豬瘟分子生物學檢測技術的研究進展

石遠菊，湯德元，曾智勇，王 彬，黃 濤，韋冠東，胡玲玲，龍冬梅，楊 偉，葉 麗

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬瘟分子生物學檢測技術的研究進展

石遠菊，湯德元*，曾智勇，王 彬，黃 濤，韋冠東，胡玲玲，龍冬梅，楊 偉，葉 麗

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，嚴重制約著我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。文章主要針對豬瘟病毒的反轉錄-聚合酶鏈式反應技術、反轉錄巢式PCR技術、多重反轉錄-聚合酶鏈式反應技術、反轉錄實時熒光定量PCR技術及環(huán)介導等溫核酸擴增技術等5種分子生物學檢測技術的國內(nèi)外最新研究進展進行綜述，以期提高對豬瘟病毒早期感染和隱性帶毒豬的檢出率，淘汰野毒感染豬群，為豬瘟的凈化和防控提供重要診斷參考依據(jù)。

豬瘟；分子生物學；快速診斷；檢測技術

豬瘟（Classical swine fever CSF）又名古典豬瘟、豬霍亂，我國又將其稱為爛腸瘟，是由豬瘟病毒(Classical swine fever Virus，CSFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以發(fā)病急、高熱稽留和細小血管壁變性，引起全身皮膚、黏膜和漿膜泛發(fā)性小出血點，脾臟梗死為特征。豬瘟的發(fā)生沒有季節(jié)性，各種年齡段和不同種類的豬群均可感染，典型豬瘟發(fā)病率和死亡率都高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。全世界許多國家都對該病制定了根除計劃，據(jù)報道，有的國家已經(jīng)成功地凈化了豬瘟。我國是發(fā)展中國家，物力和財力有限，對歐洲國家采取的檢疫撲殺措施難以承受。近年來，隨著豬瘟兔化弱毒疫苗的廣泛使用，我國豬瘟的流行情況和發(fā)病特點發(fā)生了很大的變化，主要表現(xiàn)為：病程明顯延長，由急性和亞急性轉變?yōu)槁詾橹鳎徊≡玖档?，易出現(xiàn)持續(xù)感染、胎盤垂直感染、妊娠母豬帶毒綜合征及新生仔豬的免疫耐受等，發(fā)病率和死亡率明顯下降；流行情況從頻發(fā)的大流行轉變?yōu)闊o規(guī)律的地區(qū)性散發(fā)性流行，疫點顯著減少；臨床癥狀由典型轉變?yōu)榉堑湫蜏睾托载i瘟和母豬帶毒綜合征。豬瘟的非典型性給豬瘟的診斷帶來了新的困難，盡管常規(guī)的臨床診斷和實驗室診斷（豬體回歸感染試驗、兔體交叉免疫試驗、病毒分離鑒定、瓊脂擴散試驗、中和試驗、免疫膠體金技術、金標卡診斷、新城疫病毒強化試驗、免疫熒光試驗、間接血凝試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、髓細胞檢查法、免疫酶測定技術或酶標記抗體診斷法和單克隆抗體免疫過氧化物酶試驗等）對豬瘟的診斷有一定的幫助，但分子生物學檢測技術以其高特異性、高靈敏性在廣大的科研實驗中得到了廣泛的應用。

CSFV的分子生物學檢測技術主要包括：普通反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術、反轉錄巢式PCR(Nested RT-PCR)技術、多重反轉錄-聚合酶鏈式反應(mRTPCR)技術、反轉錄實時熒光定量PCR (RTFQ RT-PCR)技術及環(huán)介導等溫核酸擴增(RT-LAMP)技術等，現(xiàn)將這些分子生物學檢測技術的國內(nèi)外最新研究進展分述如下：

1 RT-PCR技術

RT-PCR技術是將扁桃體活體組織或病死豬的扁桃體、淋巴結、肺臟、脾臟、腎臟和大腦等組織研磨，提取RNA，然后進行RT-PCR擴增合成目的片段。該技術特異性較強、靈敏度較高、重復性好、易操作，整個實驗過程只需要幾個小時就能達到快速檢測的目的。

