鹽脅迫下苗期栽培大豆生理響應(yīng)及Na+動態(tài)平衡關(guān)鍵基因的表達

寧麗華，張大勇，劉 佳，何曉蘭，萬 群，徐照龍，黃益洪，邵宏波

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點實驗室，南京210014）

鹽脅迫下苗期栽培大豆生理響應(yīng)及Na+動態(tài)平衡關(guān)鍵基因的表達

寧麗華，張大勇，劉 佳，何曉蘭，萬 群，徐照龍，黃益洪，邵宏波

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點實驗室，南京210014）

【目的】研究耐鹽栽培大豆和鹽敏感栽培大豆對鹽脅迫的響應(yīng)，特別是鹽脅迫對大豆幼苗光合特性、離子含量及 Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因表達的影響，通過比較鹽脅迫下不同大豆品種的響應(yīng)差異，揭示不同基因型大豆耐鹽機制，為大豆栽培管理、耐鹽品種的選育及人工調(diào)控提供理論參考?！痉椒ā恳阅望}栽培大豆（Y8D6008、Y8D6013）和鹽敏感栽培大豆（Y8D6132、Y8D6136）為材料，選取長勢一致的大豆幼苗于1/2 × Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，待第一片復(fù)葉完全展開時，營養(yǎng)液中加入NaCl，每天遞增50 mmol·L-1到達處理濃度150 mmol·L-1，處理持續(xù)7 d。以不加NaCl的1/2 × Hoagland營養(yǎng)液作為對照，研究鹽脅迫下大豆幼苗的光合特性、離子含量及Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因表達變化。【結(jié)果】150 mmol·L-1NaCl不同程度地抑制了4種大豆幼苗生長，同時顯著降低SPAD值、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，但是NaCl脅迫對鹽敏感大豆影響程度顯著高于耐鹽品種；鹽脅迫顯著降低耐鹽大豆的胞間CO2濃度，而鹽敏感大豆與之相反，說明150 mmol·L-1NaCl處理下氣孔限制是引起耐鹽品種光合速率下降主要因素，而鹽敏感品種光合速率下降主要因素是非氣孔限制。對大豆植株的不同離子含量進行測定，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下4種大豆葉片中Na+積累均顯著升高，鹽敏感品種上升幅度顯著高于耐鹽品種，而K+含量與Na+含量的變化規(guī)律相反。鹽敏感大豆葉片中磷含量（P）均受鹽脅迫顯著下降，而耐鹽大豆葉片P在脅迫后略有增加。相關(guān)分析表明凈光合速率變化幅度與葉片中Na+、K+和P含量變化幅度存在顯著的相關(guān)性。對6個參與大豆植株體內(nèi)Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因GmSOS1、GmNcl1、GmSALT3、GmNHX1（離子通道基因）、GmCIPK1（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因）和GmAVP1（能量運輸相關(guān)基因）相對表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫后4種大豆的GmNcl1表達量均顯著上調(diào)，鹽敏感品種上調(diào)倍數(shù)高于耐鹽大豆品種，這種表達變化與大豆的耐鹽性具有一定的關(guān)聯(lián)性，而其他5個基因表達量與大豆的耐鹽性沒有明顯的關(guān)聯(lián)性?！窘Y(jié)論】與鹽敏感大豆相比，耐鹽大豆在鹽脅迫環(huán)境條件下減少Na+在葉片中的積累，保持相對較高的K+和P含量，并維持相對較高的光合速率，這是耐鹽大豆比鹽敏感大豆具有較強耐鹽特性的因素之一，另外Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因GmNcl1可能與大豆耐鹽特性有一定關(guān)聯(lián)性。

