人工分子伴侶介導(dǎo)液相體系中肌球蛋白熱穩(wěn)定性的研究

付葦婭，鐘婉玲，胡亞麗，周春霞，洪鵬志

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室， 廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，廣東 湛江，524088)

人工分子伴侶介導(dǎo)液相體系中肌球蛋白熱穩(wěn)定性的研究

付葦婭，鐘婉玲，胡亞麗，周春霞，洪鵬志

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室， 廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，廣東 湛江，524088)

為了進一步提高魚蛋白的熱穩(wěn)定性，擴大水產(chǎn)蛋白的應(yīng)用范圍，本研究以羅非魚魚肉為原料來提取肌球蛋白，并對其進行了熱處理，同時以濁度、溶解度、總巰基含量和表面疏水性為指標，試驗了十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-環(huán)糊精(β-CD)的添加對肌球蛋白熱變性聚集的抑制效果，探討人工分子伴侶(SDS-β-CD)介導(dǎo)液相體系中肌球蛋白熱穩(wěn)定性的改善.單因素影響的分析表明，在試驗范圍內(nèi)，在pH 6.0，SDS添加量為5 mmol·L-1和蛋白質(zhì)量濃度2 g·L-1的條件下，于50 ℃熱處理30 min后添加β-CD(SDS與β-CD的比例為1 ∶2)，可以有效抑制肌球蛋白的熱變性聚集；熱變性抑制機理的分析顯示，添加SDS和SDS-β-CD均能有效地抑制熱升溫處理(升溫速率1 ℃·min-1，30～80 ℃)對肌球蛋白溶解度和濁度的影響(p≥0.05)，抑制熱處理對蛋白分子巰基的破壞作用，降低蛋白質(zhì)分子間的相互作用，由此抑制肌球蛋白熱處理過程中的變性聚集，從而改善體系的熱穩(wěn)定性.

肌球蛋白； SDS； β-環(huán)糊精； 人工分子伴侶； 熱穩(wěn)定性

中國是世界上最大的羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)國家，產(chǎn)量約占全球羅非魚產(chǎn)量的50%[1].羅非魚魚肉的蛋白含量較高，但其蛋白的穩(wěn)定性差，在加工貯藏過程中極易變性.熱處理是食品加工中最重要的工藝之一，也是常見的蛋白質(zhì)變性方法，在熱處理過程中蛋白質(zhì)分子會產(chǎn)生變性，其分子結(jié)構(gòu)展開，分子間的相互作用可導(dǎo)致分子的聚集和沉淀[2-3].為了減少蛋白質(zhì)熱處理過程中分子間的相互作用和聚集，常嘗試添加蛋白質(zhì)保護劑[4].SDS是具有雙親性結(jié)構(gòu)的小分子表面活性劑，它可與蛋白質(zhì)分子通過彼此疏水的相互作用而形成復(fù)合物，掩蓋蛋白質(zhì)分子所暴露的疏水位點，從而在蛋白質(zhì)重折疊和恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)前起到抑制蛋白質(zhì)聚集的作用[5].相關(guān)的研究顯示，SDS可有效提高多種食物蛋白質(zhì)的溶解性，盡管如此，但仍缺乏對其相關(guān)機理的解釋[6].β-環(huán)糊精(β-CD)是一種環(huán)狀低聚糖，由脫水葡萄糖單位以α-1，4-糖苷鍵首尾相連而成，在空間呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，“內(nèi)疏水，外親水”的特殊分子結(jié)構(gòu)使其容易包結(jié)不同的客體化合物而形成特殊結(jié)構(gòu)的包結(jié)物[7]，當向表面活性劑-蛋白質(zhì)混合體系中加入β-CD時，環(huán)糊精會通過強烈的競爭性結(jié)合作用將表面活性劑從蛋白質(zhì)分子的表面剝離，使分子恢復(fù)到天然構(gòu)象.小分子表面活性劑和環(huán)糊精這種作用體系通常被稱為人工分子伴侶(Artificial molecular chaperone)，目前它已被用于改善大豆蛋白[5]、牛血清蛋白[8]、溶菌酶[4, 9]等的穩(wěn)定性.由于肌球蛋白是構(gòu)成魚類肌肉蛋白的主要成分之一，因此，本研究從提高魚蛋白熱穩(wěn)定性的角度出發(fā)，研究了單因素的影響和熱聚集變性抑制機理，以期為今后羅非魚蛋白的加工提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料鮮活的羅非魚：購于湛江市麻章區(qū)湖光巖市場，在迅速帶回實驗室后，去內(nèi)臟、去骨刺、去紅肉，再取其背部白肉，清洗，絞碎.

