耐受重金屬鉛乳酸菌的分離篩選及鑒定

賈原博,趙曉峰,賀 敏,顧 悅,賀銀鳳,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古包頭市疾病控制中心,內(nèi)蒙古包頭 014030)

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耐受重金屬鉛乳酸菌的分離篩選及鑒定

賈原博1,趙曉峰1,賀 敏2,顧 悅1,賀銀鳳1,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古包頭市疾病控制中心,內(nèi)蒙古包頭 014030)

通過對(duì)包頭尾礦庫區(qū)、白云鄂博采礦區(qū)重金屬污染嚴(yán)重區(qū)域土壤樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離、篩選,共得到62株乳酸菌,并對(duì)分離得到的乳酸菌進(jìn)行耐受鉛離子的測定,62株乳酸菌對(duì)鉛離子均有一定的耐受能力,不同菌株對(duì)鉛離子的耐受能力有所不同;鉛離子濃度為1200～9600 mg/L時(shí),隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長,菌株對(duì)耐受鉛離子的修復(fù)能力逐漸增強(qiáng);30 ℃下分離得到的菌株對(duì)鉛離子的修復(fù)能力明顯優(yōu)于37 ℃下分離得到的菌株;菌株BY-Fa4、BG-5b3、BG-8b2等13株菌可在鉛離子濃度為7200 mg/L的環(huán)境下生長,菌株BY-Fa1、BY-Fc2、BG-6b1可在鉛離子濃度為8400 mg/L的環(huán)境下生長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出篩選得到的13株乳酸菌對(duì)鉛離子不僅具有較強(qiáng)的耐受能力,而且還具有較強(qiáng)的修復(fù)能力。對(duì)篩選出13株高耐受鉛離子的菌株進(jìn)行16S rRNA序列分析,鑒定結(jié)果為戊糖片球菌2株、清酒乳桿菌1株、食竇魏斯氏菌5株、戊糖乳桿菌2株、植物乳桿菌3株。

尾礦區(qū),乳酸菌,耐受重金屬鉛,篩選與鑒定

生物修復(fù)作為近年來研究投入關(guān)注度較多的新興修復(fù)、治理重金屬污染的方法,由于其原材料廣泛、修復(fù)效果好、成本低廉、操作簡單、對(duì)環(huán)境不會(huì)產(chǎn)生次生危害等特點(diǎn),成為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。水生生物如部分魚類、貝殼類、藻類,陸生生物如部分植物、大型真菌[1-3],以及很多的微生物如霉菌[4]、酵母菌[5]、芽孢桿菌[6]等均可用來作為修復(fù)重金屬污染。微生物具有個(gè)體小、數(shù)量龐大、繁殖速度快、吸附效率高等特點(diǎn),作為生物吸附劑修復(fù)重金屬污染具有很大的潛力。隨著研究的不斷深入,有研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌對(duì)重金屬有著良好的抗性和吸附性能,并且乳酸菌作為人體腸道內(nèi)的有益菌群,對(duì)人體健康也有很好的保健作用[7-8]。國內(nèi)外對(duì)將乳酸菌作為生物吸附劑的研究還是比較少的,這些研究報(bào)道為本研究開發(fā)應(yīng)用于人體、動(dòng)物體的新型生物吸附劑提供了思路。

內(nèi)蒙古地區(qū)礦產(chǎn)資源豐富,在礦產(chǎn)資源開采和利用的過程中會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定的污染,據(jù)資料顯示包頭尾礦庫區(qū)、白云鄂博采礦區(qū)重金屬污染指數(shù)比背景值高出9倍,人們的健康安全受到了極大的威脅。本研究通過對(duì)包頭尾礦庫區(qū)、白云鄂博采礦區(qū)重金屬污染嚴(yán)重區(qū)域的土壤樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離、篩選,對(duì)其分離特性、耐受程度進(jìn)行探討,并對(duì)能夠耐受較高鉛離子濃度菌株進(jìn)行鑒定,從而為后期對(duì)吸附機(jī)理、開發(fā)新型生物吸附劑,以及將優(yōu)良菌種應(yīng)用到飼料或食品中奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

