德氏乳桿菌吸附鉛離子的機(jī)制研究

于上富,靳 妲,丁秀云,竇明理,霍貴成,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030;2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院,四川成都 611731)

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德氏乳桿菌吸附鉛離子的機(jī)制研究

于上富1,靳 妲1,丁秀云1,竇明理2,霍貴成1,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030;2.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院,四川成都 611731)

該研究以具有較高去除鉛離子能力的德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)KLDS1.0207為研究對象,利用熱力學(xué)模型及動力學(xué)模型對LactobacillusdelbrueckiiKLDS1.0207結(jié)合鉛離子的過程進(jìn)行模擬分析,同時結(jié)合掃描電鏡-能譜及傅里葉紅外光譜對其結(jié)合鉛離子的狀態(tài)進(jìn)行分析,最后得出,Langmuir-Freundlich模型比Langmuir模型和Freundlich模型更適合其結(jié)合鉛離子的過程,R2達(dá)0.9820,準(zhǔn)二級動力學(xué)模型的R2為0.9916,比準(zhǔn)一級動力學(xué)模型更適合,說明該菌與鉛的作用的機(jī)制為化學(xué)吸附,而不是物理吸附。由掃描電鏡和能譜分析可以看出菌體表面不完全分布著鉛的顆粒,推斷出參與吸附過程中其主要作用的是含C、O的基團(tuán)和傅里葉紅外光譜，可以推測出參與鉛離子結(jié)合的基團(tuán)有羧基、氨基、酰胺基、羥基，推測菌與鉛的作用機(jī)制可能為化學(xué)吸附、離子交換、化學(xué)沉淀等的共同作用的結(jié)果。

乳酸菌,熱力學(xué)模型,動力學(xué)模型,鉛離子

近年來,重金屬污染問題日益嚴(yán)重。許多金屬加工廠、礦井、電池廠、化工廠、染料廠等向環(huán)境中排出一定量的重金屬,以及汽車尾氣、燃煤向空氣中排放,同時我國絕大數(shù)城市存在著水污染的問題,未經(jīng)處理的城市垃圾、工業(yè)廢水和生活污水以及大氣污染物不斷沉降到水體中,使水中重金屬含量升高。在我國,每年釋放到環(huán)境中鉛的量約為3.5萬噸[1]。2004年太湖底泥中銅、鉛、鎘的含量均處于輕度污染水平。黃浦江干流表層沉積物中鎘含量超標(biāo)2倍,鉛含量超1倍、汞含量明顯增加。重金屬進(jìn)入環(huán)境后,可能被植物或者水生動物吸收,通過食物鏈富集,進(jìn)而損害人體健康[2]。20世紀(jì)40年代,美國人均攝入的鉛含量大約在400～500 μg/d,由于認(rèn)識到鉛的毒性,經(jīng)過不斷改進(jìn),現(xiàn)在下降為不大于20 μg/d。美國環(huán)境保護(hù)組織限定飲用水中鉛含量<0.015 mg/L,污水處理后鉛含量<0.1 mg/L。常見的處理重金屬的方法有反向滲透、離子交換、化學(xué)沉淀、生物吸附四大類[3]。生物吸附有投資小、環(huán)境破壞小、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),對于低濃度的重金屬污染處理有較好適用性。研究表明許多微生物能去除重金屬,如屎腸球菌[4]、鼠李糖乳桿菌[5]、植物乳桿菌[6-8],枯草芽孢桿菌[9]、釀酒酵母[10]、假單胞桿菌[11]等。研究結(jié)果表明乳酸菌確實(shí)能在體外吸附重金屬,且這種吸附能力具有菌株特異性,其中乳酸菌的應(yīng)用已有很長歷史,其許多益生功能,如降膽固醇、抗癌、治療結(jié)腸癌、提高免疫力、預(yù)防心血管疾病等也已經(jīng)被證實(shí)。乳酸菌體外可以去除重金屬,體內(nèi)具有益生功能,可以將乳酸菌應(yīng)用于暴露于重金屬下動物的研究。但是,對于乳酸菌吸附重金屬的機(jī)理目前沒有統(tǒng)一定論,大致有四個理論,離子交換、物理沉降、基團(tuán)吸附、膜滲透。

