C9orf72在肌萎縮側索硬化發(fā)病機制中的作用

潘治斌 唐春燕 徐仁伵

(九江市第一人民醫(yī)院神經內二科，江西 九江 332000)

C9orf72在肌萎縮側索硬化發(fā)病機制中的作用

潘治斌 唐春燕1徐仁伵1

(九江市第一人民醫(yī)院神經內二科，江西 九江 332000)

C9orf72；肌萎縮側索硬化；致病機制

肌萎縮側索硬化(ALS)是一種累及上下運動神經元的慢性進行性神經退行性疾病?；颊咧饕憩F(xiàn)為肌肉萎縮、腱反射亢進等上下運動神經元損害的癥狀、體征。ALS目前尚無有效的治療方法，患者多于3～5年內死于呼吸機麻痹。目前認為ALS的發(fā)病與遺傳因素、病毒感染、氧化應激、興奮性氨基酸毒性、神經營養(yǎng)因子缺乏等多種因素有關〔1〕。迄今為止已經發(fā)現(xiàn)多種ALS突變基因，如：SOD-1、TDP43、FUS、C9orf72、VAPB 、OPTN、UBQLN2、ATXN2等。早在2011年，Dejesus等〔2〕和Renton等〔3〕學者首次分別在ALS和額顳葉癡呆(FTD)患者檢測出C9oRF72基因GGGGCC六核苷酸重復擴增現(xiàn)象〔2，3〕，目前已被認為是ALS發(fā)病最主要的突變基因。本文對C9orf72基因在ALS發(fā)病中的作用做一綜述。

1 C9orf72基因及功能簡介

C9orf72基因(9號染色體開放閱讀框72基因)位于9號染色體短臂(9p21)，編碼11個外顯子，具有3個轉錄本，翻譯2個蛋白亞型。C9orf72基因的六核苷酸GGGGCC(G4C2)重復序列在非編碼區(qū)第1內含子內，位于1a和1b外顯子間。外顯子1a參與編碼轉錄本1和3，外顯子1b參與編碼轉錄本2。轉錄本2和3共同翻譯長的蛋白亞型a，轉錄本1則翻譯短的蛋白亞型b。C9orf72基因正轉錄方向產生GA、GR、 GP聚合物，反轉錄方向翻譯PA、GP、PR聚合物。在ALS患者神經系統(tǒng)，C9orf72主要存在表達于神經元細胞內。C9orf72的功能仍然不明確，有待進一步研究。有研究認為C9orf72功能與膜轉運及細胞自噬有關〔4〕。C9orf72被發(fā)現(xiàn)與Rab家族的多個Rab存在共定位，如介導細胞內吞作用的Rab5、Rab7，及介導細胞自噬的Rab1、Rab11，這種共定位可在培養(yǎng)的神經元的細胞中發(fā)現(xiàn)，但在C9orf72陽性的ALS患者顯著增強〔5〕。同時發(fā)現(xiàn)C9orf72陽性的神經元細胞存在膜轉運減弱及自噬體形成障礙。

2 C9orf72 G4C2致病重復

在健康人群，C9orf72的G4C2重復次數(shù)在2～23之間波動，90%的歐洲人G4C2重復次數(shù)在2～10之間，正常人>30的重復次數(shù)比較罕見。正常范圍內重復次數(shù)分為短長度重復次數(shù)(<7次)和中間長度重復次數(shù)(7～23次)，中間長度重復次數(shù)可致基因轉錄活性降低，更傾向于致病，具體機制尚不明確。在FTD和ALS G4C2重復擴增達700～1 600，甚至達幾千〔2，3〕。20至數(shù)百個重復次數(shù)在健康人群及FTD和ALS患者均有報道。目前上百個G4C2重復被認為是致病的，但最小的G4C2致病重復次數(shù)仍然是不清楚。