實(shí)驗(yàn)樣品 采集自內(nèi)蒙古包頭市包頭鋼鐵廠尾礦庫區(qū)(BG1～BG10)、白云鄂博稀土礦礦區(qū)(BY-A～BY-F)周邊土壤及污水處理廠淤泥,共計(jì)17個(gè)樣品;鉛儲(chǔ)備液[9];MRS 固體培養(yǎng)基(DifcoTM Lactobacilli MRS Agar) 用于培養(yǎng)乳酸菌;MRS半固體培養(yǎng)基 用于保藏乳酸菌;MRS(Man Rogosa Sharpe broth)液體培養(yǎng)基 用于種子發(fā)酵培養(yǎng)[10-11];細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;2×Easy Taq Super Mix TRANS公司;溶菌酶-306A046 Solarbio公司;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer 寶生物工程有限公司;瓊脂糖 Sigma公司;核酸染料 TaKaRa公司;生理生化鑒定培養(yǎng)管 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

OHAUS型電子天平 上海OHAUS有限公司;SX-500型高壓滅菌鍋 日本TOMY公司;FLC-3型超凈工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)公司;HPS-250型生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;OLYMPOS BX50型光學(xué)顯微鏡 OLYMPOS公司;pHS-25 型數(shù)顯酸度計(jì) 雷磁分析儀器廠;HH.S-Ni電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠;BG-Power3500電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司;Veriti 96孔PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 實(shí)驗(yàn)選取重金屬污染相對(duì)嚴(yán)重的包頭鋼鐵廠、包頭尾礦庫和白云鄂博稀土礦區(qū)土壤及污水處理廠淤泥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選擇地勢平坦的區(qū)域,去掉土壤表層雜物和浮土,在距離地表5～20 cm深處使用土壤采集器取樣,采用梅花五點(diǎn)法進(jìn)行打孔采樣,將五點(diǎn)樣品(每五點(diǎn)為一個(gè)樣)混合均勻后裝入塑料封口袋,封好袋口,在封口袋上做好標(biāo)記,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 耐受鉛離子乳酸菌的分離純化 將保存的土壤樣品取出適量,恢復(fù)至室溫,混合均勻后,稱取1 g溶解于生理鹽水中,使菌群均勻分布,接種至MRS液體培養(yǎng)基中,分別置于30 ℃有氧、30 ℃厭氧和37 ℃有氧、37 ℃厭氧環(huán)境靜置培養(yǎng)7 d以富集LAB菌群[12]。將富集培養(yǎng)基劃線至含100 mg/L鉛離子濃度和CaCO3的MRS固體平板培養(yǎng)基上,分別置于30 ℃有氧、30 ℃厭氧和37 ℃有氧、37 ℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)24 h。

挑取有透明圈的、具有金屬抗性的LAB菌落,接種至MRS液體培養(yǎng)基中,觀察記錄菌落形態(tài),觀察各菌株的形態(tài)及革蘭氏染色,對(duì)革蘭氏陽性菌株進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn),用3%過氧化氫溶液滴加一滴至單個(gè)菌落,如果有氣泡產(chǎn)生表明細(xì)菌中存在過氧化氫酶,棄掉過氧化氫酶陽性的菌落。將分離篩選得到的革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性的桿菌和球菌暫定為乳酸菌。將分離得到的乳酸菌在MRS固體平板培養(yǎng)基上再劃線兩次以更進(jìn)一步得到純培養(yǎng)物。

1.2.3 乳酸菌對(duì)鉛離子最大耐受濃度的測定 將分離得到的乳酸菌活化至三代,分別劃線至鉛離子濃度為0、1200、2400、3600、4800、6000、7200、8400、9600 mg/L的MRS固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃和30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔24 h觀察菌株生長情況直到96 h,記錄乳酸菌對(duì)鉛離子的耐受及其修復(fù)能力。