本研究對實(shí)驗(yàn)室篩選的具有高去除鉛離子能力的德式乳桿菌進(jìn)行吸附模型的研究,旨在揭示德氏乳桿菌與重金屬離子的結(jié)合機(jī)理,為以后篩選及改良乳桿菌螯合重金屬提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)KLDS1.0207 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心提供;酵母粉 XOID公司;蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、氫氧化鈉 奧博星生物技術(shù)公司;硝酸、硝酸鉛 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鉛標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純) 德國默克集團(tuán)有限公司。

900H原子吸收光譜儀 美國PERKINELMER公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;HVE-50滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司;S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;能譜QuantaFEG250 美國康塔公司;紅外儀器型號TENSOR27spectrometer 德國布魯克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌的培養(yǎng) 將保存于凍存管中的菌液按2%的比例接種于液體MRS培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h重復(fù)兩代以提高菌株的活性。

1.2.2 菌體的收集 按照文獻(xiàn)[12]中的方法收集菌體。

1.2.3 金屬溶液制備 稱取不同量的硝酸鉛溶于超純水中配制為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L濃度的鉛離子溶液,用滅菌的0.5 mol/L的HNO3和NaOH將其pH調(diào)為6。

1.2.4 吸附實(shí)驗(yàn) 將收集到的菌體分別置于1.2.3中的不同鉛離子濃度溶液中,使菌體濃度達(dá)到4 g/L(濕菌體重),37 ℃條件下振蕩孵育4 h直至吸附平衡,隨后8000×g離心10 min,取上清液用原子吸收測量鉛離子濃度,菌體對鉛離子的吸附量按下述公式計(jì)算:

其中,Co為初始鉛離子濃度,Ce為平衡液中鉛離子濃度,V鉛離子溶液的體積,m濕菌體的質(zhì)量,V/m=4 L/g。

1.2.5 動力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)得到的乳酸菌,8000×g離心10 min,用滅菌的超純水清洗兩次,同樣條件下離心,將菌體置于14個同樣體積的50 mg/L鉛離子溶液中,使菌體濃度達(dá)到4 g/L(濕菌體重),37 ℃條件下振蕩孵育,分別在5、10、15、20、25、30、40、50、60、90、120、150、180、240 min[12]時間點(diǎn),取樣品進(jìn)行8000×g離心10 min,測定上清的鉛離子濃度。菌體對鉛離子的吸附量按下述公式計(jì)算:

其中,Ct為t時間后溶液中鉛離子濃度,其他同1.2.4。

1.2.6 掃描電鏡觀察 取不含鉛離子溶液的菌體和含50 mg/L鉛離子吸附后的菌體,于8000×g條件下離心20 min,再用滅菌的超純水沖洗三次后,同上條件離心,隨后立即倒入戊二醛固定1.5 h,用磷酸緩沖液沖洗3次,然后置于6000×g條件下離心10 min,再分別用不同濃度(50%、70%、90%、100%)的乙醇脫水一次,后6000×g條件下離心10 min,再用乙醇和叔丁醇混合液(1∶1)以及純叔丁醇洗脫一次,后6000×g條件下離心10 min,將菌體放入-20 ℃下冷凍30 min,放入冷凍干燥儀中干燥4 h,最后用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍一層厚100～150 A的金屬膜,放入觀察室進(jìn)行觀察。

