丙酮對小球藻和水華微囊藻的生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

李玲， 王俊英

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021)

丙酮對小球藻和水華微囊藻的生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

李玲， 王俊英

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院， 福建 廈門 361021)

以小球藻和水華微囊藻細(xì)胞的生長狀況、光合作用參數(shù)、葉綠素a質(zhì)量濃度的變化作為指標(biāo)，研究不同體積分?jǐn)?shù)的丙酮對2種藻類的毒性效應(yīng).結(jié)果表明：體積分?jǐn)?shù)為0.000 5%～0.500 0%的丙酮對小球藻和體積分?jǐn)?shù)為0.000 5%～0.050 0%的丙酮對水華微囊藻均不同程度地促進(jìn)藻細(xì)胞生長，對藻類的葉綠素a無影響，明顯提高了藻類的最大光合速率(rETRmax)、光能利用率(α)和光適應(yīng)能力(Ik),同時(shí)提高了光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)；丙酮體積分?jǐn)?shù)為5.000 0%的小球藻和丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.500 0%～5.000 0%的水華微囊藻，其藻類光合作用、葉綠素a顯著降低，導(dǎo)致藻類生長嚴(yán)重抑制甚至死亡；丙酮對小球藻和水華微囊藻的最大無影響體積分?jǐn)?shù)(NOEC)分別為0.500 0%，0.050 0%，說明水華微囊藻對丙酮更為敏感. 關(guān)鍵詞： 丙酮; 小球藻; 水華微囊藻; 生長效應(yīng); 葉綠素

在環(huán)境污染物水生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)中，常遇到水溶性差的樣品，因此，需要有機(jī)溶劑助溶.在實(shí)際操作過程中，若有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)太低，樣品溶解不全；若體積分?jǐn)?shù)太高，對水生生物又具有潛在的毒性，使結(jié)果發(fā)生偏差[1].然而，不同的水生生物對同一有機(jī)溶劑的耐受性不同，同一水生生物對不同的有機(jī)溶劑的耐受性也不同[2-3].丙酮由于具有良好的溶解性能，在很多生物毒性實(shí)驗(yàn)測定中作為助溶劑[4-5].因此，如何選擇適宜的丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)尤為重要.小球藻、水華微囊藻等淡水藻類分布廣、對毒物敏感，可在較短時(shí)間內(nèi)評價(jià)化學(xué)物質(zhì)對其世代及種群水平的影響特性[6]，將其作為生物指示劑具有無可比擬的優(yōu)勢.本文研究丙酮對小球藻和水華微囊藻的生長及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響.

1 材料與方法

1.1 供試溶劑及儀器

丙酮(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；PYX-250Q-B型人工氣候箱(福建省廈門精藝興業(yè)科技有限公司)；YXQ-SG41-280型高溫滅菌鍋(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)；SW-CJ-1F型垂直無菌潔凈工作臺(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；Phyto-PAM型葉綠素?zé)晒鈨x(德國Walz公司).

1.2 藻種及其培養(yǎng)

小球藻及水華微囊藻由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供.小球藻采用懸乳劑(SE)培養(yǎng)液培養(yǎng)，水華微囊藻采用BG11培養(yǎng)液培養(yǎng).接種的培養(yǎng)液在121 ℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌20 min，冷卻至室溫.在無菌潔凈工作臺中,紫外滅菌20 min后，進(jìn)行接種.每次實(shí)驗(yàn)開始前，藻種均需經(jīng)過2～3周期的活化，以保證藻種處于最佳生長狀態(tài).培養(yǎng)條件：溫度為25 ℃;濕度為60%;白色日光燈，光暗比為16 h∶8 h，光強(qiáng)為3 700 lx左右;靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)人工搖動3～4次.在藻密度約為1.0×106～3.0×106個(gè)·mL-1時(shí)，加入丙酮，體積分?jǐn)?shù)分別為0.000 5%,0.005 0%,0.050 0%,0.500 0%,5.000 0%.每組樣設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)空白對照組.靜置培養(yǎng)，每天定期搖3～4次，培養(yǎng)11 d.

1.3 藻類生長效應(yīng)的測定

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定藻體細(xì)胞數(shù)量，通過分光光度計(jì)測定藻液在680 nm處的吸光度值，建立細(xì)胞數(shù)與吸光度之間的線性關(guān)系，可得有機(jī)溶劑對藻細(xì)胞數(shù)目的生長影響曲線.

