在血液中的含量于術(shù)前達高峰，隨后逐漸下降，術(shù)后14 d仍高于健康對照組(P＜0.05)，術(shù)后30 d降至健康者水平(P＞0.05)。特重型TBI組術(shù)前和術(shù)后1 d CXCL1蛋白含量最高，其后逐漸下降，術(shù)后30 d仍高于健康者(P＜0.05)。術(shù)前至術(shù)后30 d，特重型TBI組CXCL1蛋白含量均高于重型TBI組(P＜0.05)。見表2。

2.4 血液中CXCL1蛋白含量與GOS評分的相關(guān)性

重型TBI組不同時間點血液中CXCL1蛋白含量與GOS評分不相關(guān)(P＞0.05)；特重型TBI組術(shù)前血清中CXCL1蛋白含量與GOS評分呈負相關(guān)(P＜0.05)，其他時間點含量與GOS評分不相關(guān)(P＞0.05)。見表3～表4。注：a.重型TBI組與特重型TBI組比較。重型TBI組和特重型TBI組與健康對照組比較，除重型TBI組術(shù)后30 d外，其余均P＜0.05

3 討論

TBI后神經(jīng)炎癥反應(yīng)往往伴隨著腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的激活，趨化因子快速大量增加，這些因子在調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞功能方面起著重要作用[6-7]。本研究通過免疫熒光雙標染色發(fā)現(xiàn)，正常腦組織中CXCL1主要表達在星形膠質(zhì)細胞，重度TBI后CXCL1主要表達在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，提示CXCL1的表達上調(diào)與激活的星形膠質(zhì)細胞有關(guān)，有可能結(jié)合相應(yīng)受體作用于神經(jīng)元。

CXCL1屬于CXC趨化因子家族，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，是腦和脊髓外傷、神經(jīng)退行性疾病、癲癇、多發(fā)性硬化、腦局部缺血等多神經(jīng)系統(tǒng)病變重要的炎性介質(zhì)之一[8-12]。已有動物研究證實，大鼠TBI后損傷區(qū)皮層趨化因子CXCL1在4 h內(nèi)表達達到峰值，且維持時間長，有可能作為TBI的標記物[3]。在TBI急性期，CXCL1增高的同時中性粒細胞隨之聚集到腦損傷區(qū)[13]。Joanna等[14]研究也指出，大鼠TBI后脈絡(luò)膜上皮細胞通過分泌CXC趨化因子參與中性粒細胞的浸潤作用，提示CXCL1在TBI后炎癥反應(yīng)中起重要作用。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)，重型TBI患者和特重型TBI患者腦組織中CXCL1含量均明顯增高，且高于血液中含量。重型TBI患者CXCL1蛋白在血液中的含量于術(shù)前達高峰，術(shù)后14 d仍高于健康者，術(shù)后30 d降至健康者水平。特重型TBI患者CXCL1在術(shù)前和術(shù)后1 d含量最高，其后逐漸下降，術(shù)后30 d仍高于健康者。同時，術(shù)前至術(shù)后30 d，特重型TBI患者CXCL1均高于重型TBI組，顯示損傷越重，CXCL1在人體血液中的含量越高，說明CXCL1含量在一定程度上可以反映TBI患者腦損傷的嚴重程度。相關(guān)性分析研究顯示，特重型TBI患者術(shù)前外周血清中CXCL1含量與患者術(shù)后30 d GOS評分呈負相關(guān)，提示CXCL1含量高的患者預(yù)后不良。

CXCL1的主要作用受體是趨化因子受體2(chemokine C-C motif receptor 2,CXCR2)，CXCR2基因敲除動物腦損傷后中性粒細胞浸潤明顯下降，組織破壞減輕，同時神經(jīng)元凋亡和細胞死亡減少，CXCR2拮抗劑未來可能會用于治療TBI后神經(jīng)炎癥反應(yīng)[15]。

綜上所述，趨化因子CXCL1在重度TBI患者的神經(jīng)炎癥中可能發(fā)揮著重要的作用，但其具體作用機制尚不明確，有待于進一步研究。也許在未來CXCL1可以作為生物標記物用于判斷TBI的嚴重程度分級和預(yù)后，也有可能作為臨床治療的新靶點，減輕損傷后腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而減輕繼發(fā)性損傷，促進神經(jīng)功能恢復(fù)。

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Expression and Role of CXCL1 in Patients with Severe Traumatic Brain Injury

LIU Su1,SUN Li-ying2,SUN Li1,WU Qin-feng1,SHEN Guang-yu1
1.Department of Rehabilitation Medicine,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong,Jiangsu 226001, China;2.Changzhou Maternal and Child Health Care Hospital,Changzhou,Jiangsu 213003,China

SHEN Guang-yu.E-mail:sgyrm@163.com

ObjectiveTo explore the cellular localization of chemokine(C-X-C motif)ligand 1(CXCL1)in brain tissue and its expression in brain tissue and blood in patients with severe traumatic brain injury(TBI),as well as its correlation with the injury severity.Methods From September,2013 to October,2015,78 cases of TBI with craniotomy admitted to our hospital were involved as TBI group.A total of 78 peripheral blood samples and 19 brain tissue samples were studied.According to the scores of Glasgow Coma Scale(GCS)at admission,the TBI group was classified as severe TBI group(6～8,n=35)and particularly severe TBI group(3～5,n=43).Ten cases of control brain tissue were taken from patients with cerebral aneurysms or benign tumor and also undergoing craniotomy during the same time.Peripheral blood from ten healthy people were involved as the healthy control group.Immunofluorescent double staining was used to detect the cellular localization of CXCL1 in brain tissues,and ELISA was used to detect the expression of CXCL1 in brain tissue and blood.The relationship between the level of CXCL1 in peripheral blood at different time and the score of Glasgow Outcome Scale(GOS)was analyzed with Spearman correlation analysis.Results In normal brain tissue,CXCL1 mainly localized in astrocytes.For severe TBI,CXCL1 mainly expressed in neurons and astrocytes.The level of CXCL1 was higher in brain tissue in the particularly severe TBI group than in the severe TBI group (t=-12.58,P＜0.05).In the severe TBI group,the level of CXCL1 in blood reached a peak before surgery,then gradually decreased,and was still higher than that in the healthy control group 14 days after surgery(P＜0.05),however,no significant difference was found 30 days after surgery compared to the healthy control group(P＞0.05).In the particularly severe TBI group,the level of CXCL1 in blood reached a peak before and one day after surgery,then gradually decreased,and was still higher than that in the healthy control group 30 days after surgery (P＜0.05).The level of CXCL1 in blood was higher in the particularly severe TBI group than in the severe TBI group at all time points(P＜0.05),and the level before surgery was negatively correlated with the score of GOS in the particularly severe TBI group(r=-0.351,P＜0.05). Conclusion The CXCL1 protein of injury brain tissue was mainly colocalized in neurons and astrocytes in severe TBI patients,and the expression was associated with injury severity and outcome.

traumatic brain injury;chemokine(C-X-C motif)ligand 1;expression;immunofluorescence staining;correlation analysis

R651.1

A

1006-9771(2017)08-0937-05

2017-02-27

2017-05-11)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.08.014

1.南通大學(xué)博士科研啟動基金項目(No.2016-2)；2.南通市科技計劃項目(No.MS22016044)。

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，江蘇南通市226001；2.常州市婦幼保健院，江蘇常州市213003。作者簡介：劉蘇(1977-)，女，漢族，江蘇揚州市人，博士，副教授，主要研究方向：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與修復(fù)。通訊作者：沈光宇。E-mail:sgyrm@163.com。