蒙藥大花葵對白色念珠菌的試驗(yàn)研究

任志欣 李東霞 楊麗敏

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

蒙藥大花葵對白色念珠菌的試驗(yàn)研究

任志欣1李東霞2楊麗敏3

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

目的：觀察大花葵的水提物及醇提物對白色念珠菌的體外抑菌試驗(yàn)研究，并觀察經(jīng)大花葵水提物作用后白色念珠菌的超微結(jié)構(gòu)改變。方法：分別制備大花葵的水、醇提物，采用SDA培養(yǎng)基，應(yīng)用液態(tài)稀釋法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)的研究，并對經(jīng)藥物作用前后的白色念珠菌進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果：大花葵水、醇提物對白色念珠菌的MIC值分別為50mg/mL和100mg/mL，掃描電鏡下觀察顯示，經(jīng)大花葵水提物作用后的白色念珠菌有較明顯的結(jié)構(gòu)改變。結(jié)論：通過本試驗(yàn)明確了蒙藥對白色念珠菌有較突出的抑制作用，在為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)的同時，也為此類疾病的治療提供新的可供選擇的方法，有待于我們進(jìn)一步深入研究。

蒙藥；白色念珠菌；試驗(yàn)研究

白色念珠菌是最常見的條件致病菌，在檢出的致病性真菌中占首位[1-2]。目前抗此類真菌的藥物種類繁多，但副作用大，且容易復(fù)發(fā)。因此，具有抗真菌作用的中藥及民族藥作為純天然、無污染藥物，具有價格低廉，毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)越來越受到人們的關(guān)注。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上[3]，篩選蒙藥大花葵( Malva sylvestris?)，即占巴其其格的水提物和醇提物對白色念珠菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究，以找出其有效的活性成分，為抗真菌蒙藥的研發(fā)提供一些新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：菌種，白色念珠菌(Candida. Albicams.編號ATCC-11006)由北大醫(yī)院真菌實(shí)驗(yàn)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株。實(shí)驗(yàn)用蒙藥大花葵來自內(nèi)蒙古中醫(yī)藥研究所。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基：沙堡弱培養(yǎng)基(Sabouraud dextroseagar SDA)，成分為麥芽糖 4g、蛋白胨1g、瓊脂2g、蒸餾水100mL。將上述成分按照一定比例混合后，加熱充分溶解，121℃,15min高壓滅菌。

1.2.2 藥物提?。簩⒋蠡鬯槌纱址?。水提取法，取100g藥物置于不銹鋼鍋中，加10倍蒸餾水1000mL侵泡4h后與加石棉網(wǎng)的電爐上加熱煎煮1h，絹布過濾，濾出煎液，藥渣再加5倍蒸餾水500mL,同時浸泡、煎煮、過濾，將2次濾液混合，加熱濃縮至小體積，超濾膜過濾，采用真空干燥箱70減壓干燥36h得藥材水提物。乙醇提取法：取大花葵粗粉100g置于圓底燒瓶中，加入10倍量95%醫(yī)用乙醇1000mL，浸泡4h后回流提取1h，絹布過濾，濾出乙醇液，藥渣再加5倍量95%醫(yī)用乙醇500mL，提取同上法相同。將2次乙醇液混合，加熱濃縮至小體積，超濾膜過濾，減壓回收乙醇至小體積，在水浴鍋上繼續(xù)濃縮成流浸膏，采用真空干燥箱70減壓干燥36h得藥材醇提取物。

最后將提取物烘干箱內(nèi)烘干后制成細(xì)粉劑。

1.3 抑菌試驗(yàn)

1.3.1 受試菌活化：白色念珠菌接種于平皿內(nèi)的SDA培養(yǎng)基，于36℃溫箱培養(yǎng)48h，培養(yǎng)二代后的新鮮菌落備用。

1.3.2 液態(tài)培養(yǎng)基稀釋法(倍比稀釋法)：將大花葵的水提物和醇提物各稱0.5g,分別溶于2.5mL液態(tài)沙堡弱培養(yǎng)基(不加蛋白胨)，按倍比稀釋法將其在無菌操作臺稀釋為100g/L，50g/L， 25g/L，12.5g/L和6.25g/L5個濃度。