1.4 藻類葉綠素?zé)晒鈪?shù)

采用Phyto-PAM型浮游植物熒光儀監(jiān)測光合性能參數(shù).最大光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)的光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)可看作潛在最大的光合效率，通過飽和脈沖猝滅方法測定.Fv/Fm為

(1)

式(1)中:F0，F(xiàn)m分別為光化光照射下得到的最小和最大的熒光產(chǎn)量.

快速光響應(yīng)曲線(RLC)反映不同實(shí)驗(yàn)條件下浮游植物光和活性的相對變化.擬合模型公式為

(2)

式(2)中:rETR為光合速率，即相對電子傳遞速率；rETRmax為光抑制時(shí)的最大潛在相對電子傳遞速率，可作為一定光強(qiáng)下單位生物量內(nèi)光合作用速率的探針；PAR為光照強(qiáng)度；α為RLC曲線的初始斜率；β為光抑制參數(shù).Ik為半飽和光強(qiáng)，反映了浮游植物光適應(yīng)能力，其計(jì)算公式為

(3)

1.5 溶劑NOEC值的測定

利用藻類細(xì)胞生長曲線，通過方差分析，與空白組沒有顯著性差異的最高體積分?jǐn)?shù)，可以認(rèn)為是最大無影響體積分?jǐn)?shù)(NOEC)[7].

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Office Excel 和Origin 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的圖表分析，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮對小球藻和水華微囊藻藻細(xì)胞生長的影響

丙酮對小球藻和水華微囊藻藻細(xì)胞生長的影響,如圖1所示.圖1中:數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，P<0.05,下同.由圖1(a)可知：當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.000 5%～0.500 0%時(shí)，小球藻的藻細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間延伸呈現(xiàn)穩(wěn)步增長的趨勢；當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)低于5.000 0%時(shí)，在第1～11天，對藻體抑制效應(yīng)明顯，抑制率達(dá)86%，與其他組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).經(jīng)方差分析可得：丙酮對小球藻NOEC為0.500 0%.由圖1(b)可知：當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.000 5%～0.050 0%，促進(jìn)作用明顯，最大促進(jìn)率達(dá)14%；而當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.500 0%～5.000 0%，丙酮對水華微囊藻抑制效應(yīng)強(qiáng)烈；此時(shí)，0.500 0%，5.000 0%的丙酮對藻體生長的抑制率分別達(dá)到84%，92%.經(jīng)方差分析可得：丙酮對水華微囊藻NOEC值為0.05%.這說明與小球藻相比，水華微囊藻對丙酮具有更高的敏感性.

(a) 小球藻 (b) 水華微囊藻圖1 丙酮對小球藻和水華微囊藻細(xì)胞數(shù)目的影響Fig.1 Effect of acetone on cell number of Chlorella vulgaris and Microcystis flos-aquae

2.2 丙酮對小球藻和水華微囊藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的的影響

2.2.1 丙酮對Fv/Fm的影響Fv/Fm是反應(yīng)脅迫對浮游植物的影響研究中重要的衡量標(biāo)準(zhǔn)[8]，該值的改變可以靈敏地反應(yīng)環(huán)境因子對于藻類而言是否適宜[9].丙酮對小球藻和水華微囊藻最大光合作用效率(Fv/Fm)的影響，如圖2所示.由圖2(a)可知：當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為5.000 0%時(shí)，小球藻的Fv/Fm顯著降低(P<0.05)，在第5天后，0.050 0%，0.500 0%處理組的Fv/Fm顯著高于其他處理組及空白組(P<0.05)；0.000 5%，0.005 0%處理組與空白組無顯著差異(P>0.05).

由圖2(b)可知：從第1天開始，丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.500 0%，5.000 0%時(shí)，顯著降低了水華微囊藻的Fv/Fm(P<0.05)，尤其是5.000 0%處理組；第3天后，其值降為零.實(shí)驗(yàn)期間，0.000 5%～0.050 0%處理組的Fv/Fm均與空白組無顯著差異(P>0.05).

(a) 小球藻 (b) 水華微囊藻圖2 丙酮對小球藻和水華微囊藻最大光合作用效率的影響Fig.2 Effect of acetone on Fv/Fm of Chlorella vulgaris and Microcystis flos-aquae

2.2.2 丙酮對快速光響應(yīng)曲線的影響 通常情況下，快速光曲線與放氧量間有非常好的線性關(guān)系，能較好地反映植物的光合作用活性變化情況.在第1，5，9天，丙酮對小球藻和水華微囊藻光響應(yīng)曲線的影響，如圖3所示.由圖3(a)，(c)，(e)可知：丙酮體積分?jǐn)?shù)為5.000 0%時(shí)，小球藻rETR值顯著降低(P<0.05)；體積分?jǐn)?shù)為0.000 5%，0.005 0%時(shí)，在暴露期間與空白組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著暴露時(shí)間的加長，體積分?jǐn)?shù)為0.050 0%，0.500 0%條件下，小球藻rETR值增加趨勢明顯.

