新型綠色防腐劑乳酸鏈球菌素

徐俊進(jìn)，金陳斌，陳小龍

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程研究所，浙江 杭州 310014； 2.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 天臺(tái) 317200)

新型綠色防腐劑乳酸鏈球菌素

徐俊進(jìn)1,2，金陳斌1,2，陳小龍1*

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程研究所，浙江 杭州 310014； 2.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 天臺(tái) 317200)

乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種安全有效的生物防腐劑。綜述其結(jié)構(gòu)、防腐機(jī)制、生產(chǎn)工藝、分離純化與檢測(cè)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并展望其未來(lái)發(fā)展，以期為相關(guān)研究提供參考。

Nisin； 發(fā)酵； 生物防腐劑； 防腐機(jī)制

乳酸鏈球菌素(Nisin)是某些乳鏈球菌(Streptococcuslactis)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)產(chǎn)生的抗菌短肽，能夠有效抑制大多數(shù)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌和部分革蘭陰性菌，特別是對(duì)產(chǎn)孢子的芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌、致死肉毒芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌等有很好的抑制作用。由于Nisin可由食品級(jí)微生物L(fēng).lactis發(fā)酵產(chǎn)生，因此，純化后的Nisin與發(fā)酵液都能被用于食物中，且與其他細(xì)菌素相比，Nisin具有很高的抑菌活性，而且添加后不會(huì)引起食品任何感官變化，一旦進(jìn)入人體，即可被人體內(nèi)的胰凝乳蛋白酶降解，不致在體內(nèi)殘留，也不會(huì)在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生致病的抗藥性菌株，更不會(huì)與其他抗生素出現(xiàn)交叉抗性。自問(wèn)世以來(lái)，Nisin被廣泛用于乳制品的防腐保鮮等領(lǐng)域。由于具有廣闊的市場(chǎng)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，Nisin自發(fā)現(xiàn)以來(lái)備受研究人員關(guān)注，是迄今被研究得最為徹底的一種細(xì)菌素[1]。

1 Nisin的結(jié)構(gòu)

Nisin有3種天然異構(gòu)體，Nisin A、Nisin Z和Nisin Q。其中，Nisin A和Nisin Z均由34個(gè)氨基酸組成，在結(jié)構(gòu)上只有1個(gè)氨基酸不同，即第27位氨基酸殘基，Nisin A為組氨酸殘基，而Nisin Z為天冬酰胺殘基。Nisin Q是新近發(fā)現(xiàn)的天然異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)與Nisin A和Nisin Z分別有3個(gè)和4個(gè)氨基酸的差異。

Nisin分子常以二聚體或四聚體的形式存在。Nisin分子中含有一些修飾性的氨基酸殘基，包括β-甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine)、羊毛硫氨酸(Lanthionine)、脫氫丙氨酸(Dehydroalanine，Dha)和甲基脫氫丙氨酸(Dehy drobutyrine，Dhb)。Nisin A高級(jí)結(jié)構(gòu)中含5個(gè)有別于其他蛋白質(zhì)的硫醚鍵，這些硫醚鍵構(gòu)成了5個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。Nisin A分子在肽鏈的C端和N端的頂端區(qū)還具有一定的可彎曲性[2]。

