羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液中具有降膽固醇能力蛋白的分離、純化和鑒定

陳 臣,于瑞莉

(1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué),香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418; 2.江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

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羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液中具有降膽固醇能力蛋白的分離、純化和鑒定

陳 臣1,*,于瑞莉2

(1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué),香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418; 2.江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

羅伊氏乳桿菌DSM122460無細(xì)胞上清發(fā)酵液(cell-free supernatant,CFS)具有較高的膽固醇移除能力,經(jīng)初步鑒定有效成分為蛋白質(zhì)。通過超濾濃縮、硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE Sepharose F.F陰離子交換層析進(jìn)一步對(duì)該活性成分進(jìn)行分離純化。純化后,其比活力達(dá)到61.6 U/mg,純化倍數(shù)為32.4。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),樣品達(dá)到電泳級(jí)純,分子量約為60 ku。通過質(zhì)譜鑒定初步認(rèn)定該活性蛋白為一假設(shè)蛋白,其功能尚待進(jìn)一步研究。

羅伊氏乳桿菌,無細(xì)胞上清發(fā)酵液,移除膽固醇,純化,假設(shè)蛋白

膽固醇又稱膽甾醇,是動(dòng)物組織細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì),它不僅參與形成細(xì)胞膜,而且是合成膽汁酸、維生素D和甾體激素的原料,是人體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)成分[1]。膽固醇分為高密度膽固醇和低密度膽固醇兩種,前者對(duì)心血管有保護(hù)作用,后者偏高,能對(duì)動(dòng)脈造成損害。隨著人們生活水平的逐漸提高,低密度膽固醇攝入量普遍偏高。血清中低密度膽固醇含量偏高,容易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦中風(fēng)、高血壓等心腦血管疾病,嚴(yán)重威脅人類健康。研究表明,血清中低密度膽固醇減少1%就可以使冠心病的危險(xiǎn)降低2%～3%[2],因此,降低血清和食物中低密度膽固醇含量是當(dāng)前科學(xué)研究熱點(diǎn)之一。

早在1974年,Mann等研究者就發(fā)現(xiàn)大量飲用酸乳等發(fā)酵乳制品的非洲Masai人血清膽固醇保持在非常低的水平[3],之后的很多研究都表明乳酸菌具有降低血清總膽固醇及低密度膽固醇的功能[4]。然而益生菌降解血清膽固醇的確切機(jī)理目前仍不明確。Gilliland等[5]認(rèn)為在厭氧的條件下,乳酸菌在含有膽鹽的高膽固醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),菌體細(xì)胞可以吸收介質(zhì)中的膽固醇,降低介質(zhì)中的膽固醇含量。Klaver[6]和Corzo[7]研究表明乳酸菌從培養(yǎng)基中去除膽固醇是因其分泌膽鹽水解酶促進(jìn)甘氨酸鈉和?；撬徕c水解,細(xì)菌在動(dòng)物或人體內(nèi)通過水解結(jié)合型膽鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x膽酸,進(jìn)而與膽固醇發(fā)生共沉淀作用。隨著研究的開展,目前人們?cè)絹碓絻A向于認(rèn)為,細(xì)菌降低膽固醇的作用是由于菌體吸收和膽固醇共沉淀協(xié)同作用的觀點(diǎn),而且不同條件下細(xì)菌會(huì)表現(xiàn)出以某種方式(吸收或共沉淀)為主的能力[8]。此外,研究還發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵生成的不可消化短鏈脂肪酸、胞外多糖、蛋白質(zhì)等均參與對(duì)膽固醇的分解和去除作用[9-10]。上述研究結(jié)果充分說明乳酸菌的降膽固醇機(jī)制是復(fù)雜的,或許還有其它的作用方式存在。

