• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基因芯片技術(shù)及其在畜牧獸醫(yī)業(yè)中的應(yīng)用概述

    2017-01-16 06:59:11李博巖王旭平柳誠剛楊汝才
    中國畜牧獸醫(yī)文摘 2017年9期
    關(guān)鍵詞:基因芯片探針雜交

    陸 曼 李博巖王旭平 柳誠剛 譚 斌 楊汝才

    基因芯片技術(shù)及其在畜牧獸醫(yī)業(yè)中的應(yīng)用概述

    陸 曼 李博巖*王旭平 柳誠剛 譚 斌 楊汝才

    1 基因芯片技術(shù)的發(fā)展歷史

    基因芯片(gene chip)亦稱 DNA 芯片, 主要是指通過平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng), 用以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物組分的快速、準(zhǔn)確、大信息量檢測。隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的實(shí)施,基因芯片應(yīng)運(yùn)而生,該技術(shù)是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義的科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新。

    基因芯片的原型是在 20 世紀(jì) 80 年代中期出現(xiàn)的,它依據(jù)計(jì)算機(jī)半導(dǎo)體芯片制作技術(shù)中晶體管集成在芯片上這一原理, 將寡核苷酸分子集成在芯片上而制成。Bains 等運(yùn)用雜交的方法將短的 DNA 片段固定在支持物上, 并借助雜交原理對其序列進(jìn)行了測定?;蛐酒嬲龔膶?shí)驗(yàn)室走向工業(yè)化得益于照相平版印刷技術(shù)與探針固相原位合成技術(shù)的結(jié)合以及激光共聚焦顯微技術(shù)。這些技術(shù)的引入使數(shù)以萬計(jì)的高密度探針分子的合成與固定成為可能, 而激光共聚焦顯微掃描技術(shù)也有可能讓雜交信號的準(zhǔn)確、實(shí)時、靈敏的檢測和分析成為現(xiàn)實(shí)。1990 年, 美國 Affmetrix 公司的 Fodor 等通過實(shí)驗(yàn)把一種光敏材料涂布在硅芯片表面,通過光蝕刻技術(shù)原位合成了多肽鏈。在此基礎(chǔ)上,F(xiàn)odor 等進(jìn)行了技術(shù)改進(jìn),最終率先合成了 DNA 陣列。1997 年,斯坦福大學(xué) Brown 實(shí)驗(yàn)室研制出了世界上第一張全基因組芯片。此芯片是酵母全基因組芯片, 具有 6166 個基因, 它的研制成功開創(chuàng)了基因芯片技術(shù)應(yīng)用的先河。

    1970 年以后,隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等新興學(xué)科的迅猛發(fā)展及人們消費(fèi)觀念的改變,動物育種目標(biāo)由單一的常規(guī)育種向分子與常規(guī)聯(lián)合育種轉(zhuǎn)變,肉用性能相關(guān)基因的篩選成為研究熱點(diǎn)。基因芯片及熒光定量 PCR 技術(shù)的出現(xiàn)為肉牛肉質(zhì)性狀的系統(tǒng)研究提供了強(qiáng)有力的手段。

    2 基因芯片簡介

    2.1 基因芯片的原理

    基因芯片是建立在雜交測序技術(shù)和基因探針上的一種高效快速的核酸序列分析工具。雜交測序是基因芯片的測序原理。此方法是將大量的基因探針高密度地、有序地排列在一塊 1~2 cm2大小的載體上, 隨后用標(biāo)記的待測樣品與之雜交, 通過分析檢測雜交信號的分布及強(qiáng)度便可以獲得樣品中待測 DNA 的各種數(shù)據(jù)。