栽培大豆；鹽脅迫；光合特性；離子含量；基因表達；Na+動態(tài)平衡

0 引言

【研究意義】中國鹽漬化土壤分布廣泛，總面積高達兩億畝。由于環(huán)境惡化和不合理耕作等原因，鹽漬化土壤面積仍不斷增加。近年來，由于糧食壓力的增大和可用耕地面積的持續(xù)減少，鹽漬化土壤成為中國耕地的重要后備土地資源。但是土壤鹽漬化嚴(yán)重影響作物生長進程和產(chǎn)量水平，大大限制了鹽漬化土壤的快速改良和有效利用[1]。大豆是重要的糧食作物和油料作物，中國大豆五大主產(chǎn)區(qū)均存在不同程度的土壤鹽漬化問題。大豆屬于中度耐鹽作物，但是鹽害脅迫下大豆產(chǎn)量受到很大影響[2]。中國蘊藏著大量的大豆種質(zhì)資源以及豐富的優(yōu)異等位變異[3]，利用傳統(tǒng)育種或現(xiàn)代分子育種手段選育新的耐鹽大豆品種可以實現(xiàn)大豆在鹽堿地上規(guī)?；N植。因此，研究鹽脅迫下大豆生理變化，對于理解大豆的耐鹽機制、鑒定耐鹽種質(zhì)資源、促進鹽漬土地的有效利用和實現(xiàn)大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要的理論意義和實踐價值?！厩叭搜芯窟M展】前人研究發(fā)現(xiàn)植物吸收運輸 Na+的過程是將 Na+從介質(zhì)通過根部細胞質(zhì)膜上的離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白進入根系，然后將Na+從中柱細胞中泵入木質(zhì)部，再從木質(zhì)部運輸?shù)降厣喜拷M織[4]。植物地上部為代謝活躍部位，對Na+含量敏感，其耐鹽特性體現(xiàn)在有效保持地上部活躍部位較低的Na+水平。植物既能從細胞水平還能從整株水平上進行調(diào)控Na+含量，減少向地上部的運輸。NHX1是一種位于液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，能夠?qū)⒓毎|(zhì)中過量的Na+存儲液泡中，將擬南芥 AtNHX1進行同源或異源過表達后均能提高植物的耐鹽性[5-6]。AtSOS1是根部表皮細胞質(zhì)膜上的一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，參與細胞中Na+外排[7]。大豆GmNcl1與擬南芥CHXs家族基因親緣關(guān)系很近，鹽脅迫下該基因誘導(dǎo)表達上調(diào)[8]。AtCHX21是在根部內(nèi)皮層的陽離子/H+轉(zhuǎn)運蛋白，能夠?qū)?Na+從內(nèi)皮層細胞運輸?shù)礁档闹兄?，最終將Na+加載到木質(zhì)部[9]。圖位克隆的大豆GmSALT3編碼一種定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的陽離子/H+轉(zhuǎn)運蛋白，主要在根部中柱細胞中表達，在控制 Na+向地上部運輸中發(fā)揮重要作用[10-11]。過量的Na+進入植株體內(nèi)造成原生鹽離子毒害和滲透脅迫以及鹽離子導(dǎo)致的營養(yǎng)虧缺的次生鹽害。光合作用是植物進行生命活動的能量源泉，在眾多被鹽脅迫影響的代謝中，光合作用被認(rèn)為是對鹽逆境脅迫最為敏感的生理過程。有研究表明鹽離子過量積累導(dǎo)致植株葉片的光合機構(gòu)受損導(dǎo)致光合速率下降[12]。而Na+過量造成其他營養(yǎng)元素虧缺同樣也會對光合作用產(chǎn)生影響[13]。對高粱的研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽高粱在鹽脅迫下能有效保護葉片光合機構(gòu)維持較高的光合速率，增強對鹽脅迫的適應(yīng)性[14]。【本研究切入點】前人對大豆鹽脅迫的響應(yīng)及耐鹽機制的研究多以野生大豆為對象，其中薛忠財?shù)萚15]發(fā)現(xiàn)野生大豆能夠通過某種機制控制葉片中 Na+過量積累來維持葉片的正常光合作用從而達到耐鹽的目的。目前關(guān)于耐鹽栽培大豆和鹽敏感栽培大豆對鹽脅迫生理及分子響應(yīng)機制的差異研究較少，尤其是鹽脅迫下光合特性與離子組分以及相互作用機制的差異仍不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選取2個耐鹽栽培大豆（Y8D6008、Y8D6013）和 2個鹽敏感栽培大豆（Y8D6132、Y8D6136）為試驗材料，利用水培方式從離子含量、光合參數(shù)以及Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因表達變化入手，旨在了解耐鹽栽培大豆的抗鹽生理及分子機制，揭示Na+與其他離子及光合相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系，為大豆耐鹽機制的研究、耐鹽品種的選育提供有力的理論依據(jù)，也為鹽漬化土地的有效開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用耐鹽材料Y8D6008和Y8D6013及鹽敏感材料Y8D6132和Y8D6136為供試材料，均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)喻德躍教授贈予（表1）。4個大豆材料是從191份栽培大豆經(jīng)NaCl脅迫后篩選鑒定而出。