氯化鉀、六水合氯化鎂、硫酸銨、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉等均為分析純.

1.2 實驗儀器TJ12-A絞肉機，廣東番禺恒聯(lián)食品機械廠；Avanti J-26sxp高效離心機，美國Beckman公司；UV-2550型紫外分光光度計，RF-5301P熒光分光光度計，日本島津公司；

1.3 實驗方法

1.3.1 羅非魚肌球蛋白的制備 參照課題組洪偉[10]的硫酸銨沉淀法提取肌球蛋白.經(jīng)硫酸銨沉淀后，取沉淀于Tris-HCl緩沖液(20 mmol·L-1，0.6 mol·L-1KCl，pH 7.0)中透析，然后離心(50 000 g，60 min)，所得上清液即為肌球蛋白溶液.接著，采用Lowry法檢測上清液的蛋白含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標準物，在測量波長為750 nm下，進行SDS-PAGE電泳(5%分離膠，12%濃縮膠)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)計算，蛋白質(zhì)的純度超過93%.

1.3.2 肌球蛋白熱變性聚集的抑制實驗 用上述Tris-HCl緩沖液稀釋肌球蛋白原液到一定濃度，調(diào)節(jié)pH值，于50 ℃熱處理30 min，分別考察SDS添加量(0～50 mmol·L-1)、蛋白質(zhì)量濃度(0.5～10 g·L-1)、β-CD的添加順序(熱處理前、熱處理后)、SDS與β-CD添加的比例(1 ∶1～1 ∶5)對肌球蛋白體系濁度和溶解度的影響；在確定的實驗條件下對肌球蛋白溶液進行熱處理(升溫速率為1 ℃·min-1，30～80 ℃).所有經(jīng)熱處理后的樣品立即冷卻至室溫，檢測其濁度的變化，經(jīng)離心(10 000 g，10 min)后，檢測上清液中的可溶性蛋白含量、總巰基含量和表面疏水性.

1.3.3 肌球蛋白濁度的測定 將未加熱和熱處理后的肌球蛋白樣品冷卻至室溫后，以上述Tris-HCl緩沖液做空白，使用紫外分光光度計在350 nm下測量吸光度A350[11]，記為濁度，實驗重復(fù)3次，取平均值.

1.3.4 總巰基含量的測定 采用DTNB[12]測量可溶性肌球蛋白的總巰基含量.

1.3.5 表面疏水性的測定 采用ANS熒光探針法[13]檢測可溶性肌球蛋白的表面疏水性.

1.3.6 統(tǒng)計分析 試驗所得的數(shù)據(jù)結(jié)果表示為:平均值±標準差Mean values±SD(Standard Deviation)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用JMP程序進行方差分析，差異顯著性(p<0.05)分析采用t統(tǒng)計程序，作圖采用origin 7.5軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 人工分子伴侶抑制肌球蛋白熱變性聚集的影響因素

2.1.1 SDS添加量對熱處理肌球蛋白體系濁度和溶解性的影響

固定肌球蛋白質(zhì)量濃度為2 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至6.0，于50 ℃熱處理30 min，試驗SDS添加量對肌球蛋白體系濁度和溶解性的影響，結(jié)果如圖1.由圖1可知，在實驗范圍內(nèi)，當SDS濃度高于1 mmol·L-1時，隨著SDS濃度的增加，熱處理后肌球蛋白體系的濁度下降，而可溶性蛋白質(zhì)含量增加(p<0.05)，且當SDS濃度達到3 mmol·L-1時，熱處理后肌球蛋白體系的濁度變化極小，其可溶性蛋白含量基本保持在2 g·L-1(p>0.05).溶解度反映了加熱后肌球蛋白的變性程度以及其在溶液中的狀態(tài)，溶解度越大，則蛋白的變性程度越??；濁度可粗略地估計已溶解的肌球蛋白的熱聚集情況，濁度越大，則蛋白的變性程度越大.因此，SDS濃度高于3 mmol·L-1時可以有效地抑制肌球蛋白的熱變性和聚集，相關(guān)的研究結(jié)果在王君[4]的報道中也有體現(xiàn)，適宜濃度的表面活性劑的單獨作用即可以抑制聚集并促進復(fù)性，且表面活性劑的作用主要在于抑制聚集體的生成[14].綜合分析，確定SDS溶液濃度為5 mmol·L-1時進行下一步的實驗.