1.2.4 高耐受鉛乳酸菌的鑒定

1.2.4.1 實(shí)驗(yàn)菌株總DNA的提取及16S rRNA序列PCR擴(kuò)增及凝膠電泳 將實(shí)驗(yàn)菌株活化培養(yǎng)至三代,3000 r/min離心10 min,用生理鹽水洗滌3次后,按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書中步驟進(jìn)行基因組DNA的提取。

實(shí)驗(yàn)菌株16S rRNA序列PCR擴(kuò)增引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ R:5′-CCGTCAA TTCCTTTGAGTTT-3′,參照文獻(xiàn)[13]所給引物。PCR擴(kuò)增體系:上下游引物各2 μL、模板DNA 2 μL、Dream Tap Green PCR Master Mix 25 μL、加無菌水補(bǔ)齊至50 μL。PCR條件參數(shù)為:預(yù)變性94 ℃ 3 min,變性94 ℃ 30 s,退火57.4 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 90 s,循環(huán)35次,最后末端延伸72 ℃ 5 min。取5 μL實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混合均勻上樣后,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(110 V、30 min),使用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶。

1.2.4.2 實(shí)驗(yàn)菌株16S rRNA序列分析 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程股份有限公司測序及雙向拼接后,在NCBI上用BLAST進(jìn)行同源性比較,最后使用DNAStar軟件中Megalign程序繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐受鉛離子乳酸菌分離

對(duì)所采樣品進(jìn)行分離后共得到62株乳酸菌,其中包鋼所采10個(gè)樣品中分離得到24株乳酸菌菌株,白云稀土礦區(qū)所采7個(gè)樣中分離得到38株乳酸菌菌株。白云稀土礦樣品分離得到的菌株較包鋼樣品分離得到的菌株多。

由表1可知,在不同的樣品中,分離得到的菌株個(gè)數(shù)也有所差異,BY-B、BY-C、BY-D三個(gè)樣品中分離得到的乳酸菌均來自37 ℃,可能是這三個(gè)樣品中的乳酸菌較適宜在37 ℃下生長;BG-7、BG-8兩個(gè)樣品中分離得到的乳酸菌均來自于30 ℃,可能是這兩個(gè)樣品中的乳酸菌更適宜在30 ℃條件下生長,其余樣品中在30 ℃和37 ℃下均分離到了不同數(shù)量的乳酸菌。在37 ℃分離條件下白云鄂博稀土礦區(qū)所采樣品分離得到20株菌,包鋼所采樣品只分離得到10株菌,37 ℃對(duì)兩個(gè)不同采樣區(qū)域的分離結(jié)果影響比較明顯;30 ℃分離條件下兩個(gè)不同的采樣區(qū)域分離得到的乳酸菌株數(shù)比較接近,說明30 ℃對(duì)兩個(gè)不同采樣區(qū)域的影響不大。但從分離總數(shù)可以看出,在30 ℃分離得到32株乳酸菌,37 ℃分離得到30株乳酸菌,分離溫度對(duì)分離結(jié)果影響不大。在有氧條件下分離得到33株乳酸菌,厭氧條件下分離得到29株乳酸菌,厭氧條件下分離得到的菌株數(shù)較有氧條件略多,可能由于乳酸菌生長土壤中氧氣含量較低所致。

表2 分離溫度對(duì)菌株耐受能力的影響結(jié)果

注:“-”表示該濃度沒有可生長的菌株。

表1 各樣品不同溫度條件分離結(jié)果

注:“-”表示該條件下沒有可生長的菌株。

2.2 分離菌株耐受鉛離子篩選

2.2.1 分離菌株耐受不同鉛離子濃度的能力 培養(yǎng)基中設(shè)置鉛離子濃度分別為1200、2400、3600、4800、6000、7200、8400、9600 mg/L八個(gè)梯度,將分離得到的乳酸菌分別劃線至上述含不同鉛離子濃度的MRS固體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24、48、72、96 h觀察分離菌株的生長情況,結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出,菌株對(duì)鉛離子均有一定的耐受能力,不同菌株對(duì)鉛離子的耐受能力有所不同,隨著鉛離子濃度的增大,可耐受鉛離子濃度的菌株減少。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長,分離菌株對(duì)耐受鉛離子的修復(fù)能力逐漸增強(qiáng),如在鉛離子濃度為3600 mg/L,培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí),62株分離菌株中只有26株可生長,培養(yǎng)至48 h,有46株乳酸菌可生長,培養(yǎng)至72 h時(shí),可生長菌株增加到57株,當(dāng)培養(yǎng)到96 h時(shí),共有59株乳酸菌可生長,僅有3株分離菌株未生長。