表1 大豆材料的名稱、地理來源、類型及耐鹽特性Table 1 Name, geographical origin, type, and salt tolerance characteristic of four cultivars

1.2 試驗設(shè)計

每個材料分別選取大小一致、籽粒飽滿、種皮完整的種子，消毒催芽后播種于裝滿蛭石的花盆中，將萌發(fā)一周的大豆材料轉(zhuǎn)移到含有 1/2×Hoagland營養(yǎng)液的水培箱，待大豆幼苗生長到第一片復(fù)葉完全展開時，選取長勢相同的大豆幼苗分為兩組，分別放在含有不同濃度NaCl的1/2×Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)。一組以不加鹽的 1/2×Hoagland營養(yǎng)液作為對照；另一組進行NaCl處理，參照HAMWIEH等[16]方法略有改動，即，將幼苗放在含有 50 mmol·L-1NaCl 1/2× Hoagland營養(yǎng)液中處理一天，接著再用100 mmol·L-1NaCl處理一天，最后將鹽濃度提高到150 mmol·L-1進行處理一周，對兩組大豆幼苗進行調(diào)查取樣用于下一步試驗。以上試驗均在光照、溫度與濕度可控的溫室內(nèi)開展試驗，試驗條件為光照時間16 h，光強約600 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度 28℃/18℃，相對濕度 65%—85%。本文所提到的性狀相對值為脅迫環(huán)境下某性狀表型值與對照環(huán)境下某性狀表型值的比率，計算公式為：某性狀相對值=某一性狀鹽脅迫時表型值/對照環(huán)境表型值[17]。

1.3 SPAD與光合氣體交換參數(shù)的測定

NaCl處理7 d后，用葉綠素含量測定儀（SPAD-502，日本）測定每個材料功能葉片的 SPAD值，每個葉片測定6次，每個材料測定5株，取平均值。用CIRAS-2型便攜式光合儀測定每個材料的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸騰速率（transpiration rate，E）。同樣選取每個材料的功能葉片進行測定，每個材料每個處理重復(fù)5次。測定時的光強、CO2濃度均由測定儀器進行自動控制。

1.4 生物量及離子含量測定

每個材料每個處理選取3株大豆幼苗，用蒸餾水沖洗5次，將大豆幼苗分為根、莖和葉片三部分后，在105℃烘箱中殺青30 min，于75℃烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取3個組織的干重。將根系的重量作為地下部生物量，將葉片與莖的重量總和作為地上部生物量（shoot dry weight， SDW）。然后分別稱取葉片和根系約 0.1 g粉末干樣，轉(zhuǎn)移至消化管中，加入 8 mL ddH2O和 2 mL HNO3，然后使用微波消解系統(tǒng)（Milestone Ethos）消煮20 min，冷卻至室溫后，用ddH2O定容至25 mL。利用感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Perkin Elmer Optima 2100DV ICP-OES system）測定每個樣品的離子含量。以不加樣品的空白樣為對照，每組處理3個重復(fù)。

1.5 實時熒光定量PCR分析

大豆幼苗在150 mmol·L-1NaCl處理一周后，分別取每個大豆品種的根系凍存于-80℃用于提取 RNA。依照Promega RNA提取試劑說明書提取總RNA，參照 PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa公司）試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA。參與大豆植株體內(nèi)Na+動態(tài)平衡的相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量PCR引物見表2，并以大豆組成型表達的ActinII作為內(nèi)參基因，引物序列為F：5′-ATCTTGACTGAGCGTGGTT ATTCC-3′，R：5′-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3′。利用ROCHE LightCycler? 96實時熒光定量PCR儀，按照TaKaRa試劑盒SYBR Premix ExtaqTM說明設(shè)定反應(yīng)體系，擴增條件為95℃ 5 min；95℃ 15 s，58℃1 min，45個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，并使用Excel進行作圖。

表2 Na+動態(tài)平衡關(guān)鍵基因的實時熒光定量PCR引物Table 2 Gene-specific primers of key components involved in Na+homeostasis used in RT-PCR analysis