1.2.7 傅里葉紅外光譜測定 不含鉛離子溶液的菌體和含50 mg/L鉛離子吸附后的菌體,于8000×g條件下離心20 min,超純水沖洗三次后,同樣條件離心,置于70 ℃條件下的烘箱中,烘干至恒重,取干燥的細(xì)胞于研缽中與KBr粉末1∶5比例混合研磨,隨后壓片觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用“平均值+標(biāo)準(zhǔn)差”表示,利用SPSS 19.0和Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱力學(xué)分析

2.1.1 Langmuir模型分析 該模型假設(shè)吸附劑表面的吸附位點(diǎn)是均勻的,金屬吸附于表面單分子層,每個吸附位點(diǎn)對應(yīng)一個金屬離子,是以化學(xué)吸附為主的,吸附和解吸是動態(tài)平衡[14]。Langmuir模型的公式[15]如下:

式中,qe為平衡時菌體吸附的量,qm為最大的吸附量,Ce為平衡是溶液中鉛離子濃度,b(L/mg)為吸附系數(shù),表示吸附的強(qiáng)度,其值的大小與吸附質(zhì)的本性和溫度有關(guān),值越大則吸附能力越強(qiáng)。

表1 Langmuir和Freundlich模型的吸附參數(shù)

模擬的結(jié)果見圖1,qmax為11.47 mg/g,b為0.2314,R2為0.9779,且擬合結(jié)果11.47 mg/g和實(shí)際值10.60 mg/g相差不大。

2.1.2 Freundlich模型分析 該模型假設(shè)的是吸附發(fā)生在非均勻介質(zhì)表面,Freundlich模型公式[16]如下:

其中,qe為平衡時菌體吸附的量,Ce為平衡時溶液中鉛離子濃度,k為吸附平衡常數(shù),其值的大小表示濃度對吸附量影響的強(qiáng)弱,越小表示吸附性能越好。

擬合結(jié)果見圖2,k為3.9836,n為3.8658,R2為0.8574。表1詳細(xì)羅列了其他幾種微生物吸附金屬離子的模擬參數(shù)及其最大吸附量?？梢钥闯霰狙芯康腖angmuir模擬的擬合相關(guān)系數(shù)是比較好的。

圖2 德氏乳桿菌KLDS1.0207吸附鉛離子的Freundlich模型分析Fig.2 Freundlich isotherm model study on Pb2+ biosorption by Lactobacillus delbrueckii KLDS1.0207

2.1.3 Langmuir-Freundlich模型分析 Langmuir-Freundlich公式[23]如下:

式中,qe為平衡時菌體吸附的量,k(L/g)為吸附平衡常數(shù),b為一個不均勻的參數(shù)。

該模型的結(jié)果見圖3,k為1.9337,a為0.1778,b為1.250,R2為0.9820,b代表菌體吸附不均勻的參數(shù),若理想下表面均勻吸附時,b為1；大于1,代表菌體吸附不均勻[24],吸附過程可能涉及物理吸附和離子交換過程。

圖3 德氏乳桿菌KLDS1.0207吸附鉛離子的Langmuir-Freundlich模型分析Fig.3 Langmuir-Freundlich isotherm model study on Pb2+ biosorption by Lactobacillus delbrueckii KLDS1.0207

2.2 動力學(xué)模型分析

2.2.1 吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同時間下的吸附量見表2。

2.2.2 準(zhǔn)一級動力學(xué)模型分析 準(zhǔn)一級動力學(xué)模型的公式[25-26]如下:

式中,qt為t時刻是菌體吸附金屬的量,將其變形為線性形式如下:

一般情況下該模型適合吸附過程的前30～50 min,而不適合整個吸附過程[25],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4顯示,前14 min的擬合相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9666,同樣說明在前期短時間內(nèi),鉛離子快速吸附在細(xì)胞表面,但隨時間的延長,發(fā)生的不僅有物理吸附,可能還存在鉛離子往細(xì)胞內(nèi)部遷移、化學(xué)沉淀等現(xiàn)象。