國外TitovI[1]等建立了RT-PCR技術和高分辨率融合（HRM）分析相聯(lián)合來鑒別CSFV疫苗株和野毒株的快速方法。該方法首先利用CSFV E2基因的最可變區(qū)的短片段進行RT-PCR擴增，隨后再用HRM來分析擴增的目的片段。實時PCR/HRM用于CSFV檢測和分化分析具有與RT-qPCR和基因分型相當?shù)撵`敏度分辨率且與E2核苷酸測序相當。該方法僅用一個步驟就能在現(xiàn)場樣品中進行CSFV的快速、靈敏的鑒定以及基因型的鑒別，操作簡單，對于基層豬瘟的快速診斷是非常有價值的。

秦玉明[2]在國內(nèi)外首次建立了原位RT-PCR法，該方法能檢測組織切片中的CSFV RNA分子，在檢測病毒的同時還可以初步觀察到組織的病理變化，將豬瘟病理學研究由組織病理學水平發(fā)展到分子病理學水平，為以后研究豬瘟的隱性感染和持續(xù)性感染的致病機理奠定了基礎。郭抗抗[3]等建立了一種能區(qū)分CSFV強毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR檢測方法，該方法可以從CSFV強毒株和兔化弱毒疫苗株中分別擴增出大小為187 bp和492 bp的特異性片段，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等豬源性病毒的檢測結果均為陰性，利用該方法可以從10份疑似豬瘟臨床樣品中分別檢測出豬瘟強毒和疫苗毒，說明該研究建立的RT-PCR方法具有較好的特異性，為豬瘟的早期診斷及疫苗免疫豬和野毒感染豬的鑒別提供了技術參考。

陳本龍[4]等成功建立了一種能夠區(qū)分豬瘟病毒強毒株HCLV株的RTPCR檢測方法，該法從豬瘟強毒株和兔化弱毒株中擴增出了大小分別為680 bp和785 bp的特異性片段，具有高度的特異性和敏感性。吳旭錦[5]等建立了豬瘟病毒的RT-nPCR檢測方法，該方法檢測CSFV cDNA含量的最低極限為6.7×10-5ng/L，從BVDV，PRRSV，PCV2，PRV和PPV等參考毒株中提取或反轉錄獲得的DNA/cDNA中不能擴增出目的條帶，說明該方法靈敏度高、特異性強。

湯德元[6]等通過對GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因組全序列比對，發(fā)現(xiàn)豬瘟兔化弱毒疫苗株3'-NTR獨立存在富含T的插入序列，根據(jù)這一特點分別在該插入序列的上、下兩端設計2對單一RTPCR引物并選擇特異保守區(qū)域設計了二重RT-PCR引物，優(yōu)化篩選能夠鑒別豬瘟野毒與兔化弱毒疫苗的PCR反應條件，建立了能鑒別豬瘟野毒和疫苗毒的單一與二重RT-PCR的鑒別診斷方法，該方法從豬瘟野毒株和兔化弱毒株中擴增出了大小分別為372 bp和140 bp的特異性片段；利用該方法進行敏感性和特異性分析，單一RT-PCR檢測CSFV各引物最低核酸檢測量分別為2.2 pg(單一RT-PCR中的1對引物)和1.7 pg(單一RT-PCR中的另外1對引物)；二重RT-PCR檢測CSFV各引物最低核酸檢測量分別為8.2 pg（豬瘟野毒)和6.7 pg（豬瘟疫苗毒)，兩種方法均未檢測到PRV，PRRSV，JEV，BVDV，PCV2的DNA/RNA；此外，還采用該方法對146份可疑臨床樣品進行檢測，豬瘟疫苗毒與野毒在繁殖母豬、育肥豬、保育豬和哺乳仔豬中的二重感染率分別為6.3%，7.4%，8.3%，8.6%。實驗結果表明：單一與二重RT-PCR方法均具有敏感性強、特異性高、重復性好的特點，該研究對規(guī)模化豬場豬瘟的凈化具有十分重要的參考價值。

2 Nested PCR技術

Nested PCR是一種變異的聚合酶鏈反應，使用兩對PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似，第二對引物（又稱為巢式引物）結合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的優(yōu)點在于：如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，Nested PCR的擴增特異性高。