3 C9orf72 G4C2致病重復相關疾病

從流行病學角度，C9orf72 G4C2致病重復在肌萎縮側索硬化、額顳葉癡呆、帕金森病等多種神經變性病患者基因中被檢測到。歐美的大型研究發(fā)現(xiàn)，50%～60%的家族性ALS和10%的散發(fā)性ALS患者存在C9orf72 G4C2致病重復〔6〕。國內針對中國漢族人群200例ALS的GWAS研究也檢測出9例C9orf72突變〔7〕。C9orf72相關的ALS發(fā)病時間早，病情進展迅速，常伴有認知障礙和行為異常。

FTD主要表現(xiàn)為行為異常和認知功能減退，神經影像學表現(xiàn)為額葉和顳葉皮質萎縮。40%～50%的FTD患者有明確的家族史，多為常染色體顯性遺傳。根據(jù)數(shù)據(jù)，18%-24%的家族性FTD及6%-10%的散發(fā)性FTD患者發(fā)病主要原因是C9orf72 G4C2致病重復擴增〔8〕。C9orf72 G4C2重復相關的ALS常有癡呆等FTD癥狀，部分FTD的患者也會出現(xiàn)ALS的表現(xiàn)，說明ALS-FTD可能存在共通的致病原因，可能與C9orf72 G4C2致病重復有關。

TDP-43包涵體形成是FTD和ALS共同的病理特征。Hsiung等〔9〕發(fā)現(xiàn)C9orf72 G4C2致病重復相關的FTD患者的多個腦區(qū)存在廣泛的TDP-43包涵體，如額葉運動皮層、海馬、下運動神經元，這些患者有的同時有典型的ALS的臨床表現(xiàn)。值得一提的是，TDP-43不是C9orf72 G4C2致病重復單一的致病機制。在小腦皮質顆粒細胞檢測出了泛素/P62陽性、TDP-43陰性的包涵體，說明泛素/P62也參與C9orf72G4C2重復的神經病理學。

臨床診斷的PD患者C9orf72G4C2重復的檢出率較低，僅有不到1%的患者存在G4C2重復擴增，其中>60個重復次數(shù)的不到0.2%。更大型的全球化的研究檢出率更是只有0.055%。有趣的是，G4C2重復陽性的帕金森病患者通常癥狀不典型，并通常伴有進行性的癡呆。也有報道發(fā)現(xiàn)G4C2重復擴增在進行性核上性眼肌麻痹、多系統(tǒng)萎縮、皮質紋狀體變性等帕金森綜合征患者被檢出，但陽性率較低〔10〕，目前主要認為C9orf72G4C2重復擴增不是PD主要的病因。

C9orf72致病性G4C2重復擴增也在阿爾茨海默病、亨廷頓病等神經系統(tǒng)疾病中檢測到，但都不是主要的致病原因。C9orf72 G4C2致病重復可能與這一類疾病相關，看似獨立的疾病之間可能存在共同的神經病理及分子致病機制。

4 C9orf72致病機制

關于C9orf72六核苷酸重復序列如何致病仍然是不明確的，目前主要存在三種假說：(1)C9orf72基因表達減少及功能喪失；(2)重復系列轉錄的RNA毒性；(3)C9orf72六核苷酸重復序列誘發(fā)異常蛋白聚集。

4.1C9orf72基因蛋白表達減少及功能喪失 有學者提出，C9orf72基因G4C2重復序列是一種“功能失活突變”〔11〕，重復序列引起C9orf72基因原有的功能受損或喪失。G4C2重復序列在轉錄本1和3位于內含子內，在轉錄本2位于啟動子中。最早有學者在體外培養(yǎng)的C9orf72轉基因細胞內發(fā)現(xiàn)轉錄本2的轉錄水平下降。另外有實驗〔12〕在C9orf72相關的ALS/FTD患者神經元內發(fā)現(xiàn)C9orf72基因表達水平下降。