    2.2 基因芯片的類型

    基因芯片可以分為三種類型:①用聚合物基片(硝酸纖維膜或尼龍膜等)制成的芯片。這種芯片的核酸探針或 cDNA 片段被固定在聚合物基片表面上,檢測時同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交,之后采用放射顯影技術(shù)進(jìn)行分析檢測。此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以方便地使用目前分子生物學(xué)常用的放射顯影技術(shù)及其所需檢測設(shè)備,檢測技術(shù)比較成熟;缺點(diǎn)是芯片上的探針密度不高,要使用大量的試劑和樣品, 不完全適合于定量檢測。②用玻璃板作為探針的載體制成的芯片。這種芯片的 DNA 探針陣列是用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的,檢測時將熒光標(biāo)記的靶基因與玻璃板上探針進(jìn)行雜交,然后檢測雜交分子的熒光數(shù)據(jù), 便可獲得靶基因的相關(guān)資料。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是大大提高了探針的密度,有利于獲得比較高的檢測精度;缺點(diǎn)是批量化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)方面仍有較多困難。③用玻璃或其他硬質(zhì)材料薄片作為探針的載體制成的芯片。這種基因芯片的寡核苷酸探針陣列可在載體表面上直接合成,檢測時將熒光標(biāo)記的靶基因與寡核苷酸探針雜交,并進(jìn)行后續(xù)的熒光檢測,便能獲得靶基因的各種數(shù)據(jù)。此方法是把 DNA 化學(xué)合成技術(shù)與微電子光刻技術(shù)相結(jié)合,優(yōu)點(diǎn)是大大提高了基因芯片探針的密度, 可以進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn),有很大的發(fā)展空間。

    2.3 基因芯片的優(yōu)點(diǎn)

    基因芯片有以下優(yōu)點(diǎn): ①使在同一條件和時間下需要多次處理的遺傳分析能快速完成,有很強(qiáng)的類比性;②細(xì)胞、組織、血液等的基因表達(dá)信號的定量、定性分析可以在同一張芯片上獲得,并還可以實(shí)現(xiàn)時間與空間上、全局檢測靜態(tài)到動態(tài)的差異及遺傳信息的檢測,有很大的信息產(chǎn)出率;③有較強(qiáng)專一性和高度的敏感性, 可以精準(zhǔn)和可靠測定 10pg /μL 的 DNA 樣品;④尼龍膜制作的微陣列, 可重復(fù)進(jìn)行多達(dá) 20 次雜交實(shí)驗(yàn), 有很好的重復(fù)使用性;⑤已有的芯片面積最小的僅有 1 cm2, 最大的也不超過525cm2,所以每個陣列中 DNA 樣品的用量較少, 反應(yīng)體積和試劑用量也相應(yīng)地大大減小, 但反應(yīng)效率卻提高了百倍,有利于實(shí)現(xiàn)測量的自動化和微型化;⑥基因芯片技術(shù)容易與其他技術(shù)相互交叉使用。

    2.4 基因芯片技術(shù)的操作流程

    生物芯片技術(shù)操作流程主要包括四個步驟: ①芯片方陣的構(gòu)建: 將玻璃片或硅片作表面處理,并將蛋白質(zhì)分子或 DNA 片段按順序排列在芯片上;②樣品的制備: 獲取生物樣品中的DNA、蛋白質(zhì)或 RNA 并對其做標(biāo)記, 可以大大提高檢測的靈敏度(一般情況下,待測材料不能直接與芯片反應(yīng),只有少數(shù)的特殊樣品除外);③生物分子反應(yīng): 芯片檢測的關(guān)鍵是芯片上的生物分子之間的反應(yīng), 應(yīng)當(dāng)選擇最合適的反應(yīng)條件, 使生物分子間反應(yīng)條件處于最佳狀況,從而使生物分子之間的錯配比率大大降低;④芯片信號的檢測: 將芯片置入芯片掃描儀中是常用的芯片信號檢測方法,掃描后便可獲得有關(guān)生物信息。

