安石榴苷對(duì)綿羊精液室溫保存效果影響的研究

郭艷昭,洪道輝,薛玉洋,石榮華,趙玉坤,曾維斌

(石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003)

精液保存技術(shù)是人工授精技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其保存方式有液態(tài)保存和固態(tài)保存兩種,其中液態(tài)保存又分為常溫保存和低溫保存[1]。與冷凍保存精液相比,常溫保存的精液妊娠率高,但精子存活時(shí)間短,是限制羊精液利用的主要制約因素。同時(shí),常溫保存的精液隨著時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),當(dāng)ROS超過(guò)精子自身抗氧化能力時(shí),會(huì)使精子產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),對(duì)其精子的質(zhì)膜、頂體均產(chǎn)生損傷,導(dǎo)致精子的活率降低。精液稀釋液中適當(dāng)添加抗氧化劑可降低精子產(chǎn)生的ROS,減緩氧化反應(yīng),提高精液常溫保存的質(zhì)量[2]。

安石榴苷是一種從石榴皮提取出來(lái)的天然酚類化合物,屬于柔化單寧類物質(zhì)。其分子式中含有糖基,極易溶于水。安石榴苷通過(guò)清除多種自由基來(lái)提高抗氧化活性,從而減少產(chǎn)生的氧化反應(yīng)損傷。安石榴苷可對(duì)氧化應(yīng)激引起的睪丸損傷和不孕癥起到治療作用。雄性小鼠腹膜內(nèi)給予內(nèi)毒素誘導(dǎo)睪丸氧化應(yīng)激損傷后,采用安石榴苷治療可減少睪丸的氧化應(yīng)激損傷并提高生育能力[3]。此外安石榴苷能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜及體外的鐵平衡,導(dǎo)致其能量供給失去平衡,最終影響細(xì)菌的繁殖[4]。安石榴苷在豬精液保存中已有應(yīng)用[5],其作為抗氧化劑在綿羊精液保存方面未見報(bào)道。本試驗(yàn)探討了不同濃度的安石榴苷對(duì)常溫保存多浪羊精液的活率、活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率的影響,為綿羊精液的保存提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品的采集

試驗(yàn)在芳草湖萬(wàn)只肉羊繁育場(chǎng)進(jìn)行,選擇年齡3歲、體況中等、性欲旺盛的多浪羊公羊3只,采用假陰道法采集精液,放入37 ℃保溫瓶中,5 min內(nèi)帶回芳草湖萬(wàn)頭羊場(chǎng)精子分析實(shí)驗(yàn)室,感官評(píng)價(jià)精液品質(zhì)合格且精子活率在0.75以上的用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

分別見表1、表2。

表2 主要儀器Tab.2 Main instruments

1.3 基礎(chǔ)液配制、稀釋和保存

15～25 ℃室溫環(huán)境下,準(zhǔn)確稱取 Tris 3.07 g、檸檬酸 1.63 g、葡萄糖 1.00 g、乳糖 1.00 g 溶解于99 mL滅菌超純水中,添加1 mL雙抗青鏈霉素,充分混勻,配制成基礎(chǔ)稀釋液;再分別添加安石榴苷,最終配制成0,10.0,12.5,15.0,17.5,20.0 μmol/L 含安石榴苷抗氧化劑的常溫稀釋液。

將配制好的常溫稀釋液水浴升溫至37 ℃,并按9∶1比例緩慢加入至等溫的精液中,邊加入邊攪拌均勻,再迅速分裝至1 mL 離心管中,緩慢冷卻至室溫。隨后使用多層紗布包裹,放置于17 ℃的保溫箱中。為避免精子的聚沉,每隔12 h輕輕晃動(dòng)離心管。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

精子活率、活力使用邁朗精子全自動(dòng)分析系統(tǒng)(CaSa)檢測(cè);精子質(zhì)膜完整率采用低滲腫脹試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試[6];精子頂體完整率使用多聚甲醛固定后,吉姆薩染液染色80 min,洗去浮色,干燥后鏡檢至少200個(gè)精子計(jì)算精子頂體完整率。頂體完整率(%)=(頂體完整的精子數(shù)/總精子數(shù))×100;抗氧化能力使用相應(yīng)的抗氧化試劑盒,在精液保存24,48,72 后檢測(cè)過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重檢驗(yàn),P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 精液品質(zhì)

2.1.1 精子活力

精子保存24 h時(shí),15.0,20.0 μmol/L處理精子活力較高,顯著高于其他處理(P<0.05);36 h時(shí),15.0 μmol/L處理精子活力最高,顯著高于對(duì)照處理和20.0 μmol/L處理(P<0.05),但與10.0,12.5和17.5 μmol/L處理差異不顯著(P>0.05);精子保存48 h和60 h時(shí),15.0 μmol/L處理精子活力高于對(duì)照處理及10.0,17.5,20.0 μmol/L處理;精子保存72 h時(shí),15 μmol/L處理精子活力水平高于其他各處理(P<0.05)。見表3。

表3 多浪羊精子活力測(cè)定結(jié)果Tab.3 Sperm motility of Dorang sheep %

2.1.2 精子活率

精子保存24 h時(shí),15.0 μmol/L處理精子活率最高,顯著高于對(duì)照處理和10.0,12.5 μmol/L處理(P<0.05);36 h時(shí),15.0 μmol/L處理精子活率最高,顯著高于對(duì)照處理和10.0,12.5,20.0 μmol/L處理(P<0.05);48,60,72 h時(shí),15.0 μmol/L處理精子活率最高,顯著高于其他各處理(P<0.05)。見表4。

表4 多浪羊精子活率測(cè)定結(jié)果Tab.4 The results of sperm motility test of Duolang sheep %

