提高免疫組化染色質(zhì)量的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

阮順愛 蔡愛英 林秀香

（福建莆田市第一醫(yī)院病理科，福建 莆田 351100）

提高免疫組化染色質(zhì)量的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

阮順愛 蔡愛英 林秀香

（福建莆田市第一醫(yī)院病理科，福建 莆田 351100）

目的分析影響免疫組化染色質(zhì)量的因素，總結(jié)提高染色質(zhì)量。方法在免疫組化染色過程中，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)范；標(biāo)本及時(shí)充分的固定、組織的正確處理、合適的抗原修復(fù)和合理運(yùn)用緩沖液和稀釋液，保證染色試劑的有效濃度和有效期，合適的烤片溫度和時(shí)間，正確的制片方法等。結(jié)果保存了組織抗原的免疫活性，極少出現(xiàn)非物異性背景染色和假陽性反應(yīng)。結(jié)論認(rèn)真對待免疫組化染色過程中的各個環(huán)節(jié)，避免不良現(xiàn)象發(fā)生，可獲得滿意的染色結(jié)果。

免疫組化；染色質(zhì)量；總結(jié)

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，疾病種類的不斷變化，病理醫(yī)師和臨床醫(yī)師對免疫組化的依賴性日益增加，免疫組化技術(shù)已列入日常操作，并廣泛運(yùn)用于臨床，在病理診斷中起重要作用。但免疫組化在實(shí)際操作中受很多因素影響，任何一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯，都可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，而導(dǎo)致診斷失誤。作者通過實(shí)踐總結(jié)出一些經(jīng)驗(yàn)，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料：材料均來源于我科日常工作的常規(guī)標(biāo)本，按規(guī)范[1]操作及染色。

1.2 方法

1.2.1 嚴(yán)格執(zhí)行臨床病理操作規(guī)范，嚴(yán)格遵循中華醫(yī)學(xué)會編著的《臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊》相關(guān)內(nèi)容，并嚴(yán)格按照操作規(guī)范操作，采用SP法即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法。

1.2.2 標(biāo)本的固定：用中性福爾馬林固定液固定標(biāo)本8～20 h。

1.2.3 組織的包埋、切片、烤片：常規(guī)石蠟包埋，切片，切片厚度2～3 μm。切片避免刀痕和組織折疊，并用防脫玻片，烤片溫度60～62 ℃，拷片時(shí)間2～3 h。

1.2.4 抗原修復(fù)

1.2.4.1 切片常規(guī)脫蠟至水，用生理鹽水或蒸餾水沖洗一次，再用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.2 利用自動染色儀幫助監(jiān)測抗體或試劑的有效成分，并保證試劑在有效期內(nèi)。

1.2.4.3 滴加一滴3%甲醇雙氧化溶液，室溫下10 min，然后 PBS沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.4 抗原修復(fù)：需進(jìn)行抗原修復(fù)的，據(jù)需要或?qū)⑶衅糜谑⒂袡幟仕猁}緩沖液的高壓鍋內(nèi)高壓修復(fù)3 min；或用EDTA水浴加熱10 min；或用胰酶或胃酶消化15 min，PBS沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.5 滴加第一抗體：置濕盒中4 ℃過夜，PBS沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.6 滴加第二抗體：置室溫下15 min，PBS沖洗液沖洗3次×3 min。

1.2.4.7 DAB顯色：滴加新鮮配制DAB溶液，鏡下控制顯色強(qiáng)度。

1.2.4.8 水洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。

2 結(jié) 果

染色質(zhì)量標(biāo)志：陰性和陽性對照標(biāo)準(zhǔn)率均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

3 討 論

3.1 免疫組化染色的意義：免疫組化在臨床及病理診斷中已廣泛應(yīng)用，對疾病的判定、鑒別診斷及判定疾病的預(yù)后及臨床醫(yī)師對疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。嚴(yán)格做好免疫組化質(zhì)量控制是提高病理診斷水平的重要里程碑。