    3 基因芯片在畜牧獸醫(yī)業(yè)中的應(yīng)用

    3.1 牲畜基因表達(dá)水平的檢測

    對于基因的保守片段設(shè)計(jì)了多對完全與之匹配的寡核苷酸探針(PM)以及相應(yīng)的中心單堿基錯配的寡核苷酸探針(MM),將它們固定在芯片的相鄰位置上, 便可用來對標(biāo)記的樣品靶序列進(jìn)行雜交探測。陽性情況下(正常完全匹配),PM 的雜交信號明顯強(qiáng)于 MM 的雜交信號;而假陽性時(錯配),兩者的雜交信號差異不明顯。所以, PM/ MM(PM 與 MM 的信號比值)可作為衡量陽性的指標(biāo),當(dāng)某一基因三條以上探針呈陽性時, 可定性判斷閑逛基因的表達(dá)。而通過比對異常和正常樣品雜交信號,則可檢測不同樣品中基因表達(dá)水平的變動趨勢。

    這方面的研究已有不少報(bào)道。朱正茂等以杜洛克豬胎兒骨骼肌 5 個不同發(fā)育時期的背最長肌作樣本研究其基因表達(dá)譜,并對結(jié)果進(jìn)行聚類分析, 獲得了骨骼肌發(fā)育的變動信息。Lin 等運(yùn)用由 9182 個 cDNA探針構(gòu)成的基因表達(dá)譜芯片對杜洛克和桃園豬骨骼肌表達(dá)譜進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)杜洛克豬中與轉(zhuǎn)率調(diào)控蛋白、肌原纖維蛋白、能量代謝酶相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào), 解釋了杜洛克在出生后比桃園豬具有更高的肌肉增長率的作用機(jī)制。Ushizawa 等根據(jù)牛肝臟 cDNA 序列制備了代表 2059 個?;虻男酒?, 并檢測了妊娠?;蜣D(zhuǎn)錄差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在懷孕第 27 ~ 28 d 時大多肝臟基因被誘導(dǎo)表達(dá)。Yao 等用卵母細(xì)胞 cDNA 文庫建立了基因芯片,為卵泡發(fā)育和早期胚胎發(fā)育機(jī)理的研究提供了有力的工具。張國梁等利用基因芯片技術(shù)構(gòu)建了中國草原紅牛公牛與閹牛差異基因表達(dá)譜。

    3.2 獸藥篩選和新獸藥的開發(fā)

    基因芯片技術(shù)可以用來鑒定和分離藥物的有效成分, 解決了目前獸藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)遇到的重要困難。很多獸藥是直接或者間接地通過改變、修飾動物基因的表達(dá)或基因表達(dá)產(chǎn)物的功能而生效。所以, 可通過基因芯片技術(shù)分析動物機(jī)體用藥前后的不同器官、組織基因表達(dá)的差異, 從眾多藥物成分中篩選出真正起作用的組分物質(zhì)?;蛐酒夹g(shù)在藥物篩選方面有著巨大的優(yōu)勢, 因?yàn)樵摷夹g(shù)具有大規(guī)模、高通量、平行性地分析基因表達(dá)的能力。利用基因芯片技術(shù)作大規(guī)模的篩選研究可以縮短藥物篩選所用時間,節(jié)約大量的動物實(shí)驗(yàn), 降低風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用, 大大提高效率。

    3.3 畜禽疾病的診斷

    伴隨著畜牧業(yè)的發(fā)展, 動物傳染病的流行變得更加復(fù)雜,畜禽疾病的診斷和防治也隨之更加困難。傳統(tǒng)的診斷方法雖然可靠, 但是每次只能檢測一種病原;而生物芯片能一次檢測多種病原,而且具有需要樣品量少、特異、靈敏、快速和費(fèi)用低廉的優(yōu)勢。