羅勇[7]利用序列分析軟件（VectorNTI8），對NCBI數(shù)據(jù)庫中不同國家和地區(qū)發(fā)布的29株豬瘟野毒及6株疫苗毒株的E2基因序列及BVDV基因序列的相應位置進行了比較分析，設計了兩對引物，外套引物擴增E2基因中目的片段，大小為806 bp，內(nèi)套引物擴增大小為512 bp。經(jīng)各種反應條件的優(yōu)化，建立了豬瘟病毒套式RT-PCR檢測方法，運用該方法對中國獸藥監(jiān)察所提供的19株CSFV的核酸及6種豬源常見病原的核酸樣品進行檢測，其結果顯示：19株CSFV的核酸樣品檢測均呈陽性，其他樣品則為陰性；該方法的靈敏度與real-time RT-PCR相當，比普通RT-PCR提高了100倍。

楊若松[8]等建立的豬瘟病毒巢式RT-PCR檢測方法可以從拷貝數(shù)為102/μL的豬瘟病料中檢測到CSFV，具有很高的特異性、靈敏性、復核率以及重復性，而且建立的豬瘟病毒巢式RTPCR方法的引物序列均在具有CSFV序列的保守區(qū)，具有更好的應用前景。

劉梅芬[9]等參照GenBank中公布的CSFV E2基因保守區(qū)域序列設計2對特異性引物，以CSFV總RNA為模板，優(yōu)化反應條件，建立CSFV nested RTPCR方法，利用所建立的方法對35份臨床疑似CSFV感染樣品進行檢測，檢測到19個陽性樣品，并對陽性PCR產(chǎn)物進行克降測序鑒定，測序結果一致。結果表明：成功建立了CSFV nested RT-PCR檢測方法，能夠特異性地擴增CSFV，但對ST正常細胞對照和其他8種病原對照未擴增出任何條帶，穩(wěn)定性和重復性好，敏感性高，最低檢測病毒含量為1 TCID50/mL，適合早期檢測CSFV。

3 mPCR技術

多重PCR（mutiplex PCR）技術是PCR技術中的一種，該技術是在同一PCR管中加入多對特異性引物和多個對應的模板，之后進行PCR反應，在一個PCR管中同時檢測多個目標DNA分子。多重PCR技術可以擴增一個病毒的一個片段，也可以同時擴增多個病毒的不同片段，它具有快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，被廣泛用于各種病毒性疫病的快速診斷。

薛媛[10]針對PRRSV、CSFV和JEV的保守性基因序列，設計了3對引物用于擴增各目的基因序列，通過對引物濃度、退火溫度、Mg2+濃度等反應條件的優(yōu)化，建立了鑒別PRRSV，CSFV，JEV多重RT-PCR的診斷方法，其敏感性可達到CSFV 10-1pg，PRRSV 10-2pg，JEV 10-3pg級；此外，還具有較好的特異性，對CSFV，PRRSV，JEV己知陽性病料均能擴增出相應的片段，該方法為這3種病原的臨床診斷與鑒別提供了可供參考的方法。

Liu[11]等建立的多重RT-PCR技術可同時也可單獨檢測出PRRSV、GSFV和PCV2，其特異性、靈敏性較高，檢測3種病毒的靈敏度分別為2.0×104，2.5×103，6.0×102個拷貝數(shù)。