2 結(jié)果

2.1 NaCl脅迫下不同大豆品種的表型差異比較

與對照相比，經(jīng)過150 mmol·L-1NaCl處理一周后，4個大豆材料均出現(xiàn)鹽害脅迫癥狀，生長受到明顯抑制（圖1）。由圖2可以看出150 mmol·L-1NaCl處理7 d后，除Y8D6013的地上部外，其余大豆品種地上部生物量均顯著降低（P＜0.05），且Y8D6136的地上部干重降低幅度最高（67.75%）。2個鹽敏感大豆的地上部干重減少幅度均高于 2個耐鹽材料；并且150 mmol·L-1NaCl處理下，4個材料根系的干重也均顯著降低（圖2）。由此可見，150 mmol·L-1NaCl脅迫顯著抑制大豆幼苗生物量積累。鹽脅迫下不同材料根冠比值也發(fā)生顯著變化，耐鹽大豆的根冠比顯著降低，而鹽敏感材料的根冠比顯著上升，說明鹽脅迫改變大豆生物量的分配格局，鹽敏感大豆將地上部的干物質(zhì)更多的運輸?shù)降叵虏浚▓D2）。由此可見鹽敏感大豆幼苗受到鹽脅迫傷害的程度更嚴(yán)重。

2.2 NaCl脅迫下Na+離子含量及Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因的表達

圖1 不同大豆品種在NaCl處理一周后的植物表型特征Fig.1 Phenotypes of soybean varieties under NaCl after seven days treatment

圖2 NaCl脅迫對大豆生物量積累和根冠比值的影響Fig.2 Effect of NaCl on biomass accumulation and the root shoot ratio of soybean seedlings

2.2.1 Na+含量變化 經(jīng)鹽脅迫處理后，大豆植株葉片中Na+含量急劇增加，Y8D6008、Y8D6013、Y8D6132和Y8D6136的葉片中Na+含量分別為對照葉片Na+含量的47.53、51.17、200.63和129.37倍。通過不同品種之間的比較，發(fā)現(xiàn)Y8D6132和Y8D6136的葉片Na+含量顯著高于Y8D6008和Y8D6013葉片的Na+含量。對大豆根系中Na+含量分析發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下4種材料的根系 Na+含量均顯著增加，但耐鹽大豆與鹽敏感材料的根系Na+含量之間并沒有顯著差異（圖3）。對4種材料的相對 Na+含量比較發(fā)現(xiàn)，耐鹽材料根系 Na+含量的增加倍數(shù)均高于鹽敏感材料，而葉片 Na+含量變化規(guī)律相反。不同組織的 Na+比較發(fā)現(xiàn)鹽敏感材料葉片中的Na+含量均顯著高于根系Na+含量。

圖3 NaCl脅迫對大豆幼苗葉片及根系中Na+的影響Fig. 3 Effects of 150 mmol·L-1NaCl concentrations on Na+content in leaf and root of four soybean varieties seedlings

2.2.2 參與 Na+動態(tài)平衡的相關(guān)基因表達變化 挑選 6個參與大豆植株體內(nèi) Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因，根據(jù)所編碼蛋白的功能將這6個基因分為離子轉(zhuǎn)運蛋白基因（GmSOS1、GmNcl1、GmSALT3和GmNHX1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因（GmCIPK1）及與 Na+轉(zhuǎn)運能量相關(guān)的基因（GmAVP1），通過定量表達分析，發(fā)現(xiàn)不論在對照環(huán)境還是鹽脅迫條件下4種大豆材料的GmSALT3表達量較低。鹽脅迫后，GmSALT3在Y8D6013中表達量上調(diào)，而在其他3種材料中表達量顯著下調(diào)。NaCl處理后，GmNcl1在4種大豆品種中的表達量均顯著上調(diào)，但在 Y8D6008和Y8D6013中上調(diào)幅度較小，而在 Y8D6132和Y8D6136中的表達量分別上調(diào)了15.64和11.02倍（圖4）。4個材料的GmSOS1均受鹽脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)，但是在不同材料中的上調(diào)幅度基本一致。GmNHX1在鹽脅迫處理下表達量微弱上調(diào)，而GmAVP1和 GmCIPK1在不同材料中表現(xiàn)出各不相同的表達模式（圖4）。