2.1.2 不同蛋白質(zhì)量濃度條件下SDS對肌球蛋白熱變性聚集的影響 固定SDS濃度為5 mmol·L-1，調(diào)節(jié)pH 6.0，試驗不同蛋白質(zhì)量濃度條件下SDS對肌球蛋白體系濁度和溶解度的影響，結(jié)果如圖2.由圖2可知，沒有加SDS的蛋白樣品經(jīng)50 ℃熱處理30 min后，體系濁度和可溶性蛋白含量均隨初始蛋白質(zhì)量濃度的增大而增大(p<0.05)；添加了SDS的體系在相同條件下熱處理后，其濁度變化不明顯(p>0.05)，且濁度均低于未添加SDS的體系；當?shù)鞍踪|(zhì)量濃度為2.0 g·L-1和4.0g·L-1時，添加SDS的蛋白樣品在熱處理后的溶解度大于沒有加SDS的蛋白樣品在熱處理后的溶解度，但當?shù)鞍踪|(zhì)量濃度高于4.0 g·L-1時，添加SDS后體系的可溶性蛋白含量下降(p<0.05)，此時，SDS的存在可能促進了分子的聚集，而體系的濁度仍然較低，這表明可能形成了可溶性的大分子聚集體，經(jīng)離心后即產(chǎn)生沉淀.隨著體系蛋白質(zhì)量濃度的增加，肌球蛋白分子之間的距離減小，這時各種化學(xué)鍵很容易通過相互作用而產(chǎn)生凝集，所以，肌球蛋白的濁度隨蛋白質(zhì)濃度變化明顯[15].綜合分析，確定蛋白質(zhì)量濃度為2.0 g·L-1時進行下一步實驗.

2.1.3β-CD添加順序?qū)∏虻鞍谉嶙冃跃奂挠绊?固定肌球蛋白質(zhì)量濃度為2 g·L-1，SDS溶液濃度為5 mmol·L-1，調(diào)節(jié)pH為6.0，試驗β-C添加順序?qū)∏虻鞍左w系濁度和溶解度的影響，結(jié)果如圖3.由圖3可知，添加SDS的肌球蛋白體系經(jīng)熱處理后再添加β-CD，其體系肌球蛋白的溶解度最大，濁度也相對較??；在表面活性劑抑制蛋白質(zhì)聚集后，添加β-CD，利用β-CD與蛋白質(zhì)的競爭來吸附表面活性劑，可使蛋白質(zhì)與表面活性劑分離，從而恢復(fù)單體狀態(tài).郭建[6]的研究表明，若在熱處理前添加β-CD至大豆11S蛋白-SDS分散液，加熱后其濁度輕微下降，表明此時SDS起不到抑制蛋白質(zhì)聚集的作用.若在熱處理后添加β-CD至大豆11S蛋白-SDS分散液，加熱后其濁度大幅下降，說明SDS能有效抑制蛋白質(zhì)聚集，但該體系的濁度仍比沒有添加β-CD的體系的濁度高，這是由于SDS在加熱過程中與大豆11S蛋白形成了復(fù)合物；熱處理后，β-CD的加入可使SDS與大豆11S蛋白分離.綜合分析，確定添加SDS并進行熱處理后再添加β-CD來進行下一步實驗.

2.1.4 SDS與β-CD添加比例對肌球蛋白熱變性聚集的影響 固定肌球蛋白質(zhì)量濃度為2 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至6.0，添加5 mmol·L-1的SDS，加熱后再加β-CD，以此試驗SDS與β-CD的添加比例對肌球蛋白體系濁度和溶解度的影響，結(jié)果如圖4.由圖4可知，SDS與β-CD的比例為1∶2時，熱處理后肌球蛋白體系的濁度最小，其可溶性蛋白的含量最高(p<0.05)，這表明適宜比例的人工分子伴侶組合可以有效抑制肌球蛋白的熱變性聚集.人工分子伴侶由SDS和β-CD組成，SDS可以與蛋白質(zhì)結(jié)合而形成復(fù)合體，從而抑制蛋白質(zhì)的聚集，然后，β-CD從復(fù)合體中剝離掉SDS，蛋白質(zhì)再進行折疊[5].Dong等[9]在人工分子伴侶輔助溶菌酶復(fù)性的實驗中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)折疊率隨人工分子伴侶濃度的上升而增大.王君[4]的研究表明，在同樣的CTAB用量下，β-CD濃度越高，則復(fù)性率越高，當β-CD與CTAB的比為2時，可以實現(xiàn)CTAB的剝離而輔助復(fù)性，而當β-CD/CTAB≥4時，復(fù)性率達到最高并保持不變；但若β-CD/CTAB<2，那么僅在CTAB用量較低時才能實現(xiàn)復(fù)性，當CTAB用量較高時則不足以脫除CTAB而實現(xiàn)溶菌酶的復(fù)性.因此，確定SDS與β-CD添加的比例為1 ∶2時進行下一步實驗.