圖4 準(zhǔn)一動力學(xué)模型線性分析Fig.4 Study of pseudo first-order reaction model

2.2.3 準(zhǔn)二級動力學(xué)模型分析 準(zhǔn)二級動力學(xué)模型[27]的線性公式為:

將其形式變?yōu)榫€性形式如下

以t/qt為縱坐標(biāo),以t為橫坐標(biāo)做線性擬合,可以求出k2。該模型是假設(shè)化學(xué)吸附的過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5如下,得出R2為0.9916,說明菌體吸附鉛離子的過程不是單純的物理吸附,存在其他的離子交換、化學(xué)沉淀等現(xiàn)象。

圖5 準(zhǔn)二級動力學(xué)模型線性分析Fig.5 Study of pseudo second-order reaction model

2.3 菌體結(jié)合鉛離子的掃描電鏡觀察

從掃描電鏡圖6可以看出,空白組菌體表面無亮點(diǎn),表面光滑,鉛吸附組是表面多亮點(diǎn),不規(guī)則的分散在細(xì)胞表面,并沒有全部覆蓋,推測是鉛形成的顆粒,經(jīng)過EDS能譜分析圖7及表3的定量分析,可以得出亮點(diǎn)確實(shí)為含鉛的顆粒,主要組成為C、O、K、Pb,說明鉛主要與菌體細(xì)胞表面的含C、O鍵的物質(zhì)結(jié)合。

圖6 德氏乳桿菌KLDS1.0207吸附鉛離子的掃描電鏡觀察(5000×)Fig.6 Scanning electron micrographs of Lactobacillus delbrueckii KLDS1.0207(5000×)注:a為空白對照組;b為50 mg/L鉛吸附組。

圖7 德氏乳桿菌KLDS1.0207吸附鉛的能譜分析Fig.7 EDS analysis of Lactobacillus delbrueckii KLDS1.0207注:對圖6中的菌體表面的亮點(diǎn)進(jìn)行元素分析。

元素元素濃度強(qiáng)度校正重量百分比重量百分比Sigma原子百分比CK2731241966222048543OK0270613713391551297AuM049077351895166149PbM00307036145113011總量10000

2.4 紅外光譜分析

微生物的紅外光譜通常因?yàn)榧?xì)胞壁成分的不同而主要分為以下5個區(qū)域。3000～2800 cm-1:細(xì)胞膜的脂肪酸;1800～1500 cm-1:蛋白質(zhì)和多肽的酰胺;1500～1200 cm-1:蛋白質(zhì)和脂肪酸;1200～900 cm-1:細(xì)胞壁中的多糖;900～500 cm-1為未知的特殊官能團(tuán)區(qū)域[28]。

由圖8可看出,大部分活性基團(tuán)的吸收強(qiáng)度增大,表明菌體對鉛的積累能力增強(qiáng),主要有以下峰值:3500～3200 cm-1有寬的吸收峰處,強(qiáng)度增強(qiáng),可能為酰胺N-H的伸縮振動,醇酚類分子間OH鍵的伸縮的振動;3000～2500 cm-1處羧酸的OH伸縮振動;1720～1700 cm-1羧酸的C=O的吸收1650 cm-1和1550 cm-1分別為蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶的C-O的伸展振動和酰胺Ⅱ帶中N-H彎曲振動和 C-H伸展振動的疊加1465～1440 cm-1肽鏈中C-H的彎曲振動;1400～1410 cm-1為酰胺Ⅱ帶的-CN伸縮振動和-NH的面彎曲振動,也可能為肽鏈末端羧基-C=O的對稱伸縮振動;1250～1200 cm-1為脂4類和多糖P=O的伸縮振動峰,也可能為C-O與O-H的疊加吸收峰,或羧酸的C-O的伸縮振動,處理后消失,推測參與吸附鉛;1200～1150 cm-1多聚糖中的C-O的伸縮振動,吸附后消失,推測參與了吸附過程。