2.3 NaCl脅迫下不同大豆品種K+、Ca2+和磷含量（P）

由圖5-A可以看出，在鹽脅迫處理后，4種大豆品種的 K+含量與 Na+變化的規(guī)律相反，不論葉片還是根系K+均顯著下降。其中，鹽敏感材料Y8D6132下降幅度最大，即Y8D6132的相對K+含量（鹽脅迫時K+含量占正常環(huán)境K+含量的比率）最小，其中，葉片中 K+為對照的 47.00%，根系中 K+為對照的17.09%。其次是 Y8D6136的葉片中 K+為對照的59.50%，根系中K+為對照的25.97%，而耐鹽材料葉片和根系的相對 K+含量均高于鹽敏感材料葉片和根系的相對K+含量。對不同組織的K+含量分析發(fā)現(xiàn)，2種環(huán)境下不同品種的葉片和根系中 K+含量具有相同規(guī)律，即葉片＞根系，不同材料的根系和葉片之間K+差異均達到顯著水平。在鹽脅迫處理后，4種大豆材料根中K+含量下降幅度均高于相應(yīng)材料的葉片K+含量下降幅度。

經(jīng)鹽脅迫處理后，4種材料葉片中Ca2+含量顯著下降，其中，Y8D6132降低幅度最大，與對照相比，Ca2+含量降低了80.26%（圖5-C）。鹽脅迫后，根系中Ca2+含量呈現(xiàn)下降趨勢，Y8D6008和Y8D6132根系中Ca2+含量顯著下降，而Y8D6013和Y8D6136根系中Ca2+含量變化并沒有達到顯著水平。不同組織之間比較發(fā)現(xiàn)，對照環(huán)境下，4種材料的Ca2+主要分布在葉片，但是鹽脅迫處理后Ca2+含量在根部分布比重增加（圖5-D）。

圖4 Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因在鹽脅迫下的相對表達模式Fig. 4 The relative expression of key components involved in Na+homeostasis of four soybean varieties in 150 mmol·L-1NaCl treatments

150 mmol·L-1NaCl脅迫后，鹽敏感大豆Y8D6132與Y8D6136葉片和根系中的P含量均顯著下降，而耐鹽大豆Y8D6008和Y8D6013葉片P有所增加，但差異不顯著，根系中P在脅迫后顯著增加（P ＜ 0.05，圖5-F）。

2.4 NaCl脅迫下不同大豆品種的葉綠素（SPAD）及光合作用的氣體交換參數(shù)變化

利用葉綠素含量測定儀測定每個材料在不同處理下的SPAD值，發(fā)現(xiàn)鹽敏感大豆Y8D6132和Y8D6136葉綠素含量顯著降低。Y8D6008的葉綠素含量并沒有明顯變化，而Y8D6013葉綠素含量雖然降低為對照組葉綠素含量的74.93%，但是相對SPAD值高于鹽敏感材料（圖6）。

與對照環(huán)境相比，鹽脅迫使4種大豆材料葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（E）均顯著降低（圖6）。經(jīng)過7 d 150 mmol·L-1NaCl脅迫后，Y8D6132的凈光合速率降低到僅為對照的4.47%，Y8D6136降低了 81.27%。而 Y8D6008和Y8D6013在鹽脅迫下凈光合速率變化也達到顯著水平，但是2種材料的Pn均顯著高于鹽敏感大豆的Pn。鹽脅迫使得鹽敏感材料Y8D6132和Y8D6136的Gs和E均顯著下降，并且下降幅度遠大于耐鹽材料。對胞間CO2濃度（Ci）分析發(fā)現(xiàn)，受鹽脅迫后，Y8D6008和Y8D6013的Ci顯著降低，說明耐鹽大豆材料光合速率降低主要原因是鹽脅迫引起滲透脅迫從而導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。而鹽敏感材料的Ci不但沒有降低，反而上升趨勢，其中Y8D6132的Ci比對照的提高了39.58%，而且鹽敏感大豆的葉綠素受脅迫降低程度均高于耐鹽大豆，由此可見，非氣孔限制可能是導(dǎo)致鹽敏感大豆光合速率降低主要因子。而Y8D6008和Y8D6013在150 mmol·L-1NaCl鹽脅迫處理條件下光合參數(shù)受抑制的程度明顯小于鹽敏感材料，表現(xiàn)出較好的耐鹽性。

圖5 NaCl脅迫對大豆幼苗葉片及根系中K+、Ca2+和P含量的影響Fig. 5 Effects of 150 mmol·L-1NaCl concentrations on K+, Ca2+and P content in leaf and root of four soybean varieties seedlings