由圖3(b)，(d)，(f)可知：丙酮體積分?jǐn)?shù)為5.000 0%時(shí)，水華微囊藻的rETR值顯著降低；體積分?jǐn)?shù)為0.500 0%時(shí)，第1天與空白組無顯著差異，隨著暴露時(shí)間的增長，rETR值顯著降低(P<0.05)；其余處理組在實(shí)驗(yàn)暴露期間與空白組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).

(a) 小球藻(第1天) (b) 水華微藻(第1天)

(c) 小球藻(第5天) (d) 水華微藻(第5天)

(e) 小球藻(第9天) (f) 水華微藻(第9天)圖3 丙酮對小球藻和水華微囊藻快速光響應(yīng)曲線的影響Fig.3 Effect of acetone on rapid light response curves of Chlorella vulgaris and Microcystis flos-aquae

2.2.3 丙酮對葉綠素光合作用參數(shù)的影響 丙酮對小球藻和水華微囊藻葉綠素光合作用參數(shù)(α，rETRmax，Ik)的影響,如圖4所示.圖4中：*為與空白對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=3).由圖4(a),(c),(e)可知：暴露第3天后，丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.050 0%，0.500 0%時(shí)，小球藻α值均高于空白組；0.000 5%，0.005 0%處理組與空白組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；體積分?jǐn)?shù)為0.005 0%～0.500 0%時(shí)，從第3天開始，小球藻rETRmax測量值均顯著增加(P<0.05)；體積分?jǐn)?shù)為0.000 5%時(shí)，在暴露期間均與空白組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.在暴露期間，0.000 5%～0.500 0%處理組的小球藻光合參數(shù)Ik值均大于空白組,而5.000 0%處理組則顯著降低.

(a) 小球藻(第1天) (b) 水華微藻(第1天)

(c) 小球藻(第5天) (d) 水華微藻(第5天)

(e) 小球藻(第9天) (f) 水華微藻(第9天)圖4 丙酮對小球藻和水華微囊藻光合作用參數(shù)的影響Fig.4 Effect of acetone on photosynthetic parameters of Chlorella vulgaris and Microcystis flos-aquae

由圖4(b),(d),(f)可知：0.000 5%～0.050 0%處理組的水華微囊藻α，rETRmax，Ik均表現(xiàn)出前增后降的趨勢;α在整個(gè)暴露期間內(nèi)均與空白組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；rETRmax，Ik在前5 d高于空白組，之后其值降低,0.500 0%～5.000 0%處理組各參數(shù)值分別在第5天和第3天后顯著降低.

2.2.4 丙酮對小球藻和水華微囊藻葉綠素的影響 實(shí)驗(yàn)最后1 d，測定各處理組藻液的葉綠素a的質(zhì)量濃度(ρ(葉綠素a))，如圖5所示.圖5中：相同字母表示差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05.由圖5(a)可知：丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.000 5%～0.500 0%時(shí)，小球藻葉綠素a質(zhì)量濃度與對照組無明顯差異；丙酮體積分?jǐn)?shù)為5.000 0%時(shí)，小球藻葉綠素a質(zhì)量濃度急劇下降，與對照組相比，減少96.8%.

(a) 小球藻 (b) 水華微藻圖5 丙酮對小球藻和水華微囊藻葉綠素的影響Fig.5 Effect of acetone on chlorophyll in Chlorella vulgaris and Microcystis flos-aquae

由圖5(b)可知：水華微囊藻曲線與小球藻差異性同生長曲線相一致；丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.005 0%～0.050 0%時(shí)，水華微囊藻葉綠素a與對照組無明顯差異；丙酮體積分?jǐn)?shù)為0.500 0%，5.000 0%時(shí)，藻液葉綠素a明顯降低，與對照組相比，分別減少了88.2%，99.7%.

3 討論

研究表明，丙酮對小球藻與水華微囊藻生長都產(chǎn)生低促高抑現(xiàn)象，然而，發(fā)生抑制作用的起始體積分?jǐn)?shù)不同，分別為5.000 0%(小球藻)和0.500 0%(水華微囊藻).這種現(xiàn)象稱為毒物興奮(hormesis)效應(yīng).Morré[10]從分子生物學(xué)的角度對hormesis效應(yīng)進(jìn)行研究，一些低劑量刺激植物生長而高劑量抑制生長的物質(zhì)，如丙酮、苯、二甲苯、氯仿和四氯化碳等在低劑量下能刺激生長，這與NADH氧化酶(NOX)活性有關(guān).NOX與植物細(xì)胞生長速率密切相關(guān)，能促進(jìn)細(xì)胞的分裂速度.在植物體內(nèi)，當(dāng)NOX活性被抑制后，細(xì)胞就不能增大，低劑量的刺激作用能增加NOX活性[11].