2 Nisin的防腐機(jī)制

2.1 Nisin的抑菌機(jī)制

Nisin的抑菌譜很廣，包括乳球菌、葡萄球菌、鏈球菌、微球菌、乳桿菌、片球菌屬、李斯特菌、分枝桿菌等革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，特別是對(duì)芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌的抑制效果特別明顯。而且，Nisin對(duì)這些細(xì)菌的孢子比對(duì)其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞更敏感[3]。一些研究認(rèn)為，Nisin可以使細(xì)菌細(xì)胞膜上形成孔洞，打破質(zhì)子動(dòng)力平衡和pH平衡，導(dǎo)致離子泄漏和ATP的水解，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。也有研究表明，Nisin會(huì)捆綁Lipid II，而Lipid II是肽聚糖的前體，從而抑制細(xì)胞壁的合成[4]。許多革蘭陰性細(xì)菌之所以能夠抵抗Nisin的抑制作用，可能就是因?yàn)槠浼?xì)胞壁外層的脂多糖(LPS)充當(dāng)了屏障的作用，從而有效地阻擋了Nisin對(duì)細(xì)胞膜的傷害。一旦加入EDTA，即可螯合、限制LPS中的Mg2+和Ca2+，達(dá)到對(duì)LPS的去穩(wěn)定作用，之后，Nisin就能夠突破屏障，作用于細(xì)胞膜上發(fā)揮作用[5]。Penna等[6]研究認(rèn)為，Nisin抑制大腸埃希菌孢子的作用機(jī)理是，Nisin與蛋白質(zhì)上的硫氫基結(jié)合，使孢子內(nèi)含硫氫基的酶失活，且在高溫滅菌的同時(shí)搭配使用Nisin，會(huì)大幅度提高滅活大腸埃希菌孢子的效率[7]。目前極少數(shù)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)Nisin的抗性，這是因?yàn)槠浜铣闪艘环N叫Nisinase的酶，從而導(dǎo)致Nisin失活[8]。

2.2 影響Nisin防腐性的因素

Nisin的抗菌活性和穩(wěn)定性受許多化學(xué)和物理因素的影響，如pH、鹽濃度和溫度等。其中，pH是一個(gè)非常重要的影響因素。Nisin的抗菌活性隨pH升高而下降，溶解度也隨之下降。pH>7時(shí)，Nisin幾乎不溶于水。另外，Nisin的穩(wěn)定性與溶液的pH有關(guān)。當(dāng)溶液的pH值<3時(shí)，高溫加熱條件下，Nisin的抗菌活性基本上不發(fā)生改變；而當(dāng)溶液的pH值>4時(shí)，加熱條件下，Nisin的抗菌活性會(huì)迅速消失。另有研究顯示，當(dāng)Nisin與其他適合的條件聯(lián)合作用時(shí)，其抗菌活性能大幅度提高，如適當(dāng)?shù)睦鋬?、鹽處理、熱處理和酸味劑等[9]。

Nisin分子含有疏水殘基，因此具有脂水兩親的性質(zhì)，所以Nisin最好不要用于肉類食品防腐保鮮。因?yàn)槿庵杏椭芏啵瑫?huì)溶解Nisin并與之發(fā)生作用，從而降低Nisin的抑菌能力。有焦亞硫酸鈉或二氧化鈦存在時(shí)，Nisin也會(huì)因分解而失活[1]。

3 Nisin的生產(chǎn)方法

3.1 發(fā)酵法

通過(guò)流動(dòng)的牛奶或乳清培養(yǎng)L.lactis，再進(jìn)行固液分離，將液體噴霧干燥，收集干燥后的粉末就可作為商品出售。但該方法制得的Nisin純度低[10](產(chǎn)物包括2.5%的Nisin、72.0%的NaCl、23.8%的牛乳固形物、1.7%的水分)，且Nisin活性濃度僅為1×106IU·g-1(1 g純的Nisin活性單位為40×106IU)。因此，現(xiàn)在很多研究利用膜分離技術(shù)與分批發(fā)酵相結(jié)合，以提高產(chǎn)品中Nisin的濃度，降低成本。