羅伊氏乳桿菌普遍存在于人類和大部分動(dòng)物的腸道中,是目前已報(bào)道的具有降膽固醇能力的乳酸菌之一。研究發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌DSM122460在無細(xì)胞參與的情況下仍表現(xiàn)出膽固醇移除能力,其無細(xì)胞上清發(fā)酵液(Cell free supernatant,CFS)的膽固醇移除率可達(dá)到69%。通過比較對(duì)照組和處理組的膽鹽水解酶活性和移除膽固醇能力得出CFS中含有除膽鹽水解酶以外的可移除膽固醇的有效成分,經(jīng)硫酸銨沉淀等方法初步鑒定為蛋白類物質(zhì)[11]。本文對(duì)此有效成分進(jìn)行了分離純化,并通過質(zhì)譜進(jìn)行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅伊氏乳桿菌DSM122460 臺(tái)灣大學(xué)贈(zèng)送;鄰苯二甲醛 Sigma公司;MRS培養(yǎng)基 德國(guó)Merck公司;DEAE Sepharose F.F Ameisham Biosciences 公司;膽固醇、硫酸銨、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250等其他試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Avanti J30I高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;CE7250型紫外分光光度計(jì) 英國(guó)BIO-AQUARIUS公司;真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)LABCONCO公司;AKTK purifier層析儀 美國(guó)GE Healthcare公司;Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳儀、Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;4800 MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 羅伊氏乳桿菌DSM122460使用前按1%的接種量接種到MRS肉湯,在37 ℃培養(yǎng)12 h,傳代兩次進(jìn)行活化,實(shí)驗(yàn)菌株在實(shí)驗(yàn)過程中4 ℃冰箱保存。

1.2.2 粗蛋白液的制備 羅伊氏乳桿菌DSM122460菌液按1%接種于2 L MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,4 ℃,12000×g離心10 min收集上清液,經(jīng)0.22 μm微濾膜過濾后用截留分子量為30000 ku的膜超濾濃縮至200 mL。

1.2.3 硫酸銨分級(jí)沉淀 取200 mL蛋白濃縮液在冰浴條件下緩慢加入研磨好的硫酸銨粉末,依次至30%、40%、50%、60%、70%、80%的飽和度,緩慢攪拌防止泡沫產(chǎn)生。每加完一次硫酸銨后,將上清液于4 ℃冰箱靜置3 h,然后離心(10000×g,4 ℃,25 min),收集上清和沉淀,吸取少量上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量。剩余上清液繼續(xù)加入硫酸銨至下一設(shè)定飽和度,靜置,離心收集上清和沉淀,如此循環(huán)操作。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液的蛋白含量,沉淀用約兩倍體積的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.0)溶解后,透析,測(cè)定膽固醇清除能力。

確定最佳飽和度后,在后續(xù)操作中,首先在冰水浴條件下向上清液中加入硫酸銨至飽和度范圍的下限,4 ℃冰箱靜置過夜,離心(10000×g,4 ℃,25 min),棄去沉淀,量取上清液體積;冰浴條件下向上清液中加入硫酸銨至飽和度上限,4 ℃冰箱靜置3 h,離心(10000×g,4 ℃,25 min),收集沉淀,棄去上清液,將沉淀復(fù)溶至約2倍體積的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.0)中,透析除鹽。透析后的蛋白樣品裝入凍干瓶中,經(jīng)真空冷凍干燥后得到蛋白粉,磷酸鹽緩沖液溶解后進(jìn)行下一步純化操作。

1.2.4 陰離子交換層析 將DEAE-Sepharose F.F離子交換瓊脂糖凝膠沿玻璃棒緩慢加入到型號(hào)XK16/20層析柱中,凝膠沉降過夜,確保膠面平整。連接AKTA purifier層析儀,使用Unicorn軟件調(diào)整流速為0.5 mL/min,最大柱壓為0.15 MPa,UV 280 nm進(jìn)行檢測(cè)。先用經(jīng)抽濾脫氣的超純水平衡兩個(gè)柱體積至儀器基線平直,再用經(jīng)抽濾脫氣的緩沖液(pH7.0,25 mmol/L磷酸鹽緩沖液)平衡至儀器基線平直。上樣前,樣品需經(jīng)過0.45 μm膜過濾,用注射器將樣品注入每次上樣量為3mL待樣品全部進(jìn)入層析柱后,用緩沖液洗脫,流速0.5 mL/min,UV 280 nm檢測(cè)紫外吸收峰,待穿透峰洗脫結(jié)束后,以含0.5 mol/L NaCl的平衡緩沖液洗脫蛋白[12]。手動(dòng)收集樣品,當(dāng)UV 280 nm吸收開始明顯升高時(shí)開始進(jìn)行收集,每管5 mL,待UV 280 nm吸收值降低至基線時(shí)停止收集。收集產(chǎn)物4 ℃透析除鹽后濃縮測(cè)定其膽固醇清除能力。