綜合分析，確定人工分子伴侶抑制肌球蛋白熱變性的條件為：pH 6.0，SDS添加濃度為5 mmol·L-1，在蛋白質(zhì)量濃度為2 g·L-1的條件下，于50 ℃熱處理30 min后再添加β-CD(SDS與β-CD的比例為1∶2).

2.2 人工分子伴侶抑制肌球蛋白熱變性聚集的機理研究

2.2.1 人工分子伴侶對熱處理肌球蛋白體系溶解度的影響 在上述確定的人工分子伴侶抑制肌球蛋白熱變性條件下，對肌球蛋白體系進行升溫處理(升溫速率1 ℃·min-1，30～80 ℃)，試驗人工分子伴侶體系對熱處理肌球蛋白體系溶解度的影響，結(jié)果如圖5所示.由圖5可知，在升溫處理過程中，未添加SDS的樣品在體系溫度上升到40 ℃之后開始急速下降(p<0.05)，到50 ℃之后下降速度趨于平緩，且其值較??；對于添加SDS的蛋白樣品和添加SDS-β-CD的樣品其溶解度隨溫度升高的變化不明顯(p>0.05)，由此表明，SDS可以抑制肌球蛋白的熱變性，并可增加肌球蛋白的溶解度；比較而言，熱處理后加入的β-CD與SDS結(jié)合所形成的包結(jié)物則進一步增加了肌球蛋白體系在高溫時的溶解度.因此，添加SDS關(guān)于加熱后加β-CD，在高溫時其抑制效果更好.

2.2.2 人工分子伴侶對熱處理肌球蛋白體系濁度的影響 在上述確定的人工分子伴侶抑制肌球蛋白熱變性條件下，進一步試驗人工分子伴侶對熱處理肌球蛋白濁度的影響，結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，在實驗溫度范圍內(nèi)，未添加SDS的蛋白體系在熱處理過程中，其濁度從40 ℃開始顯著上升(p<0.05)，到60 ℃之后，上升速度趨于平緩，80℃時其濁度最大.很明顯，熱處理導(dǎo)致了蛋白質(zhì)分子的變性和聚集，從而引起蛋白溶液濁度的上升[2, 16]；添加SDS和添加SDS-β-CD的蛋白樣品的濁度隨溫度升高的變化不明顯(p>0.05)，表明在熱處理過程中，蛋白質(zhì)分子所暴露的疏水基團與SDS疏水基相互作用而形成可溶性復(fù)合體，從而抑制了肌球蛋白分子間的聚集.結(jié)合人工分子伴侶對肌球蛋白溶解度的影響的分析可知，加入SDS可以抑制分子的熱變性聚集，而添加SDS并于加熱后加β-CD，在高溫時其抑制效果更好.

2.2.3 人工分子伴侶對熱處理肌球蛋白總巰基含量的影響 進一步分析人工分子伴侶對熱處理肌球蛋白總巰基含量的影響，結(jié)果如圖7.由圖7可知，在實驗范圍內(nèi)，未添加SDS的肌球蛋白總巰基含量隨著熱處理溫度的升高而下降，且溫度高于40 ℃時變化明顯(p<0.05)，這與Ko等[16]對羅非魚肌球蛋白熱變性的實驗結(jié)果類似，即總巰基含量隨熱處理溫度的升高而下降；對于熱處理前添加了5 mmo·L-1SDS的樣品，其總巰基含量在溫度上升到70 ℃之前沒有明顯變化(p>0.05)，而當溫度升到80 ℃時，其總巰基的含量上升(p<0.05)，且在溫度上升到50 ℃時，共總巰基的含量開始高于未添加SDS的樣品的總巰基含量，這表明SDS的添加對肌球蛋白的分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響；添加SDS并于加熱后加β-CD，溫度為40 ℃時其總巰基含量下降(p<0.05)，溫度大于40 ℃時，隨著溫度的升高其變化不明顯(p>0.05).相比較而言，對于添加SDS并于加熱后加β-CD的蛋白樣品，其總巰基的含量在高溫時更趨于穩(wěn)定.蛋白的熱變性和聚集是由于在熱處理過程中蛋白分子間的相互作用受到破壞，使其巰基暴露出來，同時被氧化成二硫鍵，而破壞少量的巰基就會對蛋白性質(zhì)產(chǎn)生很大的影響[3].綜合分析，SDS能有效抑制熱處理對肌球蛋白巰基的破壞作用，而在添加SDS并于加熱后加β-CD，其在高溫時的作用效果更穩(wěn)定.

