高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水中氯霉素效果分析

郭曉關，李 俊

(貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心，貴州 貴陽 550004)

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高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水中氯霉素效果分析

郭曉關，李 俊

(貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心，貴州 貴陽 550004)

為建立水氯霉素殘留檢測方法，分析了高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水中氯霉素殘留效果。結果表明高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水中氯霉素殘留實驗添加平均回收率為86.1%～92.1 %，相對標準偏差(RSD,n=6)為3.41%～4.57%；相關系數(shù)為0.9982；方法檢出限為6×10-3μg·L-1，定量限為2×10-2μg·L-1，說明具有快速、準確、靈敏度高等特點，適用于水中氯霉素殘留檢測檢測分析。

水;氯霉素;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

氯霉素(chloramphenicol，簡稱CAP)，由大衛(wèi)·戈特利布(David Gottlieb)于1947年從南美洲委內(nèi)瑞拉的土壤內(nèi)的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)成功分離，再于1949年合成并引入臨床試驗。它屬抑菌性廣譜抗生素，是世界上首種完全由合成方法大量制造的廣譜抗生素，對很多不同種類的微生物均起著作用[1]。但是氯霉素有嚴重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血和粒狀白細胞缺乏等疾病。因此，國內(nèi)外都有相關法規(guī),，來限定食品中氯霉素的最高殘留量[2]。由于價格低廉, 早期曾被廣泛用于人、畜多種傳染性疾病的治療, 我國上世紀80 年代開始在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛的應用，氯霉素的使用會照成在水產(chǎn)品中和水體中的殘留，通過食物鏈最后對人類造成危害。

目前，針對水產(chǎn)品[3,4]、禽類[5,6]、蜂蜜[7,8]、牛奶[9,10]等對象的研究居多。水是生命之源，水之源有機污染物調(diào)查是環(huán)境保護的需要，因此急需建立一種經(jīng)濟、快速、靈敏、準確的水中氯霉素分析方法，提高分析效率，盡可能獲取信息。氯霉素殘留常規(guī)分析方法主要有微生物方法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，微生物方法操作繁雜費時，只能做定性檢測分析；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀是目前最常用的定量方法。為此，建立了高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水中CAP殘留量的方法，并進行了效果分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

試驗使用樣品水取于貴陽市花溪水庫；水體如渾濁需取回需過濾后在試驗使用。

高效液相色譜-質(zhì)譜儀(4000 Qtrap LC-/MS/MS，美國ABI公司)；氮吹儀(美國 OI)。乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、正己烷(色譜純，美國 天地公司)，超純水(實驗室自制)；C18固相萃取柱(1000 mg/6 mL,美國Waters公司)；氯霉素標準品(美國 sigma公司)；

1.2 樣品前處理

C18固相萃取小柱依次用5 mL二氯甲烷、甲醇、水活化平衡，將500 mL水樣以5 mL/min 的速度連續(xù)上樣到C18柱，氮氣吹干，完成樣品在C18柱上的富集，不收集上述所有濾液，最后用3 mL乙酸乙酯洗脫柱子，收集濾液，在40 ℃水浴氮吹至盡干，甲醇定溶至5 mL，LC-/MS/MS聯(lián)用儀測定。

1.3 儀器條件

色譜條件 色譜柱：Kinebe C18色譜柱(100 mm×2.10 mm,2.6 μm)；流動相：甲醇/水(6/4，V/V)；流速0.5 mL/min；進樣量2.0 μL；柱溫(35 ℃)。

質(zhì)譜條件 電噴霧正離子化源(ESI+)；毛細管電壓(3.5 kv)；離子源溫度(100 ℃)；霧化溫度(300 ℃)；脫溶劑氣(500 L/h)；多反應檢測模式(MRM)掃描；定性離子對(320.9>257.0)，去簇電壓(-55)碰撞能量(-16)；定量離子對(320.9>152.0)，去簇電壓(-55)，碰撞能量(-26)；MRM色譜圖見圖1。

圖1 氯霉素SRM色譜圖Fig.1 SRM Chromatogram of the chloramphenicol

2 結果與討論

2.1 水樣提取與凈化

采用C18反向固相萃取柱富集洗脫凈化樣品。洗脫液的極性強弱決定了樣品的凈化效果，目的是要使用最小量的洗脫液將氯霉素洗脫出來，而且還要防止雜質(zhì)的大量流出。實驗分別采用正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈作為洗脫液凈化已添加氯霉素的樣品，考慮樣品添加回收率及凈化效果。在500 mL水樣中添加5 μg氯霉素，分別用10 mL正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷洗脫C18反向固相萃取柱，收集液每1 mL收集一次，用甲醇溶劑置換后定容為1 mL上機檢測，重復做3次，利用平均峰面積與流出體積作出洗脫液淋洗曲線圖2。實驗結果表明采用乙酸乙酯凈化效果最好，當洗脫劑用量為3 mL時，樣品添加回收均在90 %以上，因此選用3 mL乙酸乙酯溶劑為方法的洗脫條件。