梯度洗脫時(shí),起始緩沖液A為pH7.0,25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH7.0、25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,60 min內(nèi)洗脫8個(gè)柱體積后,兩種緩沖液按合適比例混合,可得到NaCl濃度在0～0.5 mol/L范圍的離子強(qiáng)度梯度。

1.2.5 SDS-PAGE電泳分析 采用不連續(xù)垂直板SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白的純度和分子量的分析,5%濃縮膠,12%分離膠,以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。模式為恒壓模式,電壓為110 V;電泳完后,用考馬斯亮藍(lán)染色液于室溫染色2 h,用脫色液脫色至蛋白條帶清晰。通過凝膠成像儀灰度掃描電泳膠板,分析蛋白分布與濃度。

1.2.6 目的蛋白的二級(jí)質(zhì)譜鑒定 將含有目的蛋白的SDS-PAGE膠塊切成1 mm3左右的小塊,裝入離心管中,水洗一次。用脫色緩沖液浸泡15 min。反復(fù)三次,直至將顏色脫盡,蒸餾水洗滌1次,將膠塊浸入30 μL 100%乙腈中5 min,脫水使膠塊變白,然后室溫抽干加8 μL胰蛋白酶液(0.005 mg/mL),37 ℃放置16 h左右。將0.3 μL已酶解的樣品點(diǎn)到樣品板上,室溫晾干,上MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀選用正離子反射模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜解析,選擇強(qiáng)度最大的10個(gè)峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜,將一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot 2.1(Matrix Science)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和蛋白鑒定。

1.2.7 膽固醇清除能力的測(cè)定 為了防止CFS有效成分純化過程中膽鹽水解酶的干擾,在每一步純化后進(jìn)行移除膽固醇能力測(cè)定時(shí)不再添加牛磺膽酸鈉。

取一定量的溶液或凍干粉溶于1 mL pH4.4的醋酸-醋酸鈉的緩沖液中,以相同體積的緩沖液作對(duì)照,分別加入制備好的卵磷脂-膽固醇膠束,混合均勻,37 ℃反應(yīng)30 min,利用改良的鄰苯二甲醛法[14]測(cè)定對(duì)照組和樣品組膽固醇含量。以1 h內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μg膽固醇所需的物質(zhì)含量定義為一個(gè)活力單位[13]。

式中:K,蛋白液稀釋倍數(shù);W,轉(zhuǎn)化膽固醇的量(μg);V,蛋白液液的體積(mL);T,反應(yīng)時(shí)間(h)。

1.2.8 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G250的方法,并計(jì)算比活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗蛋白液的濃縮

在分別研究羅伊氏乳桿菌DSM122460的CFS和細(xì)胞裂解物移除膽固醇能力后,結(jié)果顯示羅伊氏乳桿菌DSM122460的CFS具有相當(dāng)高的膽固醇移除能力,細(xì)胞裂解物基本無移除能力,表明參與移除膽固醇的物質(zhì)主要位于CFS[11]。經(jīng)蛋白濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn),CFS中蛋白含量偏低,蛋白濃度只有40 μg/mL左右,不利于進(jìn)一步蛋白的分離和純化。因此,CFS經(jīng)超濾濃縮至十分之一體積的濃縮液作為粗蛋白液的來源。

2.2 硫酸銨濃度的確定

如圖1所示,隨著硫酸銨濃度的增加,發(fā)酵上清液中的蛋白濃度隨著硫酸銨加入量的增加而逐漸減少,硫酸銨飽和度為30%時(shí)上清液中蛋白濃度為31.2 μg/mL時(shí),硫酸銨達(dá)到80%時(shí)上清液中蛋白濃度減低到10.8 μg/mL。不同飽和度沉淀得到的蛋白經(jīng)過鹽析脫鹽后,測(cè)得其去除膽固醇的能力。研究表明硫酸銨飽和度為30%、40%、50%和80%時(shí)沉淀出的蛋白沒有移除膽固醇的能力;飽和度為60%時(shí),活力為8.4 U/mL,飽和度為70%時(shí),活力為14.8 U/mL,膽固醇清除除能力最高。因此選用50%～70%硫酸銨飽和度純化該蛋白。