2.2.4 人工分子伴侶對熱處理肌球蛋白體系表面疏水性的影響 人工分子伴侶對熱處理肌球蛋白表面疏水性的影響結(jié)果如圖8.由圖8可知，在實驗范圍內(nèi)，當熱處理溫度上升到50 ℃時，未添加SDS的肌球蛋白樣品的表面疏水性上升，這表明其分子內(nèi)部的疏水基團暴露了；添加了SDS的蛋白樣品都具有較強的表面疏水性，且隨熱處理溫度的升高其變化不明顯，可能是因為SDS與蛋白分子之間通過疏水基形成了復(fù)合體，避免了蛋白分子的聚集，結(jié)合人工分子伴侶對熱處理體系濁度和溶解度影響的分析，其進一步表明，SDS的作用主要是抑制蛋白質(zhì)分子間的疏水聚集[14]；對于添加SDS并于加熱后加β-CD的蛋白樣品，其表面疏水性低于添加SDS的樣品的表面疏水性，但仍高于未加SDS的蛋白溶液，表明β-CD未完全剝除復(fù)合體中的SDS，溶液中仍存在部分SDS-蛋白復(fù)合體，因而使得溶液表面疏水性高于對照組.由此表明，添加SDS可以明顯增加熱處理后肌球蛋白的表面疏水性，維持其原有的功能特性.也有研究表明，SDS可以與溶菌酶形成一種特殊的復(fù)合結(jié)構(gòu)而不會導(dǎo)致分子構(gòu)象的改變；但產(chǎn)生這種作用需要疏水基團和溶菌酶所帶的正電荷來共同參與[9].

3 結(jié) 論

單因素影響的分析表明，在試驗范圍內(nèi)，于pH為6.0，SDS添加濃度為5 mmol·L-1，蛋白質(zhì)量濃度為2 g·L-1的條件下，于50 ℃熱處理30 min后添加β-CD(SDS與β-CD的添加比例為1∶2)，可以有效抑制肌球蛋白熱變性聚集.熱聚集變性抑制機理的分析顯示，添加SDS和SDS-β-CD均能有效抑制熱處理(1 ℃·min-1，30～80 ℃)對肌球蛋白溶解度和濁度的影響，并能抑制熱處理對蛋白分子巰基的破壞作用，降低蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用，由此抑制肌球蛋白熱處理過程中的變性聚集，從而改善體系的熱穩(wěn)定性.

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Artificial Molecular Chaperone-Mediated Thermal Stability of Myosin in the Liquid System

Fu Weiya, Zhong Wanling, Hu Yali, Zhou Chunxia, Hong Pengzhi

(College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution, Zhanjiang 524088, China)

In order to further enhance the thermal stability of fish protein, and expand the application range of aquatic protein, in the study, myosin was extracted from tilapia meat, and heat treatment was performed. The turbidity, solubility, total sulphur content, surface hydrophobicity and fluorescence emission spectra of myosin were used as index, and the inhibition effects of the addition of SDS and β-CD on the thermal denaturation and aggregation of myosin were studied, and the improvement of thermal stability of myosin in the liquid system was discussed by artificial molecular chaperone (SDS-β-CD). Single factor analysis results showed that at pH 6.0, when the concentration of SDS was 5mmol·L-1, the concentration of myosin was 2mg·mL-1, and when the sample was heated at 50℃ for 30min and β-CD (SDS and β-CD ratio of 1:2) was added, the thermal denaturation and aggregation of myosin were could effectively inhibited. The inhibition mechanism analysis of thermal denaturation and aggregation showed that effects of addition of SDS and SDS-β-CD on the solubility and turbidity (p>0.05) was effectively inhibited during the process of heating treatment (1℃·min-1, 30～80℃). The destructive effects of heat-treatment on sulfydryl of protein molecules were inhibited, and the interactions between protein molecules were decreased, which resulted in the inhibition of thermal denaturation and aggregation of myosin, and the thermal stability of the system was improved.

Myosin; SDS; β-CD; artificial molecular chaperone; thermal stability

2016-03-16

廣東省教育廳科技創(chuàng)新項目(2013KJCX0098)；廣東省高等學(xué)校學(xué)科與專業(yè)建設(shè)專項科技創(chuàng)新項目(2013KJCX0098)

付葦婭(1990-)，女，河南周口人，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院2014級在讀碩士生，E-mail：happydall@126.com

周春霞(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：水產(chǎn)品高值化加工與利用研究，E-mail：chunxia.zhou@163.com

1004-1729(2016)04-0356-07

Q2

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0054