圖1 不同鉛離子濃度下菌株生長情況Fig.1 Growth of various strains in different lead concentrations

2.2.2 分離溫度對(duì)菌株耐受能力的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置的分離溫度為30 ℃和37 ℃,對(duì)分離菌株在不同鉛離子濃度下的耐受情況結(jié)果如表2所示。從表2可以看出,在30 ℃和37 ℃下分離得到的菌株對(duì)鉛離子均有較強(qiáng)的耐受能力。當(dāng)鉛離子濃度大于4800 mg/L時(shí),30 ℃下分離得到的菌株對(duì)鉛離子的修復(fù)能力明顯優(yōu)于37 ℃下分離得到的菌株。如可耐受鉛離子濃度為6000 mg/L的菌株中,培養(yǎng)24 h時(shí),有3株來自30 ℃,2株來自37 ℃,培養(yǎng)至48 h時(shí),來自30 ℃的菌株增長至14株,37 ℃的菌株只有5株,培養(yǎng)至72 h,來自30 ℃的菌株為16株,37 ℃菌株為8株,培養(yǎng)至96 h,來自30 ℃下的菌株為19株,37 ℃的菌株為9株;再如,可耐受鉛離子濃度為7200 mg/L的菌株中,培養(yǎng)48 h時(shí),有2株來自30 ℃,1株來自37 ℃,培養(yǎng)至72 h時(shí),來自30 ℃的菌株增長至4株,37 ℃的菌株沒有變化,還是1株,培養(yǎng)至96 h,來自30 ℃下的菌株增加到12株,37 ℃的菌株無變化。

2.2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間乳酸菌最大耐受鉛離子濃度的測定結(jié)果 通過在不同的培養(yǎng)時(shí)間下測得的乳酸菌最大耐受鉛離子濃度,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,菌株逐步對(duì)鉛離子的抑制作用進(jìn)行修復(fù),表現(xiàn)出較好的耐受能力。實(shí)驗(yàn)中有13株乳酸菌對(duì)鉛離子表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受能力,由表3可知,培養(yǎng)96 h,菌株耐受鉛離子濃度均可達(dá)到7200 mg/L以上,這13株對(duì)鉛離子濃度耐受能力較強(qiáng)的菌株在培養(yǎng)48 h時(shí)就表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受能力。其中,BY-Fa1、BY-Fc2、BY-Fa4這3株乳酸菌在培養(yǎng)48 h最大耐受鉛離子濃度與培養(yǎng)至96 h時(shí)的最大耐受鉛離子濃度一致,說明這3株乳酸菌對(duì)鉛離子有較強(qiáng)的耐受能力,其余10株乳酸菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長對(duì)鉛離子的耐受能力均有提高,說明這10株乳酸菌除了對(duì)鉛離子有較強(qiáng)的耐受能力外,還對(duì)鉛離子有較強(qiáng)的修復(fù)能力。

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間菌株耐受鉛離子最大濃度值(mg/L)

2.3 高耐受鉛離子乳酸菌的鑒定

13株實(shí)驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的測序序列與GeneBank中菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較,同源性比較結(jié)果見圖2,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖3。

圖2 實(shí)驗(yàn)菌株與其他乳酸菌的同源性Fig.2 The homology between the test strains and other lactic acid bacteria

圖3 實(shí)驗(yàn)菌株與其他乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogentic tree of strains and other lactic acid bacteria