圖1 硫酸銨飽和度與降膽固醇能力的關(guān)系曲線Fig.1 The relationship between saturated ammonium sulfate solution and the cholesterol reduction ability

2.3 陰離子交換層析

羅伊氏乳桿菌DSM122460在pH為4.0的情況下膽固醇移除率最高,隨著pH的升高,移除率下降,推斷此蛋白的等電點(diǎn)在pH7.0以下[11]。因此選用陰離子交換劑(DEAE-Sepharose F.F)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[15]。

圖2 pH7.0,NaCl濃度為0.5 mol/L時(shí)目的蛋白在DEAE-Sepharose F.F層析圖譜Fig.2 Chromatography of the active substance on a DEAE-Sepharose F.F column at pH7.0 and 0.5 mol/L NaCl

從圖2可以看出,進(jìn)樣后得到一個(gè)蛋白峰Ⅰ,經(jīng)過0.5 mol/L NaCl-25 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗脫后得到洗脫峰Ⅱ,經(jīng)活力測(cè)定,峰Ⅱ具有降膽固醇能力。蛋白電泳結(jié)果表明(圖4),峰Ⅱ中含有多種蛋白。可能由于離子濃度太強(qiáng),幾種蛋白同時(shí)洗脫下來。采用起始緩沖液A(pH7.0,25 mmol/LPBS)與洗脫緩沖液B(pH7.0、25 mmol/LPBS,1 mol/L NaCl)進(jìn)行線性梯度洗脫,經(jīng)過60 min緩沖液B從0達(dá)到100%,峰II被洗脫開,得到3個(gè)洗脫峰,分離效果較好,結(jié)果如圖3所示。經(jīng)活力測(cè)定,NaCl濃度約為0.25 mol/L時(shí)洗脫出的峰Ⅱ-3具有降膽固醇能力,收集該組分,凍干備用。

圖3 pH7.0、采用線性梯度洗脫(NaCl濃度0～0.5 mol/L)時(shí)目的蛋白在DEAE-Sepharose F.F層析圖譜Fig.3 Chromatography of the active substance on a DEAE-Sepharose F.F column at pH7.0 with linear gradient elution of NaCl(0～0.5 mol/L)

由表1中可得,粗蛋白液成分較復(fù)雜,比活力較低;經(jīng)超濾濃縮和硫酸銨沉淀后,對(duì)目的蛋白進(jìn)行了富集,其比活力達(dá)到29.4 U/mg;再通過陰離子交換層析進(jìn)行分離,采用線性梯度洗脫方式,比活力達(dá)到了61.6 U/mg,純化倍數(shù)為32.4。

表1 降膽固醇相關(guān)蛋白的分離純化結(jié)果

2.4 SDS-PAGE蛋白電泳分析

將純化過程中硫酸銨分級(jí)沉淀、兩次陰離子交換層析收集的樣品用分離膠濃度12%的SDS-PAGE分析,選擇低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為分子量標(biāo)準(zhǔn)(圖4)。電泳結(jié)果表明,經(jīng)過上述純化步驟后得到目的蛋白的單一條帶,達(dá)到電泳純,結(jié)合Marker分析,此蛋白的分子質(zhì)量約為60 ku。

圖4 分離純化各組分的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of samplesfrom different steps of purification注:M.Marker,1.硫酸銨分級(jí)沉淀,2.陰離子層析(0.5 mol/L NaCl洗脫),3. 峰Ⅱ-3,陰離子層析(0.1～0.5 mol/L NaCl梯度洗脫)。