湯德元[12]等根據(jù)GenBank登錄的豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒和豬流感病毒6種常見病毒的相關保守基因序列分別設計一對特異性引物，通過對其條件的優(yōu)化，建立了檢測以上6種病毒的PCR/RT-PCR診斷方法，通過試驗證明：該檢測方法具有良好的特異性和敏感性，為檢測以上6種病毒提供了參考。湯德元[13]等還針對PRRSV，CSFV和SIV等3種常見病毒的相關保守基因設計特異性引物，通過對其條件的優(yōu)化，建立了3種呼吸道病毒的三重RT-PCR檢測方法，實現(xiàn)了上述3種病毒的同步檢測，能快速、準確地對臨床病料進行檢測，是一種實用、快速的檢測方法，具有廣闊的應用前景。湯德元[14]等通過比對分析GenBank中登錄的CSFV和PRV的相關基因序列，分別設計可以區(qū)分CSFV與PRV及其疫苗株的5對特異性引物，建立了其多重PCR鑒別檢測的方法，建立的多重PCR方法對CSFV和PRV擴增為陽性，而對PCV2、PRRSV、JEV和BVDV擴增結果均為陰性；最低核酸檢測量分別為1.7×103拷貝/ μL（CSFV野毒株）、9.9×103拷貝/ μL(CSFV-C疫苗株)、1.3×103拷貝/μL（Guizhou-DY）、6.9×103拷貝/μL(Bartha-K61)和5.5×103拷貝/μL(SA215)。該研究建立的多重PCR方法為從病原學方面快速鑒別CSF和PR疫苗毒與野毒提供了新的技術支撐，為規(guī)?；i場實現(xiàn)豬瘟與豬偽狂犬病的凈化提供一種新方法。湯德元[15]通過對多重PCR反應條件的優(yōu)化，以及臨床應用檢測，成功建立了能同時檢測PRV、PCV2、CSFV和SIV 4種病毒的多重PCR方法，還建立了能同時檢測PRV、PCV2、CSFV、PRRSV和SIV 5種病毒的多重PCR方法，以及能同時檢測PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PPV和SIV 6種病毒的多重PCR方法，建立的多重PCR最低檢測限均達到pg級水平，且具有較高的特異性。

冷依伊[16]等根據(jù)GenBank中登錄的參考病毒株序列，選擇非洲豬瘟病毒(ASFV)、水皰性口炎病毒(VSV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、豬瘟病毒(CSFV)以及豬偽狂犬病病毒(PRV)的保守序列設計5對特異性引物，通過優(yōu)化反應條件，建立了一種可以同時且快速檢測以上5種病毒的多重RT-PCR檢測方法，該方法對不同的細菌或病毒模板擴增結果均為陰性，特異性強；對PRV、CSFV、ASFV、VSV和FMDV的核酸最少檢出量分別為8.82×103拷貝/ μL、6.87×104拷貝/μL、5.71拷貝/μL、4.93×104拷貝/μL和4.32×102拷貝/μL。以上結果表明：該方法快速、靈敏、特異性強，對以上5種豬病病毒能夠進行快速鑒別檢測，為其臨床診斷與流行病學調(diào)查提供了有效的檢測方法。

王苗苗[17]等為了建立能夠同時檢測豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬細小病毒（PPV）的多重PCR，并用于豬場感染情況的動態(tài)監(jiān)控以及臨床診斷，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的5種病毒的基因序列，針對CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因，分別設計了特異性引物。在建立的單項PCR基礎上，通過優(yōu)化反應條件，建立了能同時檢測5種病毒的多重PCR，采用建立的多重PCR對127份疑似病豬的扁桃體活體組織進行檢測，檢出了5種病毒的存在，其中感染2種及以上病毒的樣品比例為39.6%（49/127），表明該方法是一種特異、快速、靈敏、高效的病原學檢測手段。

4 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR(RTFQ PCR)技術是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。其原理是在進行PCR擴增前，加入1對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針或SYBR GreenI熒光染料，該探針或染料為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時，探針結合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴增時，Taq酶的5'端-3'端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。RTFQ PCR技術通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來測定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離PCR產(chǎn)物，即能準確定量起始模板數(shù)；與普通PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化、程度高等優(yōu)點。

Pérez和Lester Josué[18]等描述了一種Real-time RT-PCR方法檢測CSFV，該方法是基于SYBR Green結合溶解曲線分析，在兩種Real-time PCR平臺進行分析和檢測并相互比較，其靈敏度較高，細胞培養(yǎng)和血清中CSFV最低可以檢測0.1 TCID50/反應，組織為1 TCID50/反應，去離子水、血清及組織中分別為1，10，100拷貝數(shù)/μL。Haines[19]等建立的多重實時RT-PCR方法能夠同時檢測CSFV及ASFV，同時檢測的靈敏性度為100%，特異性為CSFV100%，ASFV為97.3%。

