心臟β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體與肥厚型心肌病的關(guān)系研究

劉蓉，喬樹賓，胡奉環(huán)，袁建松，楊偉憲

臨床研究

心臟β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體與肥厚型心肌病的關(guān)系研究

劉蓉，喬樹賓，胡奉環(huán)，袁建松，楊偉憲

目的：探討心臟β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體與肥厚型心肌病的相關(guān)性。

方法：以細胞外第二環(huán)表位肽段的合成肽作為抗原，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，檢測81例肥厚型心肌病患者（肥厚型心肌病組）和50例健康受試者（正常對照組）血清中心臟β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體。

結(jié)果：（1）肥厚型心肌病組β1受體自身抗體的陽性率為58.02%（47/81），明顯高于正常對照組12.00%（6/50），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；肥厚型心肌病組M2乙酰膽堿能受體自身抗體陽性率為44.44%（36/81），顯著高于正常對照組10.00%（5/50），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（2）肥厚型心肌病組β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體的平均幾何滴度分別為1:85和1:80，顯著高于正常對照組的1:36和1:35，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（3）肥厚型心肌病組β1腎上腺素能受體自身抗體陽性血清中43.48%（20/46）的患者同時具有M2乙酰膽堿能受體的自身抗體。

結(jié)論：肥厚型心肌病患者血清中存在心臟β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體，可能與其心肌結(jié)構(gòu)變化和舒張功能下降有關(guān)。心臟β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的雙抗體陽性可能是自身免疫反應(yīng)的多重性表現(xiàn)，提示免疫學機制參與肥厚型心肌病的病理生理過程。

心肌病，肥厚型；受體，腎上腺素能β；受體，膽堿能

G-蛋白偶聯(lián)型β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體是調(diào)節(jié)心臟生理活動的重要受體。既往研究顯示，收縮功能不全的各類心力衰竭患者血清中存在抗G-蛋白偶聯(lián)型β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體[1,2]。這些自身抗體與受體結(jié)合后可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。肥厚型心肌病是一種常染色體顯性遺傳疾病，以心肌非對稱性肥厚為特征，以舒張功能不全為主要表現(xiàn)，其血清中是否存在這些受體的自身抗體，目前相關(guān)研究較少。本研究主要通過酶聯(lián)免疫吸附法測定肥厚型心肌病患者血清中β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體，探討兩種受體的自身抗體與肥厚型心肌病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究資料

研究入選2011-01至2012-01期間住院或門診的81例肥厚型梗阻性心肌病患者（肥厚型心肌病組），女24例，男57例，平均年齡（44.89±12.16）歲。入選標準：無收縮功能不全，左心室射血分數(shù)＞50%，紐約心臟協(xié)會（NYHA）心功能分級Ⅱ～Ⅳ級。排除自身免疫性疾病及各種內(nèi)分泌疾病、心臟瓣膜病、先天性心臟病。同時入選健康受試者50例為正常對照組，其年齡、性別與肥厚型心肌病組匹配，X線胸片、超聲心動圖、心電圖、肝腎功能、血尿便常規(guī)均正常。

1.2 研究方法

肥厚型心肌病患者及正常對照組患者均采肘靜脈血2 ml，常溫下靜置30 min，以3000 rpm離心10 min，分離血清-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

肽段合成方法：抗原肽段由中國科學院生物分子研究所合成相當于人β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體細胞外第二環(huán)氨基酸序列的肽段（β1肽段197～222位的氨基酸序列：HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC；M2肽 段169～193位 的 氨 基 酸 序 列：VRTVEDGECYIQFFSNAAVFFGTAIC）

酶聯(lián)免疫吸附法檢測：將β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體兩種氨基酸肽段配成抗原包被溶液，在微量酶標板的滴定孔上包被，每孔分別加入稀釋后人的血清50 μl，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）-T洗孔三次，每孔加入50 μl親和純化的生物素羊抗人IgG（H+L）抗體，用PBS-T溶液洗板3次，每孔加入50 μl鏈酶親和素-辣根過氧化酶，用PBS-T溶液洗孔3次，每孔加50 μl 2.5 mmol/L H2O2、2 mmol/L ABTS及檸檬酸緩沖液（PH=5）的混合液，37℃水浴30 min后上酶標儀，用波長為405 nm的濾光片測光密度值（OD值）。