    基因芯片在該領(lǐng)域的應(yīng)用研究的報(bào)道很多。美國科羅拉多大學(xué)與疾病控制和預(yù)防中心研發(fā)的“M 基因芯片”,采用流感病毒基因模版, 可快速檢測各種流感病毒,其中包括 H5N1 型高致病性禽流感病毒, 可輕易將 H5N1 型禽流感病毒與普通感冒病毒相區(qū)分。陳鳳梅等應(yīng)用 RT - PCR 或 PCR 方法分別獲得雞禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎等 14 種家禽疾病的病原核酸特異性片段,并以這些片段為探針, 采用接觸式電樣技術(shù)制成低密度的 DNA 陣列芯片,同時成功檢測了這 14 種禽類傳染病, 驗(yàn)證了該新穎 DNA 陣列芯片的良好檢測效果。

    3.4 園林觀賞動物的DNA測序

    HGP 計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了高效的自動化測序方法的發(fā)展, 基因芯片利用固定探針與樣品之間分子雜交產(chǎn)生的雜交譜而排列出待測樣品的序列,此測序法比傳統(tǒng)的 Sanger 雙脫氧鏈終止法快速且前景誘人。

    例如,美國 Affymetrix 公司于 1998 年生產(chǎn)的帶有13.5 萬個基因探針的芯片,使人類 DNA 的解碼速度比原來提高了 25 倍。Mark chee 等用帶有 13.5 萬個寡核苷酸探針陣列測定了全長為16.6 kb 的人線粒體基因組,其準(zhǔn)確率高達(dá) 99% 。Hacia 等也曾用含 4.8萬個寡核苷酸的高密度微陣列分析了人與黑猩猩BRCA1 基因序列的不同,發(fā)現(xiàn)在該基因外顯子中的部分核酸序列同源性為83.5% ~ 98.2% 之高 ,揭示了兩者在進(jìn)化上的高度一致性。

    3.5 尋找牲畜新基因

    研究表明, 在序列信息缺乏的條件下,可采用基因芯片技術(shù)尋找新基因。Chitko -McKown 等研究了牛巨噬細(xì)胞基因用脂蛋白(LPS)處理過后表達(dá)的變化情況。他們將人的基因芯片與反轉(zhuǎn)錄的牛巨噬細(xì)胞基因的 cDNA 進(jìn)行雜交, 發(fā)現(xiàn)有 44個基因的表達(dá)存在差異,其中有 18 個基因是牛的巨噬細(xì)胞新基因。Dvorak 等在研究豬腸黏膜的派伊爾氏淋巴集結(jié)功能的分子機(jī)制時采用了基因芯片技術(shù)。研究表明在 3687 個表達(dá)序列標(biāo)簽 (ESTs)中出 現(xiàn)了2414 個特異核苷酸序列, 其中至少有 371 個基因是新基因。Schena 等將熱休克作用和佛波酯處理的 T細(xì)胞的 cDNA 與包含1056 個 cDNA 的芯片雜交, 得到了 4 個新基因。

    3.6 畜禽高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗性等基因的篩選及優(yōu)良雜種后代選育

