紫鉚因通過自噬途徑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

蔡寧宇 潘天龍 李斌 吳登穎 潘駿

紫鉚因通過自噬途徑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

蔡寧宇 潘天龍 李斌 吳登穎 潘駿

目的研究紫鉚因?qū)侨饬黾?xì)胞凋亡及自噬的影響，并探討自噬在紫鉚因抗骨肉瘤中的作用。方法分別以不同濃度紫鉚因作用骨肉瘤細(xì)胞24h和30μmol/L紫鉚因作用骨肉瘤細(xì)胞不同時(shí)間，使用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活性變化；Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3及自噬相關(guān)蛋白p62、LC3、Beclin-1的表達(dá)情況；TUNEL染色檢測骨肉瘤細(xì)胞的凋亡情況；透射電子顯微鏡檢測自噬泡的產(chǎn)生；最后分別用自噬激動劑和自噬抑制劑預(yù)處理后再加入紫鉚因作用于骨肉瘤細(xì)胞，并重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果紫鉚因作用后，骨肉瘤細(xì)胞的活性明顯下降，Bax、Cleaved caspase3、Beclin-1、LC3 II的表達(dá)增加，而Bcl-2、p62的表達(dá)降低，骨肉瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，透射電子顯微鏡觀察到紫鉚因處理組有較多自噬泡產(chǎn)生；使用自噬抑制劑預(yù)處理骨肉瘤細(xì)胞后，紫鉚因?qū)侨饬龅牡蛲鲂Ч荒孓D(zhuǎn)，而使用自噬激動劑預(yù)處理骨肉瘤細(xì)胞后，紫鉚因使骨肉瘤細(xì)胞凋亡的效果進(jìn)一步增強(qiáng)。結(jié)論紫鉚因可以降低骨肉瘤細(xì)胞活性并促進(jìn)其凋亡；同時(shí)紫鉚因可以激活自噬，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

紫鉚因骨肉瘤凋亡自噬

骨肉瘤的發(fā)病率在骨骼惡性腫瘤中居首位，其惡性程度高，易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，進(jìn)展迅速。1982年，Rosen提出新輔助化療的概念，使阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤等藥物[1-2]廣泛應(yīng)用于骨肉瘤治療，患者的5年生存率顯著提高[3-4]。然而骨肉瘤擁有易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移的特性，患者的長期生存率并沒有進(jìn)一步提高[5]。近年來，天然藥物以來源豐富、安全范圍廣、提煉成本低等優(yōu)勢成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。紫鉚因是來源廣泛的多酚類化合物，化學(xué)名2′, 3,4,4′-四羥基查爾酮（2′,3,4,4′-Tetrahydroxychalcone），具有抗腫瘤、抗血管生成、抗氧化等多種生物學(xué)活性，已在多種腫瘤細(xì)胞中（如乳腺癌[6-7]、肝癌[8-9]、肺癌[10]及黑色素瘤[11]等）展現(xiàn)出抗腫瘤特性，但其對骨肉瘤細(xì)胞的作用并未被明確闡明。自噬是溶酶體對受損細(xì)胞器及無功能蛋白進(jìn)行消化的過程[12]，適量激活自噬可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞應(yīng)對外界刺激的能力[13]，過度激活自噬則會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，因此了解自噬激活所起的作用對腫瘤的治療至關(guān)重要。本研究探討紫鉚因?qū)侨饬黾?xì)胞的抗腫瘤作用，進(jìn)一步檢測其對腫瘤細(xì)胞自噬的激活作用并探討自噬的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑骨肉瘤MG63細(xì)胞株購于中科院生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。紫鉚因、雷帕霉素（Rapamycin, Rapa）、6-氨基-3-甲基嘌呤（3-Methyladenine,3MA）均購于美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM基本培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、BCA試劑盒購于中國碧云天公司；TUNEL試劑盒購于瑞士Roche公司；Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3、p62、LC3、Beclin-1抗體均購于美國CST公司；β-actin抗體、山羊抗兔抗體、山羊抗鼠抗體均購于美國Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)骨肉瘤MG63細(xì)胞使用含10%胎牛血清，1%青、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中。