用生理鹽水洗下平皿內(nèi)培養(yǎng)的新鮮菌落入試管(在無菌操作臺操作)，并將洗下的菌落取0.1mL加入4.9mL生理鹽水中，再用比濁管比濁，標(biāo)準(zhǔn)管為0.045×108/mL(即原液中菌落數(shù)為4500000個/mL)，將其用生理鹽水稀釋后為10000個/mL。用吸量管吸取已制備好的菌液0.1mL分別加入不同濃度藥液中(即每毫升藥液中含菌落1000個)，后放入36～37溫箱中培養(yǎng)48h后，將藥液在酒精燈下從試管中分別倒入已備好的固體SDA培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，再放入36～37溫箱中培養(yǎng)同樣時間后觀察。以上試驗(yàn)選取空白對照組(未加藥物接種菌懸液的培養(yǎng)基)為陽性對照，不含藥物和菌懸液的純培養(yǎng)基為陰性對照。

1.3.3 結(jié)果判定：該藥水、醇提物抑菌試驗(yàn)均重復(fù)3次，取重復(fù)值或中間值，無菌落生長的平皿內(nèi)藥物濃度即為該藥對此菌的最小抑菌濃度(即MIC值)。

1.4 掃描電子顯微鏡下觀察：濃度為50g/L的大花葵水提物放入已活化的白色念珠菌液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h后，用無菌蒸餾水離心2次，倒掉上清液，加2.5%的戊二醛固定，后放入4冰箱內(nèi)24h。然后PBS液沖洗、離心3次，50%、70%、95%、100%梯度酒精脫水。將放在100%酒精中的標(biāo)本同酒精同放在4℃冰箱中凍結(jié)成固體。再用抽濾瓶于真空條件下干燥、噴金，在S-530型掃描電子顯微鏡下觀察藥物作用前后白色念珠菌的形態(tài)改變。(以上電鏡部分在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡中心完成)

2 結(jié)果

2.1 MIC抑菌濃度測定：濃度為100mg/mL的醇提物及濃度為50mg/mL的水提物與空白對照組相比對白色念珠菌有抑制作用，即MIC值分別為100mg/mL和50mg/mL。

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果：未經(jīng)藥物作用的白色念珠菌呈卵圓形，有出芽，菌體表面光滑、無皺褶；經(jīng)藥物作用后的菌體表面結(jié)構(gòu)有明顯變化，分生孢子的細(xì)胞壁粗糙、出現(xiàn)凹陷、甚至外層剝落，可見菌體球狀膨大、皺縮、不規(guī)則，且破壞后的菌落成堆出現(xiàn)，有的菌體有缺口、壓跡尾巴，菌絲變短變粗，甚至塌陷、剝脫。

3 討論

近年來，隨著免疫抑制劑，廣譜抗生素和抗腫瘤藥物等的廣泛應(yīng)用，臨床常見的真菌性皮膚病有不斷上升的趨勢，且此類疾病的高發(fā)病率，高復(fù)發(fā)率已伴隨經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會的進(jìn)步而日益受到醫(yī)患雙方的重視。蒙醫(yī)藥是祖國醫(yī)藥學(xué)的一塊瑰寶，是蒙古民族的珍貴遺產(chǎn)。蒙藥的化學(xué)成分比較復(fù)雜，本試驗(yàn)選用醇提和水提兩種方式，了解同一藥用2種不同方法提取后抗白色念珠菌方面的差異

本試驗(yàn)選用大花葵水、醇提物對白色念珠菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明：大花葵水提物MIC值為50mg/mL，醇提物為100mg/mL。掃描電子顯微鏡下大花葵水提物對白色念珠菌有破壞作用，使菌絲彎曲，腫脹。由此進(jìn)一步證實(shí)大花葵水提物對白色念珠菌有抑制作用。通過本試驗(yàn)，可以為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)的同時也為此類疾病的治療提供新的可供選擇的方法。

[1].李莉，蘇天璐，苗翠，等.白色念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的耐藥性分析[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011,15(1):126～128.

[2]江園萍，章強(qiáng)強(qiáng)，李莉.328株真菌病原菌分析[J].皮膚病與性病，2012,34(4)：214～215.

[3]包德畢歷格，陳德珍，秦效勇，等.60種蒙藥試管內(nèi)抑制真菌作用的初步實(shí)驗(yàn)研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，1991,5(2)：80～82

2016年8月10日收稿

R291.2

A

1006-6810(2017)02-0068-02