判斷標準：以陽性血清與陰性血清的吸光度之比即P/N比值來判斷，P/N＞2.1為陽性（P/N=標本A值-空白對照A值/陰性對照A值-空白對照A值）?？贵w滴度的判定，將標本從1:20～1:160依次倍比稀釋，以出現(xiàn)P/N＞2.1的最高稀釋度作為該標本的滴度。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。兩樣本陽性率比較采用χ2檢驗，幾何均數(shù)表示抗體滴度的平均值，采用t檢驗比較兩幾何均數(shù)間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體陽性率比較

肥厚型心肌病組患者的β1腎上腺素能受體的自身抗體陽性率為58.02%（47/81），正常對照組為12.00%（6/50），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。肥厚型心肌病組M2乙酰膽堿能受體的自身抗體陽性率為44.44%（36/81），正常對照組為10.00%（5/50），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 β1腎上腺素能受體的自身抗體陽性患者血清中有20例（43.48%）同時具有M2乙酰膽堿能受體的自身抗體。

2.2 兩組中自身抗體陽性患者的血清中平均幾何滴度比較

肥厚型心肌病組β1腎上腺素能受體的自身抗體的平均幾何滴度為1:85（lg 1.93±0.31），正常對照組為1:36（lg 1.55±0.23），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。肥厚型心肌病組M2乙酰膽堿能受體的自身抗體的平均幾何滴度為1:80（lg 1.90±0.36），正常對照組為1:35（lg 1.54±0.24），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

本研究表明肥厚型心肌病患者的血清中存在β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體。心臟β1腎上腺素能受體和M2乙酰膽堿能受體是調(diào)節(jié)心臟活動的重要受體。兒茶酚胺激動心肌細胞膜上的β1腎上腺素能受體，通過修飾激動性G-蛋白，激活腺苷酸環(huán)化酶，從而增加作為第二信使的腺苷-3',5'-環(huán)化-磷酸（CAMP）的生成，使心率加快，心肌收縮性增強，心排血量增加[3]。相反乙酰膽堿能激動心肌細胞上的乙酰膽堿能受體，通過修飾抑制性G-蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶，減少第二信使CAMP的生成，使心率減慢、心肌收縮性下降，心排血量減少，這兩種受體在動態(tài)平衡中維持著心臟的正常功能[4]。當心臟發(fā)生病理變化時，這兩種受體之間的動態(tài)平衡失調(diào)，并產(chǎn)生受體的自身抗體。

1990 年，β1腎上腺素能受體自身抗體首先在擴張型心肌病患者血清中發(fā)現(xiàn)，隨后研究發(fā)現(xiàn)β1腎上腺素能受體自身抗體廣泛存在于各類心臟收縮功能不全患者血清中[1,2]。β1腎上腺素能受體的自身抗體可以與β1受體結(jié)合發(fā)揮腎上腺素能激素的作用，同時增強心臟β1腎上腺素能受體對腎上腺素能激素的敏感性。但β1腎上腺素能受體的自身抗體長期過度刺激則導(dǎo)致心肌β1腎上腺素能受體的密度下調(diào)[5]，加速心肌細胞凋亡，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，加速心功能的惡化。

既往研究表明收縮性心力衰竭患者血清中存在各種受體的自身抗體[1,2]，而肥厚型心肌病患者血清中是否存在這些抗體相關(guān)研究較少。本研究顯示肥厚型心肌病血清中β1腎上腺素能受體、M2乙酰膽堿能受體自身抗體陽性率及平均幾何滴度均顯著高于正常對照組。肥厚型心肌病主要以心臟舒張功能不全為主要表現(xiàn)，入選患者均無收縮功能不全，這也提示β1腎上腺素能受體的自身抗體對于舒張功能不全的心力衰竭患者同樣有病理生理意義。

猝死是肥厚型心肌病患者的主要死亡原因之一，而有研究發(fā)現(xiàn)β1受體自身抗體有促發(fā)惡性心律失常的作用，它可誘導(dǎo)早期后除極和動作電位時程顯著延長，減少鉀離子通道密度[5-7]。一項研究分析了104例擴張性心肌病患者，結(jié)果顯示β1腎上腺素能受體自身抗體陽性的患者多源性室性早博和室性心動過速（室速）的發(fā)生率高于β1受體自身抗體陰性的患者。多因素分析β1腎上腺素能受體自身抗體陽性和左心室射血分數(shù)＜30%是室速的獨立預(yù)測因子，同時也是猝死的獨立預(yù)測因子[8]。另一項研究入選了2062例心力衰竭患者和824例正常對照，測定受試者血清中β1腎上腺素能和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體，并隨訪36個月，研究發(fā)現(xiàn)β1腎上腺素能受體抗體與心力衰竭死亡率顯著相關(guān)，它是預(yù)測擴張性心肌病和缺血性心肌病猝死的獨立預(yù)測因子[9]。β1腎上腺素能受體自身抗體是否對于肥厚型心肌病患者的猝死有一定的預(yù)測作用尚須進一步研究。