石順利[20]根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬瘟保守基因序列設計特異性引物和探針，成功構建了實時熒光定量PCR的反應體系和反應參數(shù)，建立的實時熒光定量PCR體系靈敏度可以達到1×102拷貝的數(shù)量級，能特異性的與牛病毒性腹瀉黏膜病毒(BVDV)、羊口瘡病毒和羊痘病毒的區(qū)分。饒品彬[21]建立的EvaGreen多重實時熒光PCR，經(jīng)實時擴增能夠產(chǎn)生6個目的擴增產(chǎn)物熔解峰，從而可同時對這六種病毒進行檢測和區(qū)分。其中PCV2，PRRSV和JEV的檢測極限達到100 拷貝/μL，PPV，CSFV檢測極限可以達到250 拷貝/μL，PRV的檢測極限可以達到500 拷貝/μL；與利用SYBR Green I多重實時熒光PCR檢測相同或相關病毒比較，靈敏度高出10倍左右，具有高度特異性和良好重復性，并達到基于探針的多重實時熒光PCR檢測水平。

杜冬華[22]等根據(jù)CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差異，設計了2對特異性引物及1條TaqMan探針，以含CSFV HB株和C-株E2基因的重組質(zhì)粒pBS-E2C和pBS-E2作為標準品，建立了能同時檢測CSFV野毒株和疫苗株的雙重TaqMan real-time PCR鑒別檢測方法。結果表明：建立的CSFV雙重TaqMan real-time PCR標準曲線Ct值與1×101～1×106拷貝/μL之間的E2基因拷貝數(shù)呈良好的線性關系，靈敏度達10 拷貝/μL，且特異性和重復性很好，該試驗建立的TaqMan real-time PCR檢測方法可用于CSFV野毒株和疫苗株的鑒別診斷及病原定量分析，將為我國CSFV野毒株感染及疫苗免疫情況的調(diào)查與分析提供高效、快速的檢測手段，進而為更好的防控豬瘟的發(fā)生和流行奠定基礎。

5 RT-LAMP技術

環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術是眾多核苷酸擴增技術中的一種，其基本原理是針對靶序列的6個特異部位設計4條引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，從而使靶序列高效擴增。反轉錄介導等溫核酸擴增技術是檢測CSFV的一種新型核酸擴增技術，它的一系列引物是基于E2基因序列設計的，然后在63 ℃下孵育50 min進行病毒RNA的擴增，擴增產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)梯形分布來判定，還可以通過直接離心擴增產(chǎn)物觀察白色沉淀的生成并借助于專用比濁儀對結果進行判定，另外還可在擴增產(chǎn)物中加入SYBR Green I，根據(jù)顏色變化判定擴增結果。環(huán)介導恒溫擴增檢測方法是一種新興的分子生物學檢測方法，已廣泛應用于多種細菌病和病毒病的檢測，與其他檢測技術相比，該技術特異性強、靈敏度高、操作簡便，檢測速度快、無特殊設備要求，適用于基層及現(xiàn)場診斷使用。

Chowdry[23]等建立并且評估一種新型結合橫向流動油量尺檢測CSFV的LAPM技術(RT-LAPM-LFD)，這種RT-LAMP-LFD測定法結合了CSFV RNA的有效一步等溫擴增和LFD的簡單性，在2～5 min內(nèi)就可快速讀取結果，此方法靈敏性高，特異性強，操作簡單，而且檢測成本低，這種RT-LAMP-LFD測定有望成為診斷豬瘟的快速、簡單和經(jīng)濟的新技術。

何文博[24]建立了豬瘟強毒株與弱毒疫苗株的LAMP檢測技術，用建立的LAMP方法和RT-PCR方法檢測20份豬病料，符合率為90.91%，說明該方法是一種快速準確、特異性好、靈敏度高，適合基層使用的方法，真正實現(xiàn)了對病原微生物核酸的特異、敏感、高效和快捷檢測，為我國豬瘟防控與凈化提供技術支撐，對動物疫病多重感染的鑒別檢測具有重要意義。張改平[25]等建立的豬瘟強弱毒LAMP檢測方法，特異性好，比RT-PCR靈敏度高出1 000倍，且重復性和穩(wěn)定性良好，為快速準確地鑒別豬瘟野毒感染和疫苗接種感染提供了有效的方法。