關于C9orf72G4C2重復擴增如何影響C9orf72表達水平有多種假說。G4C2重復擴增的DNA、RNA可形成G-四鏈體和R-循環(huán)結構，C9orf72重復擴增相關的DNA可形成維持穩(wěn)定的G-四鏈體和抗穩(wěn)定的G-四鏈體，而RNA只能形成抗穩(wěn)定的G-四鏈體，這種特殊的特征可直接影響RNA轉錄、剪接及翻譯過程，導致C9orf72轉錄障礙。Haeusler在C9orf72轉基因細胞內發(fā)現(xiàn)特異性結合C9orf72重復擴增G-四鏈體結構的核仁素蛋白在細胞核內存在錯誤定位，這可引起細胞核功能障礙及基因轉錄水平降低〔13〕。

另外，基因過甲基化也被認為是影響轉錄的重要原因。已發(fā)現(xiàn)G4C2重復可引起C9orf72基因座過甲基化。CpG島的胞嘧啶過甲基化被認為是包括C9orf72 G4C2重復在內的重復擴增相關疾病引起基因表達減少的原因之一〔14〕。伴隨著G4C2重復擴增，CpG堿基大量增加，這為CpG島過甲基化提供了豐富的材料。實際上，運用亞硫酸氫鹽測序檢測CpG島甲基化已經發(fā)現(xiàn)C9orf72突變攜帶者存在C9orf72基因座過甲基化。除了CpG甲基化以外，在表觀遺傳學角度，賴氨酸殘基的組蛋白甲基化也被認為是影響基因表達的重要原因。已經有研究在C9orf72突變者的血液C9orf72基因發(fā)現(xiàn)組蛋白H3、H4三甲基化〔15〕。

這些假說只是闡述C9orf72基因表達減少的部分機制，且仍有待進一步驗證。

4.2獲得性RNA毒性 獲得性RNA毒性被認為是C9orf72G4C2重復擴增致病的重要原因。為了驗證C9orf72陽性的ALS/FTD患者是否存在RNA灶，Dejesus-Hernandez等〔2〕對C9orf72陽性的ALS/FTD患者額葉皮層及脊髓切片進行RNA熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)25%的細胞核內存在多個RNA灶。Mizielinska等〔16〕也發(fā)現(xiàn)C9orf72陽性的ALS/FTD患者皮層、小腦、海馬及脊髓的運動神經元細胞、形成膠質細胞、小膠質細胞內存在RNA灶，其中運動神經元細胞內明顯多于其他細胞，這也進一步說明RNA灶可能特異性損傷運動神經元。另外，這一發(fā)現(xiàn)也在體外實驗中得到重復。Donnelly等〔17〕誘導C9orf72陽性的多功能干細胞特異性分化成運動神經元細胞，并在細胞核內檢測到RNA灶形成。

多項研究證明RNA灶產生細胞毒性。有學者發(fā)現(xiàn)C9orf72 G4C2重復擴增的神經元細胞，尤其是運動神經元細胞的自發(fā)活動減少〔18〕。同時，多功能干細胞分化的神經元細胞也出現(xiàn)興奮性谷氨酸毒性增強，這也是ALS發(fā)病的重要原因之一。G4C2重復序列轉錄或反轉錄的RNA在細胞核內聚集形成RNA灶，RNA灶可分離RNA結合蛋白，使RNA結合蛋白在細胞內的正常功能喪失，如mRNA選擇性剪接作用。

然而，受影響的究竟是哪種RNA結合蛋白，這仍在研究中。值得一提的是一種與RNA灶毒性密切相關的疾病，強直性肌營養(yǎng)不良I型(DM1)。DM1發(fā)病主要是DMPK基因CTG致病重復擴增。已經發(fā)現(xiàn)DM1的特異性RNA結合蛋白MBNL，上調MBNL后的DM1小鼠模型癥狀可明顯改善〔19〕。這為尋找C9orf72 G4C2重復擴增的特異性RNA結合蛋白提供了一個方向，已經提出了多種可能，如SRSF2，hnRNP H1/F，ALYREF，hnRNPA3，hnRNPA1，hnRNP-H，nucleolin，Pur-α，ASF/SF2，ADARB2，RanGAP1等，這些蛋白需要在未來的研究中進一步明確。