本研究顯示肥厚型心肌病患者β1腎上腺素能受體的自身抗體和M2乙酰膽堿能受體的自身抗體陽性率及平均幾何滴度都顯著高于正常對照組，β1腎上腺素能受體抗體陽性的患者中43%同時M2乙酰膽堿能受體抗體陽性，這可能是免疫反應(yīng)多重性的表現(xiàn)，提示免疫機制參與了肥厚型心肌病的病理生理過程。

[1] Nussinovitch U, Shoenfeld Y. The diagonostic and clinical significance of anti-muscarinic receptor autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol,2012, 42: 298-308.

[2] Herda LR, Felix SB, Boege F. Drug-like actions of autoantibodies against receptors of the automomous nervous system and their impact on human heart function. Br J Pharmacol, 2012, 166: 847-857.

[3] Nikolaev VO, Boivin V, St?rk S, et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J Am Coll Cardiol, 2007, 50: 423-431.

[4] Stavrakis S, Kem DC, Patterson E, et al. Opposing cardiac effect of autoantibody activation of β-adrenergic and M2 muscarinic receptors in cardiac-related diseases. Int J Cardiol, 2011, 148: 331-336.

[5] Chiale PA, Ferrari I, Mahler E, et al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. Circulation, 2001,103: 1765-1771.

[6] Fukuda Y, Miyoshi S, Tanimoto K, et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces early afterdepolarization and decreases in K-channel density in rabbits. J Am Coll Cardiol, 2004, 43: 1090-1100.

[7] Nussinovitch U, Shoenfeld Y. The clinical significance of anti-beta-1 adrenergic receptor autoantibodies in cardiac disease. Clin Rev Allergy Immunol, 2013, 44: 75-83.

[8] Iwata M, Yoshikawa T, Baba A, et al. Autoantibodies against the second extracellular loop of beta1-adrenergic receptors predict ventricular tachycardia and sudden death in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol, 2001, 37: 418-424.

[9] Pei J, Li N, Chen J, et al. The predictive values of beta1-adrenergic and M2 muscarinic receptor autoantibodies for sudden cardiac death in patients with chronic heart failure. Eur J Heart Fail, 2012, 14: 887-894.

2016-12-08）

（編輯：許菁）

Correlation Study Between Autoantibodies to Myocardium β1-adrenergic Receptor, M2-muscarinic Receptor and Hypertrophic Cardiomyopathy

LIU Rong, QIAO Shu-bin, HU Feng-huan, YUAN Jian-song, YANG Wei-xian.

Coronary Heart Disease Center, National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing(100037), China

YANG Wei-xian, Email: wxyang2009@sina.com

Objective: To study the relationship between autoantibodies to myocardium β1-adrenergic receptor (β1-receptor), M2-muscarinic receptor (M2-receptor) and hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in relevant patients.

Methods: Our research included in 2 groups: HCM group, n=81 patients and Control group, n=50 normal subjects.Synthetic peptides corresponding to amino acid sequence of second extracellular loops of β1-receptor and M2-receptor were used as antigens, ELISA was conducted to detect serum autoantibodies to β1-receptor and M2-receptor in both groups.

Results:① Compared with Control group, HCM group had the higher positive rates of autoantibodies as for β1-receptor was 58.02% (47/81) vs 12.00% (6/50) and for M2-receptor was 44.44 % (36/81) vs 10.00% (5/50), both P＜0.05.② Compared with Control group, HCM group had the higher mean geometric titers of autoantibodies as for β1-receptor was 1:85 vs 1:36 and for M2-receptor was 1:80 vs 1:35, both P＜0.05. ③ In HCM group, 43.48 % patients with positive autoantibody to β1-receptor meanwhile have autoantibody to M2-receptor.

Conclusion: HCM patients having both autoantibodies to β1-receptor and M2-receptor might be related to cardiac structure change and diastolic function decreasing. Both positive antibodies implies that immunological mechanism has been involved in pathophysiological process in HCM patients.

Cardiomyopathy, hypertrophic; Receptor, Adrenergic β; Receptor, Muscarinic M

100037 北京市，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院 冠心病診治中心

劉蓉 副主任醫(yī)師 博士 主要從事冠心病及肥厚型心肌病研究 Email：liurongwjt@sina.com 通訊作者：楊偉憲 Email：wxyang2009@sina.com

R54

A

1000-3614（2017）11-1104-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.11.014

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1104.)