圖8 德氏乳桿菌KLDS1.0207的傅里葉紅外光譜圖Fig.8 FTIR spectra of Lactobacillus delbrueckii KLDS1.0207注:a為空白組,b為與鉛離子作用后的圖。

這些組成中可與金屬離子相結(jié)合的主要官能團(tuán)有羧基、磷?；⒘u基、氨基和酰胺基等,其中氮、氧、磷、硫作為配位原子與金屬離子配位絡(luò)合。從紅外光譜分析可以推測乳酸菌與鉛結(jié)合的機(jī)制包括絡(luò)合反應(yīng)、離子交換、物理吸附(靜電引力),作用官能團(tuán)包括羥基、羧基、磷酸基、酰胺基、烴基,作用大分子生物包括脂肪酸、多糖、S層蛋白、磷壁酸等。該推測結(jié)果和Naik、金羽、Ren等提出的鉛離子可以羧基、羥基、酰胺基等相互作用結(jié)論[22,29-30]一致。

3 結(jié)論

乳酸菌有許多功能特性,廣泛應(yīng)用在食品中,乳酸菌去除重金屬特性也受到越來越多學(xué)者的研究,本實(shí)驗(yàn)對篩選的較高去除鉛離子能力的LactobacillusdelbrueckiiKLDS1.0207進(jìn)行研究,掃描電鏡結(jié)果顯示,該鉛離子濃度下菌體狀態(tài)沒有出現(xiàn)裂解,表面完整,與空白組相比沒有明顯的不同,對菌表面的結(jié)晶進(jìn)行能譜分析顯示主要含C、O的基團(tuán)參與鉛的結(jié)合。通過熱力學(xué)模型和動力學(xué)模型模擬菌體吸附鉛離子的實(shí)驗(yàn),可以得出Langmuir-Freundlich模型比Langmuir模型和Freundlich模型更適合乳酸菌吸附鉛離子,準(zhǔn)二級動力學(xué)模型能較好的模擬該吸附過程,結(jié)合掃描電鏡及紅外光譜分析可以得出,乳酸菌結(jié)合鉛離子不僅僅是單純物理吸附,可能還涉及離子交換、化學(xué)吸附、化學(xué)沉淀等。

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Study on the mechanism of adsorption of lead ions biosorption by lactic acid bacteria

YU Shang-fu1,JIN Da1,DING Xiu-yun1,DOU Ming-li2,HUO Gui-cheng1,*

(1.Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education,College of Food Science, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.Sichuan Institute for Food and Drug Control,Chengdu 611731,China)

Using the lactic acid bacteria KLDS1.0207 with good sequestering Pb2+as the research object,the thermodynamic model and kinetic model were served to analysis the process of lactic acid bacteria KLDS1.0207 binding lead ion,at the same time combined with scanning electron microscopy-energy spectrum and Fourier infrared spectrum analysis of the combination of lead ion state. Finally the result concluded that the adsorption equilibrium data fitting showed the Langmuir Freundlich model(R2=0.9820)was more suitable for the process of the combination of lead ions aganist the Langmuir model and Freundlich model. Pseudo second order model(R2=0.9916)had dominance in comparison to pseudo first order,indicating that the mechanism of action of the bacteria and lead to chemical adsorption,rather than physical adsorption.By the SEM and EDS analysis could be seen in the cell surface was not completely distributed lead particles,inferred involved in the adsorption process and its main role was to contain C,O group. Through the SEM-EDS and FTIR spectra,could be inferred the function groups like carboxyl,amino,amide,hydroxyl were taken part in the process of lactic acid bacteria binding the lead ions. The mechanism might include chemical adsorption,ion exchange,chemical precipitation,etc.

lactic acid bacteria;thermodynamic model;kinetic model;Pb2+

2016-05-27

于上富(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：yushangf@163.com。

*通訊作者:霍貴成(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：gchuo58@126.com。

國家自然科學(xué)基金(31401512)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2011AA100902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)22-0116-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.015