圖6 不同大豆品種鹽脅迫下的SPAD變化Fig. 6 Variation of SPAD in four soybean varieties under the stress of 150 mmol·L-1NaCl

K+、Ca2+和P是植物生長發(fā)育所必須的礦質(zhì)元素，參與植物光合作用，適量的 Na+對植物生長有一定益處，能夠參與氣孔調(diào)節(jié)和滲透調(diào)節(jié)等生理活動，過量Na+抑制光合作用。根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果，可以看出本研究中4種大豆品種的相對凈光合速率與相對K+含量及P含量呈顯著正相關(guān)，而與相對Na+含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（表3）。

3 討論

3.1 鹽脅迫下GmNcl1可能影響大豆耐鹽特性

圖7 鹽脅迫下不同大豆品種Pn、Gs、Ci和E的變化Fig. 7 Impacts of NaCl stress on Pn, Gs, Ci and E of four soybean varieties seedlings

表3 不同大豆品種的性狀之間相關(guān)性Table 3 Sample correlation coefficients between different traits of four soybean varieties seedlings

前人研究表明植株積累過量的 Na+對葉片造成嚴(yán)重傷害，另外由于葉片含有較高Na+濃度使得根部水勢增高，不利于根系吸收水分[18]。劉光宇等[19]和姜靜涵等[20]研究發(fā)現(xiàn)大豆葉片 Na+含量與耐鹽性有關(guān)。因此，避免 Na+在葉片中過量積累對大豆抗鹽性具非常重要作用。本研究結(jié)果顯示150 mmol·L-1NaCl處理后，鹽敏感品種葉片Na+積累量均顯著高于耐鹽品種，并且鹽敏感材料葉片中的 Na+含量均大于根系，這與前人研究結(jié)果一致。根系中 Na+通過中柱細胞泵入木質(zhì)部后再運輸?shù)降厣喜拷M織。前人通過圖位克隆得到的GmSALT3是一個非常重要的大豆耐鹽基因，NaCl處理后，該基因在耐鹽大豆材料（鐵峰8號）中大量表達，在鹽敏感大豆材料中不表達。GmSALT3在控制Na+向地上部運輸中發(fā)揮作用，但是并不直接參與控制鹽分向地上部運輸中[10]。本研究發(fā)現(xiàn)GmSALT3在4種材料中的表達均較低，并且鹽脅迫后有的材料表達上調(diào)有的表達下調(diào)。這說明本研究中耐鹽大豆可能存在與 GmSALT3不同的耐鹽基因。對 GmSOS1、GmNHX1、GmCIPK1以及GmAVP1表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因與葉片 Na+含量并不存在關(guān)聯(lián)性。有意思的是GmNcl1受鹽脅迫誘導(dǎo)表達上調(diào)，并且在鹽敏感大豆中上調(diào)倍數(shù)高于耐鹽大豆，該結(jié)果與赫衛(wèi)等[8]研究結(jié)果一致。赫衛(wèi)等[8]還發(fā)現(xiàn)GmNcl1由6個位點組成的不同單倍型能高效區(qū)分耐鹽和鹽敏感品種。綜合前人研究及本研究結(jié)果，推測GmNcl1可能與本研究大豆品種的耐鹽特性有一定關(guān)聯(lián)性，但是GmNcl1表達強度的差異是否影響到基因功能，對此還需要進一步研究。

3.2 Na+過量積累影響大豆植株其他離子含量

Na+和 K+具有相似的水合離子半徑，鹽脅迫下大量的Na+通過競爭植物細胞的K+通道蛋白的結(jié)合位點來降低植物體內(nèi)的K+的吸收和運輸[21]，相關(guān)性分析顯示相對Na+含量與相對K+含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說明鹽脅迫下本研究的4種大豆品種的Na+對K+表現(xiàn)出明顯的拮抗作用。150 mmol·L-1NaCl處理后，耐鹽大豆材料葉片相對K+含量均高于鹽敏感大豆，說明耐鹽大豆的葉片對 K+保持加強的吸收能力，以保證足夠 K+參與地上部的代謝。Ca2+水平與植物耐鹽性有重要的關(guān)聯(lián)性[22]。鹽脅迫下4種大豆葉片中Ca2+含量顯著降低，這與大多數(shù)的研究結(jié)果一致。但本研究耐鹽材料與鹽敏感材料之間受到鹽脅迫后Ca2+響應(yīng)情況并沒有規(guī)律性變化，而是表現(xiàn)出不同材料有不同的響應(yīng)，這可能是由于不同基因型品種之間的遺傳多樣性導(dǎo)致適應(yīng)脅迫的機制不同，對燕麥的鹽脅迫響應(yīng)的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)[23]。