由圖2、圖3可知,實(shí)驗(yàn)菌株BG-10a1、BG-5b3與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)同源性為100%、96.3%,并且在系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于同一分支,進(jìn)化距離很相近,所以可以判定BG-10a1、BG-5b3為戊糖片球菌;BG-6b1與清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)的同源性為99.5%,在系統(tǒng)發(fā)育樹中位置最近,并屬于同一分支,可以判定BG-6a1為清酒乳桿菌;BY-Fa5、BY-Ff3、BY-Fe3、BY-Fe21、BG-8b2與食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)的同源性分別為99.4%、99.6%、100.0%、99.7%、95.9%,在系統(tǒng)發(fā)育樹中屬于同一分支,由此可鑒定為食竇魏斯氏菌;BY-Fa2、BY-Fa4與戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)的同源性分別為99.9%、97.2%,由此可鑒定為戊糖乳桿菌;BY-Fa1、BY-Fc2、BY-Ff4與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的同源性分別為99.2%、100.0%、99.9%,由此可鑒定為植物乳桿菌,標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC23658為屎腸球菌,與鑒定結(jié)果一致,說明測序結(jié)果可信。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)對(duì)包頭尾礦庫和白云鄂博稀土礦區(qū)17個(gè)樣品的分離,共得到62株乳酸菌。其中不同的溫度條件、不同的氧氣培養(yǎng)條件對(duì)分離菌株的總數(shù)結(jié)果影響不大;分離得到的62株乳酸菌對(duì)鉛離子均有一定的耐受能力,不同菌株對(duì)鉛離子的耐受能力有所不同。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長,菌株對(duì)耐受鉛離子的修復(fù)能力逐漸增強(qiáng);30 ℃下分離得到的菌株對(duì)鉛離子的修復(fù)能力明顯優(yōu)于37 ℃下分離得到的菌株;篩選得到13株對(duì)鉛離子不僅具有較強(qiáng)耐受能力而且具有較強(qiáng)修復(fù)能力的菌株;對(duì)篩選出13株高耐受鉛的菌株進(jìn)行16S rRNA序列分析,結(jié)果得出,菌株BG-10a1、BG-5b3為戊糖片球菌,菌株BG-6b1為清酒乳桿菌,菌株BY-Fa5、BY-Ff3、BY-Fe21、BY-Fe3、BG-8b2為食竇魏斯氏菌,菌株BY-Fa1、BY-Fa2、BY-Fa4、BY-Fc2、BY-Ff4為植物乳桿菌。

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Isolation,screening and identification of lactic acid bacteria tolerance to heavy metal lead

JIA Yuan-bo1,ZHAO Xiao-feng1,HE Min2,GU Yue1,HE Yin-feng1,*

(1.College of Food Sciences and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China; 2.Baotou Center Disease Control and Prevention,Baotou 014030,China)

A total of 62 strains of lactic acid bacteria was isolated from the soil sample which was polluted by heavy metal collected at Baotou and Baiyun Ebo mine. And by the test of the tolerance of lead ions,the 62 strains of lactic acid bacteria all had the tolerance of lead ions,but different stains had different tolerance capability. With the increasing of culturing time,the capability of strains to repair the lead ions had increased gradually when the concentration of lead ions was 1200～9600 mg/L. The strains which were isolated at 30 ℃ had better repair capability of lead ions than the strains isolated at 37 ℃. There were 13 strains could survive under the condition of 7200 mg/L concentration of lead ions,and the strains of BY-Fa4、BG-5b3、BG-8b2 could survive under the condition of 8400 mg/L concentration of lead ions. It indicated that there were 13 stains of all the lactic acid bacteria which isolated had better capability of both tolerance and repair to lead ions. The 16S rRNA gene of 13 strains was amplified by PCR and were identified as 2 strains ofPediococcuspentosaceus,1 strain ofLactobacillussake,5 strains ofWeissellacibaria,2 strains ofLactobacilluspentosus,3 strains ofLactobacillusplantarum.

tailings;lactic acid bacteria;tolerance to heavy metal lead;screening and identification

2016-05-27

賈原博(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:jiayb2016@163.com。

*通訊作者:賀銀鳳(1960-),女,教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:heyinf6468@163.com。

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015MS0345)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)22-0244-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.039