    畜禽的基因型決定不同性狀的表型, 是由單一或眾多基因相互協(xié)同作用的結(jié)果。畜禽高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等性狀可能是質(zhì)量性狀也可能是數(shù)量性狀。通過分子生物學(xué)方法, 已經(jīng)找到了很多由單一基因控制的性狀,但其對于鑒定由多基因控制的多態(tài)性變化與畜禽表型的關(guān)系, 以及發(fā)現(xiàn)更多的有用基因則顯得無能為力。通過采用基因芯片技術(shù)使快速發(fā)現(xiàn)具有重要應(yīng)用價值的新基因以及研究基因表達(dá)的多態(tài)性成為可能,為傳統(tǒng)分子生物學(xué)研究提供了新的工具和思路。通過制作全基因組芯片, 可以在多樣本大群體中快速識別與相關(guān)性狀和功能有關(guān)的特殊功能基因, 從而為物種改良、新品種選育、加快育種進(jìn)程提供理論基礎(chǔ)。在育種過程中選擇優(yōu)良雜種后代, 最困難的一步是從大量的雜交組合群體中篩選具有目的基因的優(yōu)良雜合體或者純合體, 從而選育出具有優(yōu)良性狀或者符合育種目的的目標(biāo)個體。利用基因芯片技術(shù), 可簡化傳統(tǒng)的育種程序,通過制作帶有篩選目的基因的芯片,采集分離出來的畜禽基因, 不再需要通過繁雜的辛勤的育種工作和長時間的選擇, 就可以實(shí)現(xiàn)從雜種后代中篩選出優(yōu)良個體,并育成新品種的過程。因此, 通過基因芯片技術(shù),可以改變傳統(tǒng)育種工作模式, 使畜禽遺傳育種工作變得簡單、高效、快速、精確。李艷華等采用基因芯片技術(shù)以及其他相關(guān)技術(shù),篩選出了與豬群的鮮肉產(chǎn)品的感觀質(zhì)量及其加工性狀、胴體組成、脂肪的質(zhì)量性狀(包括脂肪含量、嫩度、肉色、肌纖維直徑、大理石紋等)等肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳效應(yīng)和主基因關(guān)聯(lián)十分明顯的遺傳標(biāo)記。

    4 展望

    基因芯片技術(shù)多學(xué)科及相關(guān)技術(shù)融合的結(jié)果, 已經(jīng)廣泛用于基因表達(dá)研究、基因診斷、發(fā)現(xiàn)新基因、基因組研究及各種病原體的診斷等領(lǐng)域。當(dāng)前, 應(yīng)用該技術(shù)成本還比較高, 因此推廣應(yīng)用受到一定的局限。

    但隨著計(jì)算機(jī)處理軟件的進(jìn)一步開發(fā)利用, 基因芯片技術(shù)的不斷發(fā)展,基因芯片的成本會越來越低, 基因芯片一定會得到越來越多的應(yīng)用。相信在不久的將來,基因芯片技術(shù)一定會成為畜牧業(yè)研究的常規(guī)手段, 為畜牧業(yè)發(fā)展助力。