體積分?jǐn)?shù)較低的丙酮還可以提高藻類光合作用,提高PS Ⅱ反應(yīng)中心光化學(xué)速率Fv/Fm和光合活性.Stratton等[12]研究丙酮對藻類的影響中發(fā)現(xiàn)，低劑量的丙酮的雙極性分子能改變細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)而提高細(xì)胞膜的滲透性，如提高CO2的擴(kuò)散性可提高光合作用強(qiáng)度，而細(xì)胞膜對CO2的擴(kuò)散性是光合強(qiáng)度最重要的限制因子之一.由此可見，一定體積分?jǐn)?shù)的丙酮，不論是對光合作用的光反應(yīng)階段，還是對暗反應(yīng)階段均有促進(jìn)作用.丙酮為0.000 5%～0.500 0%和0.000 5%～0.050 0%時(shí)，分別提高了小球藻和水華微囊藻的最大光合作用速率和光能利用率，有利于減輕環(huán)境脅迫對光合作用的抑制，以增強(qiáng)光合系統(tǒng)反應(yīng)中心的穩(wěn)定性，有較強(qiáng)的光適應(yīng)能力，從而改善和提高藻類的光合能力，進(jìn)行物質(zhì)積累.而體積分?jǐn)?shù)較高的丙酮有顯著的光合抑制作用，嚴(yán)重?fù)p害了光合器官，導(dǎo)致藻類對光能的吸收、傳遞、轉(zhuǎn)化和電子捕獲等過程也遭到抑制，用于耗散的能量顯著增多，阻礙了藻類生長、光合作用和物質(zhì)的積累.

4 結(jié)束語

分析了丙酮對小球藻和水華微囊藻生長及光合作用的影響，得到丙酮對兩種藻類的NOEC值.這為進(jìn)一步探索丙酮對藻類在生態(tài)毒性研究中的應(yīng)用提供依據(jù).今后的研究的內(nèi)容和目標(biāo)是探索多種溶劑混合使用對藻類產(chǎn)生的聯(lián)合毒性作用，以利于研究多種溶劑聯(lián)合作用對環(huán)境產(chǎn)生的影響.

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(責(zé)任編輯： 錢筠 英文審校： 劉源崗)

Effects of Acetone on Growth and Chlorophyll Fluorescence Parameters ofChlorellavulgarisandMicrocystisflos-aquae

LI Ling, WANG Junying

(College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

The toxic effects of different volume fractions of acetone on algae were studied, using the growth condition, photosynthetic parameters, chlorophyll a mass-concentration ofChlorellavulgarisandMicrocystisflos-aquaeas indexes. The results showed that 0.000 5%-0.500 0% and 0.000 5%-0.050 0% volume fractions of acetone respectively were in varying degrees to promoteChlorellavulgarisandMicrocystisflos-aquaegrowth. Both concentration ranges had no significant effect on the chlorophyll a of algae, while increased the maximum photosynthetic rate (rETRmax), the solar energy utilisation efficiency (α) and the tolerance of algae to strong light (Ik) significantly, as well as improved the photosystem Ⅱ photochemical efficiency (Fv/Fm). When theChlorellavulgariswas at 5.000 0% acetone volume fraction andMicrocystisflos-aquaeat 0.500 0% to 5.000 0% acetone volume fractions, algae photosynthesis and chlorophyll a were reduced obviously, which resulted in severe algal growth inhibition and even death. The corresponding NOEC of acetone was 0.500 0% forChlorellavulgarisand 0.050 0% forMicrocystisflos-aquae, indicating thatMicrocystisflos-aquaewas more sensitive to acetone thanChlorellavulgaris. Keywords： acetone;Chlorellavulgaris;Microcystisflos-aquae; growth effect; chlorophyll

10.11830/ISSN.1000-5013.201701011

2016-06-21

李玲(1983-)，女，講師，博士，主要從事環(huán)境化學(xué)物的毒理學(xué)的研究.E-mail:liling19830826@hqu.edu.cn.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41203077)； 華僑大學(xué)研究生科研創(chuàng)新能力培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(12BS108)

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1000-5013(2017)01-0058-06