不同作物對磷肥與鹽分相互作用的響應(yīng)機制非常復(fù)雜。有研究發(fā)現(xiàn) NaCl抑制作物對磷素的吸收和運輸[24-25]，但也有研究表明鹽脅迫能促進玉米的根系對磷的吸收[26]。另外還有研究發(fā)現(xiàn)提高磷素水平可以一定程度增強植物的耐鹽性或緩解鹽脅迫[27-28]。本研究顯示，150 mmol·L-1NaCl處理后鹽敏感大豆無論葉片還是根系中P含量均顯著下降，而耐鹽大豆葉片P含量沒有顯著降低，根系中P含量增加顯著。這說明鹽脅迫下耐鹽大豆保持P水平不降低甚至升高，可能是其具有較強耐鹽性的原因之一。

3.3 NaCl脅迫抑制大豆光合作用

光合作用被認(rèn)為是對鹽逆境脅迫最為敏感的生理過程。本研究顯示150 mmol·L-1NaCl 脅迫7 d后，除了Ci，4種大豆的凈光合速率及其他光合特征參數(shù)均顯著下降，鹽敏感大豆受抑制程度均高于耐鹽大豆。相關(guān)性分析顯示相對凈光合速率與相對葉片Na+含量相關(guān)性達到顯著水平。由此可見，Na+在葉片中過量積累是導(dǎo)致葉片凈光合速率下降的一個主要因素。鉀能夠維持葉綠素合成運轉(zhuǎn)并增強葉肉細胞光合活性[29]。有研究發(fā)現(xiàn)由于 Na+過量而造成其他營養(yǎng)元素虧缺同樣也會對光合作用產(chǎn)生影響[13]。本研究顯示鹽脅迫耐鹽大豆能盡量將體內(nèi)有限的K+優(yōu)先向葉片分配，保證耐鹽大豆葉片具有較高的光合速率。磷是構(gòu)成葉綠體被膜和類囊體膜的基本元素。另外，植物細胞內(nèi)的磷濃度下降導(dǎo)致光合磷酸化水平降低，ATP和NADPH生成減少，光合速率降低[30]。本研究鹽脅迫下耐鹽大豆相對P含量和相對光合速率均高于鹽敏感大豆。相關(guān)性分析顯示鹽脅迫后相對P含量與相對凈光合速率之間具有顯著正相關(guān)性。由此可見鹽脅迫下積累過量的 Na+離子及由此引起的K+和P營養(yǎng)虧缺均對光合作用產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

4 結(jié)論

150 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，鹽敏感大豆的地上部生物量、SPAD、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率受抑制程度顯著顯著高于耐鹽品種，鹽脅迫導(dǎo)致耐鹽品種光合速率下降主要因素可能是氣孔限制，而鹽敏感品種的光合速率下降主要因素是非氣孔限制。鹽脅迫下，耐鹽大豆葉片中 Na+含量顯著低于鹽敏感大豆，K+和P元素變化幅度均小于鹽敏感大豆，相關(guān)分析表明凈光合速率變化幅度與葉片中Na+、K+和P含量變化幅度的相關(guān)性達到顯著水平。鹽脅迫后鹽敏感大豆的 Na+通道蛋白基因GmNcl1表達量上調(diào)倍數(shù)低于耐鹽大豆。綜合分析認(rèn)為，與鹽敏感大豆相比，耐鹽大豆在鹽脅迫環(huán)境下減少Na+在葉片中積累，保持相對較高的K+和P含量，并維持相對較高的光合速率，這可能是耐鹽大豆比鹽敏感大豆具有較強耐鹽特性的因素之一。另外 Na+動態(tài)平衡相關(guān)基因 GmNcl1可能與大豆耐鹽特性有一定關(guān)聯(lián)性。

致謝：本研究大豆材料為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心喻德躍教授提供，在此表示感謝。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Effect of Salt Stress on Physiological Reponses and the Expression of Key Genes Involved in Na+Homeostasis of Soybean Seedlings