    摘自《生物學(xué)教學(xué)》2017年第9期

    猜你喜歡
    基因芯片探針雜交
    出生時即可預(yù)判發(fā)育潛力 基因芯片精準(zhǔn)篩選肉牛良種
    雙管單色熒光PCR法與基因芯片法檢測CYP2C19基因多態(tài)性的比較研究
    多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
    高等植物雜交染色體及其雜交基因表達(dá)的性狀——三論高等植物染色體雜交
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    6年生雜交桉無性系對比試驗(yàn)
    應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測四種結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)的研究
    再論高等植物染色體雜交
    透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
    基于提升小波的基因芯片數(shù)據(jù)的分類預(yù)測
    精品国产超薄肉色丝袜足j| 免费人成视频x8x8入口观看| 热99在线观看视频| 国产99白浆流出| 无限看片的www在线观看| 怎么达到女性高潮| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 91久久精品电影网| 少妇高潮的动态图| 伊人久久精品亚洲午夜| xxx96com| 老司机福利观看| 色视频www国产| 99热6这里只有精品| 亚洲最大成人手机在线| 两个人视频免费观看高清| 久久香蕉国产精品| 午夜a级毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美日韩黄片免| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲无线观看免费| 看黄色毛片网站| 国产精品一区二区免费欧美| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产单亲对白刺激| 成年免费大片在线观看| 一级黄片播放器| 成人av在线播放网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 禁无遮挡网站| 久久久久九九精品影院| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美另类亚洲清纯唯美| 99久久综合精品五月天人人| 特大巨黑吊av在线直播| 久久草成人影院| 少妇人妻精品综合一区二区 | 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产成人a区在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 美女高潮的动态| 亚洲人成伊人成综合网2020| x7x7x7水蜜桃| 精品无人区乱码1区二区| 三级毛片av免费| xxxwww97欧美| 欧美一级毛片孕妇| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲久久久久久中文字幕| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 九色国产91popny在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美黄色淫秽网站| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲久久久久久中文字幕| 在线播放国产精品三级| 国产在视频线在精品| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产成人av教育| 午夜激情欧美在线| 久久草成人影院| 亚洲精品456在线播放app | 国产成人系列免费观看| 日韩人妻高清精品专区| 97碰自拍视频| 日本与韩国留学比较| 欧美bdsm另类| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美黄色片欧美黄色片| 男女床上黄色一级片免费看| 久久香蕉国产精品| 成人午夜高清在线视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 69av精品久久久久久| 男女视频在线观看网站免费| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲精品影视一区二区三区av| 俺也久久电影网| 亚洲五月天丁香| 青草久久国产| 操出白浆在线播放| 很黄的视频免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日本三级黄在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 久久人人精品亚洲av| 无遮挡黄片免费观看| 日本五十路高清| 亚洲真实伦在线观看| 国产成人系列免费观看| 国产高清激情床上av| 日韩欧美三级三区| 黄片小视频在线播放| 99热只有精品国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品三级大全| 99精品欧美一区二区三区四区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲熟妇熟女久久| 最近视频中文字幕2019在线8| 男女之事视频高清在线观看| 午夜福利在线观看吧| 精品欧美国产一区二区三| 免费在线观看亚洲国产| 久久久国产成人精品二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 两个人看的免费小视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲精品在线美女| 国产乱人视频| 国产精品av视频在线免费观看| 波多野结衣高清作品| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 天天添夜夜摸| 欧美在线一区亚洲| 日韩欧美精品免费久久 | 国产淫片久久久久久久久 | 精品国产亚洲在线| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区三区视频了| 国产乱人视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 岛国在线观看网站| 天天一区二区日本电影三级| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 麻豆国产av国片精品| 波多野结衣高清作品| 日韩欧美三级三区| 日本免费a在线| 一本久久中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 在线播放国产精品三级| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲精品在线美女| 国产成人系列免费观看| 久久中文看片网| 亚洲av一区综合| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产欧美日韩精品一区二区| 岛国在线观看网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久久久久久久黄片| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 他把我摸到了高潮在线观看| 露出奶头的视频| 日本 欧美在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲人成网站高清观看| 日本熟妇午夜| 国产高清视频在线播放一区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜两性在线视频| 一个人看的www免费观看视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 免费在线观看日本一区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 老鸭窝网址在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 免费看美女性在线毛片视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 午夜福利免费观看在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 