朱俊靈[26]等針對CSFV NS5B基因設計一套特異性引物及生物素標記探針，結合異硫氰酸熒光素標記的擴增產(chǎn)物，建立RT-LAMP-LFD檢測方法，所建立的方法能夠特異地檢測出CSFV的存在，檢測PRRSV，JEV，PCV2等其他病毒均為陰性；所建立的CSFVRT-LAMP方法對RNA的最低檢測限為50 pg；反應快速，整個擴增反應可在1 h內(nèi)完成；操作簡單，不需要PCR儀等復雜的儀器，結果可經(jīng)肉眼觀察，應用RT-LAMP-LFD檢測CSFV特異性強、靈敏度高，并且操作安全、簡便、快捷，可以滿足基層檢疫的需要。

總之，豬瘟的診斷方法較多，其中間接血凝試驗（IHA）被農(nóng)業(yè)部推薦為豬瘟疫苗抗體檢測的主要方法，也是我國豬瘟抗體檢測的經(jīng)典方法，在國內(nèi)得到了廣泛應用，為我國豬瘟的綜合防控做出了巨大貢獻，但該方法敏感性低，待測血清樣品需經(jīng)滅活處理，增加了檢測時間和檢測難度，且血清的質(zhì)量嚴重影響檢測結果，誤差較大，不適合準確檢測豬瘟抗體水平，養(yǎng)殖場及廣大養(yǎng)殖戶可根據(jù)對檢測結果準確程度的實際需要選擇應用；豬瘟熒光抗體(CSF-FA)檢測豬瘟病毒是一種靈敏性高特異好的診斷方法,該方法是用冰凍組織切片或觸片的直接熒光抗體試驗作為豬瘟的法定診斷方法，目前在許多國家和地區(qū)均已實行，但在基層受儀器設備和人員技術的影響；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具有微量、敏感、特異、高通量的優(yōu)點，可用于豬瘟抗體水平監(jiān)測，但其需要酶標儀等儀器設備，且操作人員需有一定的專業(yè)技術水平，適合具有基本試驗條件的基層實驗室；分子生物學的普通RT-PCR方法敏感性有限，且不能對病毒進行定量；與普通RT-PCR方法相比，實時熒光定量RT-PCR具有敏感性更高、特異性更強、定量準確、全封閉反應、自動化檢測、不需核酸電泳檢測、高通量等優(yōu)點，成為目前豬瘟病毒檢測中最準確的方法，雖然該技術需要價格昂貴的儀器設備、試劑，但隨著國家對動物疫病實驗室建設資金投入的不斷增加，實時熒光定量RT-PCR技術將逐步成為豬瘟病毒檢測中最準確、適合現(xiàn)場應用的方法，不斷為我國豬瘟的綜合防控事業(yè)提供強有力的技術支持。多重RT-PCR能夠同時且快速地檢測出多種不同的病毒，敏感性好、特異性高，具有廣闊的應用前景，比較節(jié)省時間，但是建立一種多重PCR診斷方法不是件容易的事情，在多重PCR反應中，引物的設計至關重要，它決定著多重PCR反應的成功與否，此外，還需要對引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度等反應條件進行優(yōu)化，以確定最佳反應條件。環(huán)介導等溫核酸擴增(RT-LAMP)方法與傳統(tǒng)CSFV診斷方法和實時熒光定量RT-PCR方法相比，該方法不需要特殊設備要求，與普通RT-PCR相比，檢測時間大大縮短，靈敏度高了10倍，特別適用于基層及現(xiàn)場診斷使用。

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2017-05-04）

貴州省農(nóng)業(yè)攻關項目資助(黔科合NY字[2014]3055 號)；貴州省科學技術基金項目資助(黔科合J 字[2013]2110 號)。

石遠菊（1993-），女，貴州福泉人，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子病毒學的科研學習。

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導師，主要從事動物傳染病病原分子生物學和中西獸醫(yī)結合的教學科研工作。E-mail:tdyuan@163.com.