L.lactis在發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乳酸，而乳酸的積累會(huì)引起發(fā)酵液pH下降，進(jìn)而抑制L.lactis的正常生長(zhǎng)。通常采用在發(fā)酵培養(yǎng)基中加堿中和或用有機(jī)溶劑提取乳酸的辦法來(lái)調(diào)節(jié)pH，但是加入堿之后生成的乳酸鹽對(duì)L.lactis的生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生抑制作用。基于以上考慮，華盛頓州立大學(xué)的Liu等[11]提出，將產(chǎn)Nisin的L.lactis與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)Nisin。其原理是，L.lactis在發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的過(guò)程中所產(chǎn)生的乳酸可以被S.cerevisiae利用，而S.cerevisiae在代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的一些物質(zhì)又可以被L.lactis作為底物進(jìn)行利用，2種菌種的相互作用，構(gòu)成了一個(gè)有利于Nisin生產(chǎn)的微生態(tài)環(huán)境。該研究團(tuán)隊(duì)以乳清作為基礎(chǔ)培養(yǎng)，將相同培養(yǎng)條件下的混菌發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，對(duì)比常規(guī)發(fā)酵81.2 mg·L-1的Nisin終濃度，混菌發(fā)酵條件下達(dá)到了150.3 mg·L-1，增加了85%。另外，利用基因工程技術(shù)提高菌種自身的Nisin耐受能力與生產(chǎn)能力也是一種降低成本的重要方法。

3.2 化學(xué)法

先合成脫氫丙氨酸與羊毛硫氨酸這2種特殊氨基酸，然后合成硫醚環(huán)，再將5個(gè)硫醚環(huán)片段以縮合反應(yīng)連接，即可形成完整的Nisin分子，經(jīng)測(cè)試，其抑菌效果與天然的Nisin相同。

4 Nisin的分離純化與檢測(cè)

目前，Nisin的分離純化主要采用離子交換膨脹床、親和層析和高效液相層析等方法。但這些方法成本都比較高，而且會(huì)引入很多不適于食品添加的化合物。因此，一般還是采用先乙醇抽提，再用硫酸銨沉淀或pH值2.0酸沉淀的方法來(lái)分離純化Nisin[12]。

目前，針對(duì)細(xì)菌素活性的檢測(cè)方法有很多，其中最簡(jiǎn)單、最常用的方法是瓊脂平板擴(kuò)散法、牛津杯法和劃線法等。下面著重介紹瓊脂平板擴(kuò)散法：將滅好菌的效價(jià)培養(yǎng)基冷卻至約45 ℃，加入0.5%的Tween-20和2%指示菌菌懸液，搖勻，準(zhǔn)確吸取20 mL該培養(yǎng)基加入水平放置的培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后用直徑8 mm的中空打孔器在平板上打出孔洞，加入含Nisin發(fā)酵液(充滿孔洞)或經(jīng)稀釋的樣液，蓋上皿蓋，靜置0.5 h，移至30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑[13]。

5 研究展望

我國(guó)L.lactis菌種資源豐富，但目前在Nisin的研究領(lǐng)域還處于初級(jí)階段，生產(chǎn)規(guī)模小，發(fā)酵水平低，成本高，應(yīng)用不廣泛。今后，應(yīng)大力進(jìn)行Nisin的基礎(chǔ)研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用，利用生物技術(shù)(如基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程等)研發(fā)優(yōu)良工程菌株。通過(guò)對(duì)Nisin的性質(zhì)及作用機(jī)理的進(jìn)一步研究，拓展并加速其作為天然生物防腐劑在食品等行業(yè)中的應(yīng)用。

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(責(zé)任編輯：高 峻)

2017-03-20

徐俊進(jìn)(1963—)，男，浙江天臺(tái)人，學(xué)士，工程師，主要從事生物防腐劑的生產(chǎn)與研究工作，E-mail：973738378@qq.com。

陳小龍(1970—)，男，浙江仙居人，博士，教授，主要從事生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)與研究工作，E-mail：richard_chen@zjut.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170630

TS202.3

B

0528-9017(2017)06-1005-03

文獻(xiàn)著錄格式：徐俊進(jìn)，金陳斌，陳小龍. 新型綠色防腐劑乳酸鏈球菌素[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(6)：1005-1007.