2.1.3 精子質(zhì)膜完整性

精子保存24 h時(shí),各處理間精子的質(zhì)膜完整性無(wú)顯著差異(P>0.05);48 h時(shí),15.0 μmol/L處理精子質(zhì)膜完整性為69.42%,顯著高于其他各處理(P<0.05),17.5 μmol/L處理顯著高于對(duì)照處理和10.0,12.5,20.0 μmol/L處理(P<0.05);72 h時(shí)15 μmol/L 處理精子質(zhì)膜完整性為48.61%,顯著高于其他各處理(P<0.05)。見表5。

表5 多浪羊精子質(zhì)膜完整性測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results of determination of sperm plasma membrane integrity of Dorang sheep %

2.1.4 精子頂體完整性

精子保存24 h時(shí),15.0 μmol/L處理精子頂體完整性為84.19%,顯著高于對(duì)照處理和10.0,17.5,20.0 μmol/L處理(P<0.05);48 h時(shí),12.5,15.0,17.5,20.0 μmol/L處理精子頂體完整性顯著高于對(duì)照處理(P<0.05);72 h時(shí),15.0 μmol/L處理精子頂體完整性為44.40%,顯著高于其他各處理(P<0.05)。見表6。

表6 多浪羊精子頂體完整性測(cè)定結(jié)果Tab.6 Results of acrosome integrity determination of sperm of Duolang sheep %

2.1.5 精子CAT酶活性

精子保存24,48 h時(shí),15.0 μmol/L處理CAT酶活性最高,顯著高于其他各處理(P<0.05);72 h時(shí),15.0,17.5 μmol/L處理CAT酶活性較高,顯著高于對(duì)照處理和10.0,12.5,20.0處理(P<0.05)。見圖1。

注: 柱標(biāo)字母完全不同表示差異顯著(P<0.05), 含相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖1 多浪羊精子CAT酶活性測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination of CAT enzyme activity ofsperm of Duolang sheep

2.1.6 精子SOD酶活性

精子保存24 h時(shí),15.0 μmol/L處理SOD酶活性最高,顯著高于其他處理(P<0.05);48 h時(shí),12.5和15.0 μmol/L處理SOD酶活性較高,顯著高于對(duì)照處理和10.0,20.0 μmol/L處理(P<0.05);72 h時(shí),15.0 μmol/L處理SOD酶活性最高,顯著高于其他處理(P<0.05)。見圖2。

注: 柱標(biāo)字母完全不同表示差異顯著(P<0.05), 含相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2 多浪羊SOD酶活性測(cè)定結(jié)果Fig.2 Results of SOD enzyme activity assay ofDuolang sheep

3 討 論

3.1 對(duì)精子活子、活率、質(zhì)膜及頂體完整性的影響

精液常溫保存過(guò)程中,精子隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而產(chǎn)生大量的ROS自由基。其ROS自由基含量超過(guò)正常值時(shí),會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激,氧化損傷對(duì)細(xì)胞核和線粒體生物分子產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷,導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)的氧化降解及細(xì)胞毒性產(chǎn)物累積[7]。精液稀釋液中添加抗氧化劑會(huì)提高精液保存的效果,湖羊精液稀釋液中加入不同濃度的茶多酚和花青素,在常溫保存0,8,16 h后均能改善精子活力、存活率、畸形率和質(zhì)膜完整率[8]。在負(fù)壓條件下稀釋劑中添加5 mmol/L?；撬崽岣吡顺乇４尕i精子的活力及活率,并降低了畸形率[9]。在常溫保存基礎(chǔ)精液稀釋液中添加葡萄籽原花青素,可使多浪羊精液保存120 h后仍具有受精能力[10]。在常溫保存稀釋液中添加原花青素可顯著提高豬精液常溫保存時(shí)間和常溫保存質(zhì)量,且添加量為50 μg/mL時(shí)保存效果最佳[11]。本研究結(jié)果表明,綿羊精液稀釋液中含有15.0 μmol/L安石榴苷可顯著改善綿羊精液常溫保存的效果。

3.2 對(duì)精子抗氧化能力的影響

安石榴苷等植物多酚類抗氧化劑具有抗氧化功能,可以激活Nrf2/ARE通路,調(diào)節(jié)下游抗氧化基因的表達(dá),并促進(jìn)SOD、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶(GSH-Px)等抗氧化酶的合成,也可以直接提高抗氧化酶的活性、增加非酶抗氧化物含量,從而減少ROS的生成和損傷[12]。在豬精液常溫保存的研究發(fā)現(xiàn),添加花青素可以有效改善ROS對(duì)精子的損害,提高精液的保存效果[11]。添加葡萄籽原花青素天然抗氧化劑到綿羊常溫保存稀釋液中,其結(jié)構(gòu)中的酚性羥基能在液體環(huán)境中產(chǎn)生H+,降低精子線粒體膜和脂質(zhì)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),保證了精子功能發(fā)揮的完整性[13]。在負(fù)壓條件下,添加?；撬崮軌蛞种曝i精液中H2O2的生成,通過(guò)降低精子的氧化壓力而提升常溫保存9 d內(nèi)豬精液的質(zhì)量[9]。本研究結(jié)果表明,常溫保存綿羊精液稀釋液中加入15 μmol/L安石榴苷可使CAT、SOD酶活性均優(yōu)于其他處理組。

4 結(jié) 論

常溫條件下,綿羊稀釋液中添加安石榴苷可提高精子的活力、活率、精子質(zhì)膜和頂體完整性,同時(shí)提高了精子的CAT和SOD酶活性;且含15.0 μmol/L安石榴苷稀釋液常溫保存綿羊精液的效果最佳。