4.3異常蛋白聚集 錯誤折疊的蛋白質在細胞內異常聚集、形成包涵體是許多包括ALS在內的神經退行性疾病的特征。如阿爾茨海默病的β-淀粉樣蛋白、帕金森病的α-突觸核蛋白等。眾所周知，ALS患者神經元細胞內存在TDP-43包涵體，這是ALS特征性病理改變。C9orf72 G4C2重復擴增被認為與蛋白質異常聚集密切相關。G4C2重復轉錄及反轉錄的RNA通過異常的RAN翻譯模式(重復序列相關非ATG模式)，翻譯出二肽重復蛋白(DPRs)GA、GR、GP、PA、GP、PR聚合物，這些蛋白在神經細胞內異常聚集產生神經毒性。DPRs聚合物廣泛存在于C9orf72陽性的大腦皮層、小腦及海馬神經元細胞內。目前已經有多項實驗證明DPRs可引起神經退行性病變。有實驗發(fā)現(xiàn)，在缺乏RNA灶的初級神經元細胞，GA聚合物的表達可破壞蛋白酶體的活性，誘發(fā)內質網(wǎng)氧化應激，產生神經毒性〔20〕。另外，有研究認為，GA聚合物可誘導毒性淀粉樣蛋白在細胞內異常聚集，并以類似朊病毒感染的方式在細胞間傳播〔21〕。GA聚合物的毒性也在動物實驗中得到驗證。C9orf72轉基因小鼠產生豐富的GA病理改變，表現(xiàn)出神經退行性改變及行為異常，這可能是由于GA影響了參與蛋白酶體降解的HR23的分離。

PR、GR聚集物也參與神經損傷過程。在中樞神經系統(tǒng)膠質細胞，PR、GR聚集物重組可引起大量RNA加工改變，產生神經毒性。DPRs可進入神經元細胞核內，并與核仁定位相同，者意味著DPRs可影響rRNA的加工過程〔22〕。體內及體外實驗均已證實，PR聚合物可在運動神經元細胞核內聚集，引起神經元死亡〔23〕。在果蠅體內，GR、PR 50以上的重復可產生神經毒性。

研究認為，C9orf72可引起胞核胞質轉運功能障礙〔24〕。RNA及產物蛋白轉入轉出細胞核是細胞內重要的高度調節(jié)的過程。核質轉運功能障礙可解釋包括TDP-43在內的RNA結合蛋白在細胞質內異常聚集的現(xiàn)象。這些猜想仍有待進一步證實。

綜上所述，近年來關于C9orf72G4C2致病重復的研究有了一定的認識，但對于C9orf72基因的確切功能、重復次數(shù)與疾病發(fā)生的關系、G4C2重復擴增具體的致病機制等問題仍然缺乏確切的解釋。鑒于C9orf72 G4C2致病重復是引起ALS的主要的遺傳性病因，同時又與FTD等其他一類神經退行性疾病相關，因此在現(xiàn)有研究的基礎上進行進一步的探索是十分必要的，這將為ALS的治療提供新的靶點。

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〔2016-11-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

R744.8

A

1005-9202(2017)18-4677-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.115

國家自然科學基金資助項目(30560042，81160161，81360198)

1 南昌大學第一附屬醫(yī)院神經科

徐仁伵(1969-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事肌萎縮側索硬化和帕金森病的發(fā)病機制和防治研究。 唐春燕 (1992-)，女，碩士，主要從事肌萎縮側索硬化的防治研究。

潘治斌(1983-)，男，碩士，主要從事肌萎縮側索硬化的防治研究。