NING Li-hua, ZHANG Da-yong, LIU Jia, HE Xiao-lan, WAN Qun, XU Zhao-long, HUANG Yi-hong, SHAO Hong-bo
(Institute of Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/ Provincial Key Laboratory of Agrobiology, Nanjing 210014)

【Objective】In order to provide a reference for soybean cultivation, breeding and artificial regulation of salt stress, the physiological and molecular responses to different genotype soybean seedlings, especially the effects of salt stress onphotosynthetic parameters, ions content and the expression of key genes involved in Na+homeostasis of soybean seedlings were studied. Through comparison of the difference in response to salt stress, the study try to reveal the salt resistance mechanisms of different cultivated genotypic soybeans.【Method】The responses of photosynthetic characteristics and ion content of soybean seedlings were studied under salt stress. Salt tolerant cultivated soybean varieties (Y8D6008, Y8D6013) and salt sensitive cultivated soybean varieties (Y8D6132, Y8D6136) were incubated in the 1/2×Hoagland nutrient solution. NaCl was added to nutrient solution incrementally by 50 mmol·L-1step per day to provide final concentrations of 150 mmol·L-1for salt treatment at 1-compound leaf stage, and the treatment lasted for 7 days. The control plants were cultured with nutrient solution without adding NaCl. The response of soybean seedlings to NaCl stress was assessed by measuring the expression of key genes involved in Na+homeostasis, photosynthetic parameters, and the ion content of soybean. 【Result】The growth of the four cultivated soybean seedlings was significantly inhibited by 150 mmol·L-1NaCl stress. And salt stress significantly reduced soybean leaf SPAD value, net photosynthetic rate and transpiration rate. However, the inhibition of NaCl on growth and photosynthetic characteristics was more severe in salt sensitive cultivar than in salt tolerant cultivar. Moreover, 150 mmol·L-1NaCl concentration reduced leaf intercellular CO2concentration in salt tolerant cultivar, and increased it in salt sensitive cultivar. Thus，the reduction in net photosynthesis rate of salt tolerant cultivar caused by 150 mmol·L-1NaCl stress was considered to be a result of stomatal restriction; but increased non-stomatal restriction resulted in more severe reductions in photosynthesis of salt sensitive cultivar. Under salt stress, the Na+content was significantly increased in four cultivars seedlings, and the increase was more pronounced in salt sensitive soybean. In response to salt stress, the K+content of leaves decreased, the magnitude of these changes was greater in salt sensitive cultivars than in salt tolerance cultivars. Compared with the controls, phosphorus (P) accumulation of salt sensitive soybean in leaves was significantly decreased by 150 mmol·L-1NaCl treatment. While salt treatment had no significant influence on the P content in the leaves of salt tolerance cultivars. Correlation analysis showed that the relative net photosynthetic rate was strongly negatively correlated with relative Na+content and positively correlated with relative K+content and total phosphorus content. Six key genes, Na+transporter genes (GmSALT3, GmSOS1, GmNcl1, GmNHX1), the gene of signal system for Na+homeostasis (GmCIPK1), and the gene of energetic system for the operation of Na+transporters (GmAVP1), involved in Na+homeostasis were chosen for gene expression analyses. The expression of GmNcl1 was significantly induced by NaCl treatment and the expressions of GmNcl1 induced by salt stress of salt tolerance cultivars were lower than those of salt sensitive cultivars. The expression of GmNcl1 associated closely with salt tolerance features and Na+content of four soybean cultivars. However, the expression of the rest five genes showed no association with Na+content of four soybean cultivars.【Conclusion】Compared with the salt sensitive cultivars, salt tolerant cultivars effectively maintained a lower Na+content, and a higher level of K+and P contents in leaves to ensure a relatively high photosynthetic rate under salt stress condition. This may be one of the mechanisms to keep higher salt resistance in salt tolerant cultivar than in salt sensitive cultivar. In addition, GmNcl1 may associate with the salt tolerance characteristics of the soybean cultivars in this study.

cultivated soybean; salt stress; photosynthetic characteristic; ion content; gene expression; Na+homeostasis

2016-05-16；接受日期：2016-07-18

國家自然科學(xué)基金（31600211；31101166）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20160584）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX(15)1005）、江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程（SXGC(2016)335）

聯(lián)系方式：寧麗華，E-mail：NLH_2015@126.com。通信作者張大勇，E-mail：cotton.z@126.com。通信作者邵宏波，E-mail：shaohongbochu@126.com