我的老师免费观看完整版| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产激情欧美一区二区| 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜久久久久精精品| 天堂影院成人在线观看| 内地一区二区视频在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 最新在线观看一区二区三区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲一区高清亚洲精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲人成电影免费在线| 俺也久久电影网| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精华一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜福利欧美成人| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久久久久久久大av| 亚洲国产精品999在线| 99精品欧美一区二区三区四区| 一二三四社区在线视频社区8| 久久精品影院6| 国产一区二区在线观看日韩 | 久久精品91蜜桃| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 最好的美女福利视频网| 黄色女人牲交| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 最近最新中文字幕大全免费视频| 露出奶头的视频| 天天添夜夜摸| 偷拍熟女少妇极品色| 我要搜黄色片| 欧美在线一区亚洲| 黄片大片在线免费观看| 日韩欧美在线二视频| 99热这里只有是精品50| netflix在线观看网站| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| www日本在线高清视频| 99久久九九国产精品国产免费| 国产一区二区三区视频了| 一区二区三区高清视频在线| 97碰自拍视频| 欧美bdsm另类| 国产真人三级小视频在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 波多野结衣高清无吗| 国产真人三级小视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 久久精品国产清高在天天线| 88av欧美| 美女黄网站色视频| 日韩欧美三级三区| 88av欧美| 乱人视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩欧美免费精品| 日本 欧美在线| 男插女下体视频免费在线播放| 成人性生交大片免费视频hd| 久久久久性生活片| 欧美中文日本在线观看视频| www国产在线视频色| 色综合欧美亚洲国产小说| 一本精品99久久精品77| 久久人妻av系列| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品456在线播放app | 白带黄色成豆腐渣| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲 国产 在线| av中文乱码字幕在线| 偷拍熟女少妇极品色| 国产成人影院久久av| 国产视频内射| 国产单亲对白刺激| 亚洲在线观看片| 看黄色毛片网站| 亚洲成av人片在线播放无| 国产伦一二天堂av在线观看| av天堂中文字幕网| 九九在线视频观看精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 午夜a级毛片| 搡老岳熟女国产| 婷婷六月久久综合丁香| 日本与韩国留学比较| 99久久精品热视频| 有码 亚洲区| 午夜亚洲福利在线播放| 一进一出好大好爽视频| 美女大奶头视频| 国产成年人精品一区二区| 久久精品人妻少妇| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品99久久99久久久不卡| 91久久精品电影网| 国产三级在线视频| 黄片小视频在线播放| 精品久久久久久久毛片微露脸| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲国产色片| 国产精品 国内视频| 变态另类丝袜制服| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲在线观看片| 日韩国内少妇激情av| 大型黄色视频在线免费观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲午夜理论影院| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日韩欧美精品免费久久 | 88av欧美| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 九九在线视频观看精品| 国产av不卡久久| 久久九九热精品免费| 亚洲在线观看片| 一级毛片女人18水好多| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲美女视频黄频| 欧美一区二区亚洲| 午夜精品久久久久久毛片777| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 一个人看的www免费观看视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲最大成人中文| 麻豆久久精品国产亚洲av| 在线观看一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成人午夜高清在线视频| 亚洲人与动物交配视频| 国产午夜精品论理片| 国产一区在线观看成人免费| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲av不卡在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 老汉色∧v一级毛片| or卡值多少钱| 好男人在线观看高清免费视频| 黄色丝袜av网址大全| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| а√天堂www在线а√下载| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩欧美在线二视频| 国产亚洲精品一区二区www| 国产成人系列免费观看| 亚洲无线在线观看| 欧美乱妇无乱码| 国产高清三级在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 色在线成人网| 天堂√8在线中文| 久久6这里有精品| 级片在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 午夜福利免费观看在线| 18美女黄网站色大片免费观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲av成人av| a在线观看视频网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 在线观看66精品国产| 国产高清激情床上av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| av黄色大香蕉| 日本成人三级电影网站| 最新中文字幕久久久久| 制服丝袜大香蕉在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲自拍偷在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲人成网站在线播| 日韩国内少妇激情av| 欧美黑人欧美精品刺激| 日本 欧美在线| 免费av观看视频| 久久久久久人人人人人| 99热只有精品国产| 国产亚洲欧美98| 99久久99久久久精品蜜桃| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美zozozo另类| 99久久综合精品五月天人人| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 午夜福利高清视频| 久久精品影院6| 黄片大片在线免费观看| 亚洲在线观看片| h日本视频在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲av电影在线进入| x7x7x7水蜜桃| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久99热这里只有精品18| 中国美女看黄片| 脱女人内裤的视频| 