3.2 嚴(yán)格執(zhí)行臨床病理操作規(guī)范：為提高免疫組化染色的準(zhǔn)確率，病理工作人員在工作中應(yīng)嚴(yán)格遵循中華醫(yī)學(xué)會編著的《臨床技術(shù)操作病理學(xué)分冊》相關(guān)內(nèi)容規(guī)定，如免疫組化的適用范圍，不宜應(yīng)用的范圍等。并嚴(yán)格按照操作規(guī)范操作，并不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)是提高免疫染色質(zhì)量的先決條件[2]。

3.3 注意事項(xiàng)

3.3.1 組織固定要充分及時(shí)且不宜超過24 h，若固定時(shí)間過長，由于甲醛及組織蛋白間的交聯(lián)等作用致使細(xì)胞的抗原決定簇被覆蓋、丟失，影響其表達(dá)活性，但組織沒有完全固定，則造成細(xì)胞溶解、抗原丟失。

3.3.2 烤片溫度不宜過高（≤62 ℃），溫度過高且時(shí)間＞4 h組織長時(shí)間暴露在高溫下則可能出現(xiàn)邊緣假象。因此當(dāng)要顯示低表達(dá)抗原時(shí)，烤片應(yīng)該在37 ℃或室溫下干燥過夜。

3.3.3 組織切片不宜過厚或過?。?～3 μm），并盡量減少刀痕及組織折疊，否則易出現(xiàn)背景過深或特異性染色。

3.3.4 嚴(yán)格監(jiān)控試劑的有效期和有效濃度。

3.3.5 自動化染色可最大程度減少操作程序上的錯誤，而手工染色要嚴(yán)格保持操作方法的一致性。

3.3.6 注意監(jiān)控染色質(zhì)量：每批染色后都應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢查并作陰、陽性對照，盡量采用內(nèi)對照，如用血管壁平滑肌是否著色來判斷Actin著色是否成功。

4 假陰性著色原因

假陰性著色指組織中的抗原應(yīng)該表達(dá)卻沒有著色。

4.1 脫蠟不完全：石蠟層會干擾甚至抑制抗體與抗原結(jié)合，需在二甲苯中徹底脫蠟，二甲苯和酒精應(yīng)定期更換。

4.2 修復(fù)液不正確：不是所有抗原修復(fù)液溶液都適用于所有抗體，當(dāng)抗原用EDTA修復(fù)最佳時(shí)，換用檸檬酸修復(fù)液有可能造成假陰性結(jié)果。

4.3 抗原熱修復(fù)溫度不夠充分：沒達(dá)到合適溫度和規(guī)定時(shí)間，充分逆轉(zhuǎn)固定可能無法實(shí)現(xiàn)。

4.4 酶修復(fù)過度：若組織被過度修復(fù)致其形態(tài)學(xué)破壞，則其抗原可能就不再與抗體結(jié)合，從而造成假陰性結(jié)果。

4.5 抗體濃度：抗體在4 ℃冷藏一段時(shí)間后效價(jià)會降低，并在某個時(shí)候會迅速下降以致產(chǎn)生陰性結(jié)果。

4.6 顯色劑不相容：標(biāo)準(zhǔn)組合是HRP酶與DAB顯色劑組合，核快紅顯色劑與BCIP/NBT起反應(yīng)，只用于堿性磷酸酶。

4.7 步驟錯誤：如沒按正常順序或時(shí)間完成，試劑配制錯誤，儀器電腦出故障，試劑標(biāo)簽貼錯，切片擺放錯誤等。

總之，進(jìn)行免疫組化染色須有高度的責(zé)任心，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，避免不良現(xiàn)象發(fā)生，經(jīng)常做實(shí)驗(yàn)后總結(jié)工作，可提高免疫組化染色質(zhì)量。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會.臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2004:10-12.

[2] 2015全國衛(wèi)生專業(yè)技術(shù)資格考試指導(dǎo)病理學(xué)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2014:10-101.

R446.6

B

1671-8194（2017）20-0033-02