2.5 目的蛋白的質(zhì)譜鑒定

對(duì)圖4泳道3中的蛋白條帶挖點(diǎn)后進(jìn)行酶切,然后將其進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜(MALDITOF/TOF)分析,并利用Mascot搜索引擎將數(shù)據(jù)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBInr)中檢索。利用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢索后得到Mascot Score圖(圖5)。結(jié)果表明,目的蛋白與檢索結(jié)果的匹配分?jǐn)?shù)達(dá)到108分,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其閾值分?jǐn)?shù)65分,說明兩者匹配上的概率是顯著的(p<0.05)。檢索結(jié)果顯示其分子量為60802,和樣品SDS-PAGE電泳顯示結(jié)果接近。肽段比對(duì)到的蛋白質(zhì)為:hypothetical protein[Lactobacillus reuteri],NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)No.gi|:489764699。氨基酸覆蓋率為12%(圖6),已用粗體標(biāo)明。目前對(duì)于該蛋白的研究還較少,通過保守結(jié)構(gòu)域分析,該蛋白含有由63個(gè)氨基酸組成的含有三段重復(fù)區(qū)域糖苷結(jié)合位點(diǎn),其中短的重組區(qū)域可能與膽堿的結(jié)合有關(guān)。

圖5 目的水解后肽段的序列檢索Mascot score圖Fig.5 Mascot score histogram of peptides from the digestion of the target protein searching in the database

圖6 質(zhì)譜分析中與比對(duì)蛋白匹配的肽段序列Fig.6 Matched peptides identified by mass spectrometry with the target protein

與降膽固醇有關(guān)的蛋白主要包括膽鹽水解酶和膽固醇氧化酶。自從發(fā)現(xiàn)乳酸菌在腸道中可使結(jié)合膽鹽分解為游離膽鹽以來,膽鹽水解酶被認(rèn)為在乳酸菌移除膽固醇方面起著關(guān)鍵作用。膽鹽水解酶將結(jié)合膽鹽水解為游離膽鹽后,游離膽鹽需要在酸性條件下(pH<6.0)才能和膽固醇發(fā)生共沉淀作用,從而起到移除膽固醇的能力[16]。通過前面的研究已經(jīng)表明,CFS中除了膽鹽水解酶以外還含有可移除膽固醇的有效成分[11]。另一和膽固醇降解代謝相關(guān)的酶是膽固醇氧化酶,它在氧氣的參與下,可將膽固醇轉(zhuǎn)化成膽甾-4-烯-3-酮。然而,目前還未有乳酸菌產(chǎn)膽固醇氧化酶的報(bào)道[17]。除此以外,于平[18]等人也發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生了特殊的酶系,從而將膽固醇降解成其他物質(zhì),導(dǎo)致其含量降低,然而具體酶的種類并未說明。韓國(guó)Kim等在嗜酸乳桿菌ATCC43121的CFS中也發(fā)現(xiàn)了與降低膽固醇有關(guān)的蛋白,其分子量為12 ku[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)的與降膽固醇有關(guān)的蛋白為一假設(shè)蛋白,其功能尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

羅伊氏乳桿菌DSM122460的CFS通過超濾裝置得到濃縮液,硫酸銨分級(jí)沉淀的飽和度范圍為50%～70%,膽固醇移除能力最高;樣品采用DEAE Sepharose F.F陰離子交換層析進(jìn)一步分離純化,當(dāng)pH為7.0,采用含0.1～0.5 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫時(shí),分離效果較好,得到了電泳純的目的蛋白,純化倍數(shù)為32.4;經(jīng)SDS-PAGE分析,其分子量約為60 ku,通過質(zhì)譜鑒定初步認(rèn)定該活性蛋白為一假設(shè)蛋白,其功能尚待進(jìn)一步研究。

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Isolation,purification and identification of protein with cholesterol- reducing activity from the supernatant ofLactobacillusreuteri

CHEN Chen1,*,YU Rui-li2

(1.School of Perfume and Aroma Technology,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China; 2.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The cell-free supernatant(CFS)ofLactobacillusreuteriDSM122460 exhibited the cholesterol removal ability and the effective components were predicted as proteins. The active component was purified by ultrafiltration,ammonium sulfate precipitation,and DEAE-Sepharose F.F anion exchange chromatography. The specific activity of purified component was 61.6 U/mg with a purification factor of 32.4. The purified protein was electrophoresis pure determined by SDS-PAGE,and the estimated molecular weight was about 60 ku. The active protein was identified as a hypothetical protein by mass spectrometry and its function remains to be further studied.

Lactobacillusreuteri;cell-free supernatant(CFS);cholesterol reduction;purification;hypothetical protein

2016-05-24

陳臣(1982-)，男，博士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：chenchen@sit.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31501451)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)22-0200-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.031