一级黄色大片毛片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 男人舔奶头视频| 久久久久久大精品| 国产97色在线日韩免费| 麻豆一二三区av精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产一区在线观看成人免费| 制服丝袜大香蕉在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| avwww免费| 国产高清有码在线观看视频| 一级作爱视频免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 黄色日韩在线| 美女免费视频网站| 国产黄色小视频在线观看| 成人av在线播放网站| 久久人妻av系列| 日本黄色视频三级网站网址| 少妇丰满av| 亚洲黑人精品在线| 在线播放国产精品三级| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品欧美国产一区二区三| 精品一区二区三区av网在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 国产三级黄色录像| 精品一区二区三区视频在线 | 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 91久久精品电影网| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲色图av天堂| 成人三级黄色视频| 一本一本综合久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 波野结衣二区三区在线 | 一级毛片高清免费大全| 欧美在线黄色| 亚洲黑人精品在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲欧美日韩东京热| 嫩草影视91久久| 日韩欧美免费精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本黄色片子视频| 国产色婷婷99| 在线国产一区二区在线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 色综合站精品国产| 精品一区二区三区视频在线 | 免费看a级黄色片| 成人特级av手机在线观看| 久99久视频精品免费| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 88av欧美| 男人的好看免费观看在线视频| 性欧美人与动物交配| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 婷婷六月久久综合丁香| 啪啪无遮挡十八禁网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩精品青青久久久久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日韩欧美免费精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 手机成人av网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 伊人久久精品亚洲午夜| av欧美777| 欧美日韩乱码在线| a级一级毛片免费在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 国产日本99.免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲国产欧美人成| 欧美一级毛片孕妇| av天堂在线播放| 老鸭窝网址在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品一及| 一级作爱视频免费观看| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲精品456在线播放app | 91av网一区二区| 国产精品久久视频播放| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲av电影在线进入| 国产亚洲欧美98| 中文字幕av在线有码专区| 久久精品影院6| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲国产精品合色在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品 欧美亚洲| 日本与韩国留学比较| 久久亚洲真实| 内射极品少妇av片p| 精品乱码久久久久久99久播| av片东京热男人的天堂| 老熟妇仑乱视频hdxx| a级毛片a级免费在线| 老司机福利观看| 免费看a级黄色片| 一本久久中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久国产精品麻豆| 一级毛片女人18水好多| 国产真实伦视频高清在线观看 | 欧美黄色片欧美黄色片| 国产成人aa在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 搡老岳熟女国产| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美黑人巨大hd| 久久人妻av系列| 91字幕亚洲| 熟女人妻精品中文字幕| 一个人看视频在线观看www免费 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 99国产精品一区二区蜜桃av| 真实男女啪啪啪动态图| 久久久久亚洲av毛片大全| 在线免费观看不下载黄p国产 | 91久久精品电影网| 久久久色成人| 99国产精品一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产色婷婷99| 免费看a级黄色片| 久久久久国内视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产高清视频在线观看网站| 51国产日韩欧美| 免费人成在线观看视频色| 欧美黑人欧美精品刺激| 中文在线观看免费www的网站| 国产三级在线视频| 禁无遮挡网站| 天堂网av新在线| 91av网一区二区| 性色av乱码一区二区三区2| 精品一区二区三区av网在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产高清激情床上av| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 黄色成人免费大全| 免费搜索国产男女视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久国产乱子伦精品免费另类| 高清毛片免费观看视频网站| 人人妻人人看人人澡| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 黄片大片在线免费观看| 特级一级黄色大片| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av二区三区四区| 亚洲av成人av| 国产探花在线观看一区二区| 午夜a级毛片| 日本黄色片子视频| 波多野结衣高清无吗| 性色avwww在线观看| 看片在线看免费视频| 九九热线精品视视频播放| 高清在线国产一区| 亚洲,欧美精品.| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 又粗又爽又猛毛片免费看| www.www免费av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99热这里只有是精品50| 久久人人精品亚洲av| 一本久久中文字幕| 动漫黄色视频在线观看| 国产精品女同一区二区软件 | 国模一区二区三区四区视频| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩欧美精品v在线| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 麻豆成人av在线观看| 久久性视频一级片| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲人成电影免费在线| 少妇高潮的动态图| 综合色av麻豆| 天堂影院成人在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产单亲对白刺激| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产乱人伦免费视频| 精品免费久久久久久久清纯| 成年版毛片免费区| 免费大片18禁| netflix在线观看网站|