圖2 洗脫液淋洗曲線Fig.2 Eluent elution curves

2.2 質(zhì)譜離子對選擇

歐盟非強制執(zhí)行法案[11]規(guī)定質(zhì)譜檢測中，最少需要3個識別點才能確認物質(zhì)的定量和定性，選擇1個母離子、2個子離子作為定性定量離子對，離子對參照GB/T 20756[12]標準。在相同的實驗條件下，樣品和標樣中氯霉素保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)，且樣品和相當濃度的標樣中定性離子對的相對豐度比應滿足歐盟非強制執(zhí)行法案要求，可定性樣品中有氯霉素檢測，研究采用標準曲線外標法對樣品進行定量分析。

2.3 干擾性實驗

研究建立的方法主要應用于多種水體中氯霉素的檢測，水體受污染的情況會對檢測結果造成一定的干擾和影響，特別是對液相 法、氣相法檢測影響較大。實驗在水里添加少量柴油模仿工業(yè)廢水，在水里添加少量食用油、洗滌用品來模仿生活廢水。分別在這兩種水中加入1.0μg/L-1量的氯霉素，采用上述方法檢測水樣中氯霉素的含量分別為，模仿工業(yè)廢水中檢出0.82μg/L-1，模仿生活用水中檢出0.87μg/L-1，兩種模仿廢水中氯霉素檢出色譜圖見圖3和圖4，從結果可知，方法的抗干擾能力強，對受污染較嚴重的工業(yè)廢水、生活廢水中氯霉素檢測有很好的效果。

圖3 仿生工業(yè)廢水SRM色譜圖Fig.3 SRM Chromatogram of the bionic industrial wastewater

圖4 仿生生活廢水添加樣色譜圖Fig.4 SRM Chromatogram of the bionic life wastewater

2.4 方法線性與靈敏度

配置質(zhì)量濃度的為10、20、50、100、500 μg·L-1的標準溶液在實驗條件下檢測，以質(zhì)量濃度與峰面積作線性回歸，結果表明，氯霉素在10-500 μg·L-1范圍內(nèi)顯線性關系，相關系數(shù)為0.9982。采用空白樣品添加目標化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰性噪比RS/N=3計算檢出限，RS/N=10計算方法定量限，檢出限為6×10-3μg·L-1、定量限為2×10-2μg·L-1(見表1)。

2.5 方法回收率和精密度

量取500 mL水樣品，添加三個濃度水平(0.1 μg·L-1，0.5 μg·L-1，5.0 μg·L-1)的標樣，每個濃度水平重復6次。利用上述方法進行添加回收率試驗，平均回收率(R)和相對標準偏差(RSD，n=6)結果見表1。結果表明，氯霉素平均回收率為86.1～92.1 %，相對標準偏差(RSD,n=6)為3.41～4.57%，方法能滿足樣品檢測需求，準確可靠。

表1 方法檢出限、精密度和回收率

Table 1 Detection limits, precision tests and recoveries tests of the method

3 結論

研究建立的水中氯霉素殘留檢測方法，在實驗條件下，樣品添加平均回收率為86.1～92.1 %，相對標準偏差(RSD,n=6)為3.41～4.57%；方法檢出限為6×10-3μg·L-1，定量限為2×10-2μg·L-1，說明方法具有快速、準確、靈敏度高等特點，適用于多種水體中氯霉素殘留檢測檢測分析。

[1] 魏林陽,徐金晶,吳紅軍.水產(chǎn)品中氯霉素殘留的氣質(zhì)聯(lián)用法測定[J].光譜實驗室,2007,24(2):201-205.

[2] Regulation ( EC)807P2001 Laying down a Community Procedure for the Establishment of Maximum Residue Limits ofVeterinary Medicinal Products in Foodstuffs of Animal Origin.

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[11] Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of result" (Official Journal L221, 17 August 2002, pp: 8-36).

[12] 龐國芳,林海丹,林峰等.GB/T 20756中國標準書號[S].北京:中國標準出版社,2006.

Analysis of Chloramphenicol Determination in Water by High Performance Liquid Chromatography-quadrupole Mass Spectrometry

GUO Xiao-guan,LI Jun

(GuizhouProvincialDetectionCenterofQualityandSafetyofAgri-Product,Guiyang, 550004,China)

The purpose is to establish the determination methods of chloramphenicol residues in water. analysis of chloramphenicol determination in water by high performance liquid chromatography - mass spectrometry. The results showed that using this determination method, adding recovery rate was 86.1 - 92.1%, the relative standard deviation (RSD, n=6) ranged from 3.41% to 4.57%; the correlation coefficient was 0.9982; the detection limit was 6 × 10-3μ g ? L-1, and detection limit was 2 × 10-2μ g ? L-1. The method is rapid, accurate and highly sensitive, and is suitable for the determination of chloramphenicol residues in water.

water; chloramphenicol; high performance liquid chromatography - mass spectrometry

2016-09-15

郭曉關(1982-)，女，農(nóng)藝師，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品安全。

李俊，男，高級實驗師，研究方向為食品安全及儀器分析。