高通量測序技術在苧麻生物學研究中的應用

易浪波，李富，崔國賢

（1.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南吉首416000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學，長沙410128）

高通量測序技術在苧麻生物學研究中的應用

易浪波1，李富1，崔國賢2

（1.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南吉首416000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學，長沙410128）

近10年來以高通量為特征的第二代測序技術迅猛發(fā)展，并被廣泛應用到醫(yī)學，生命科學及農(nóng)業(yè)等領域。新一代測序技術具有成本低、效率高等特點，使得許多非模式生物的基因組和轉錄組從頭測序成為可能。苧麻作為我國傳統(tǒng)的天然纖維作物，其種植面積和產(chǎn)量占全世界的90%以上。解析其性狀的形成發(fā)育機制對于苧麻的分子改良非常重要。近幾年來，為了闡明苧麻性狀的生物學機制，國內(nèi)外多個團隊以轉錄組研究為切入點，通過高通量測序技術對苧麻生物學研究開展了大量的研究。本文從高通量測序技術、苧麻轉錄組研究進展、苧麻重要性狀基因識別、苧麻進化馴化機制研究及分子標記的開發(fā)利用等幾個方面進行了綜述，將為挖掘苧麻重要性狀基因提供理論基礎、為苧麻分子標記輔助選擇提供了大量的可靠標記，高通量測序已經(jīng)推動苧麻性狀生物學研究的快速發(fā)展，也將為苧麻的分子育種研究奠定基礎。

高通量測序；苧麻；轉錄組；基因表達；SSR標記；QTL

引言

DNA測序技術是分子生物學研究中最常用的技術，它的出現(xiàn)極大地推動了生物學的發(fā)展。近十年來，第二代測序出現(xiàn)并快速發(fā)展，催生了生物組學這一新興學科。第二代測序技術最顯著的特征是一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序，其主要測序平臺包括羅氏454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺［1］。第二代測序技術已經(jīng)被廣泛用于生物學研究，包括基因組測序，轉錄組分析，小RNA和長鏈非編碼RNA測序，基因組甲基化分析等。近年來，基于第二代測序技術，許多非模式生物的轉錄組和基因組得到分析，如板栗、珊瑚幼蟲、甘薯、人參根、鷹嘴豆和海帶等［2－6］。苧麻（Boehmeria niveaL.）作為我國特色的天然纖維作物，擁有悠久的種植歷史和成熟的栽培技術，其種植面積和產(chǎn)量占全世界的90%以上，僅次于棉花。從苧麻韌皮提取的纖維不僅可做重要的紡織工業(yè)原料，還具有重要的飼用功能。由于苧麻具有營養(yǎng)生長迅速、根系發(fā)達和無二次污染等特點，還作為一種修復作物被廣泛應用于鎘污染農(nóng)田地的處理。隨著高通量測序技術的發(fā)展，苧麻轉錄組得到廣泛研究。例如，加深對苧麻生長發(fā)育相關機制的了解；苧麻韌皮部纖維形成和發(fā)展相關基因的識別；構建蟲、旱和鎘三大逆境轉錄組表達譜及相關基因挖掘；還有構建遺傳標記圖譜并識別相關QTL等等。這些研究加速了苧麻分子育種，為培育高品質(zhì)的苧麻纖維品種提供理論依據(jù)。

1 高通量測序技術介紹

在測序技術發(fā)展歷程中，高通量測序技術堪稱一個新的里程碑，該技術可以同時對數(shù)百萬個DNA分子進行測序。這使得對一個物種的轉錄組和基因組進行深入細致的分析成為可能，因此高通量測序技術也稱為深度測序（deep sequencing）［7］或下一代測序技術（next generation sequencing，NGS）［8］。目前，高通量測序技術主要是指羅氏454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺組成的第二代測序技術以及HelicosHeliscopeTM、Oxford Nanopore和Pacific Biosciences推出的第三代單分子測序技術。

第二代測序技術開始于2005年454 Life Sciences公司（現(xiàn)已被Roche公司收購）首先推出的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)。此后，Illumina公司（2006）和ABI（2007）公司相繼推出了Solexa和SOLiD（supported oligo ligation detetion）測序技術。它們與焦磷酸測序法的原理類似，核心思想都是邊合成邊測序，即生成新DNA互補鏈時，要么加入的dNTP通過酶促級聯(lián)反應催化底物激發(fā)出熒光；要么直接加入被熒光標記的dNTP或半簡并引物，在合成或連接生成互補鏈時釋放出熒光信號［9］。與此同時進行熒光標記的成像檢測，從而獲得測序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測不斷重復，最后經(jīng)過計算機分析獲得完整的DNA序列信息。第二代測序技術避免了電泳過程，且高通量數(shù)據(jù)基于芯片分析，從而大大節(jié)省時間和成本。羅氏454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺各有優(yōu)缺點。454測序技術具備更長的讀長，它的平均讀長在700－1000 bp左右，最高達1 kp。因此，454平臺比較適合對未知基因組從頭測序，但是在判斷連續(xù)單堿基重復區(qū)時準確度不高，且價格比其他技術高很多。Solexa測序技術擁有較低的成本和高性價比優(yōu)點。它的低樣品需求，簡單的流程，高質(zhì)量的數(shù)據(jù)以及應用靈活性使它從幾大測序技術中脫穎而出。SOLiD測序讀長較短，但具有更高精度，適合用于SNP檢測等。

2 苧麻的轉錄組研究

高通量測序技術的發(fā)展，使非模式生物的轉錄組和基因組獲得成為可能。苧麻作為一種重要的天然纖維作物，了解其韌皮部纖維生長發(fā)育的分子機制具有重要的研究價值。Liu等率先開展了苧麻轉錄組測序，用Illumina測序獲得43990條基因表達序列，其中34192（77.7%）條基因序列被注釋了功能［10］。

Chen等運用454公司的GS FLX測序平臺對苧麻韌皮部不同生長階段的轉錄組進行了測序，獲得了58396條基因［11］?；蚬δ茏⑨岋@示苧麻和葡萄親緣關系最近，有32.05%的基因顯著同源。另外，分析四個生長階段的基因表達水平，共篩選到780個差異表達基因，其中13個基因在韌皮部頂端組織中特異高表達，它們分布于3個基因家族，分別是4個纖維素合成酶家族，3個擴張蛋白基因家族及6個木葡聚糖內(nèi)糖基轉移酶／水解酶家族，推測它們可能與苧麻纖維形成相關。苧麻轉錄組的測序和相關基因的發(fā)現(xiàn)，有助于進一步理解苧麻纖維發(fā)育形成的分子機制，為培育高品質(zhì)苧麻提供理論依據(jù)。

3 苧麻重要基因識別

3.1 全基因組表達譜識別逆境應答基因

干旱是影響苧麻生產(chǎn)的主要環(huán)境因素。旱逆境下的苧麻株型矮小，纖維產(chǎn)量顯著降低。為此，Liu等系統(tǒng)的研究旱逆境苧麻的形態(tài)，生理及基因表達特征［12，13］。通過生理學研究，他們發(fā)現(xiàn)旱脅迫苧麻體內(nèi)的活性氧含量升高，各種抗氧化酶活性顯著增強，丙二醛等生理指標也發(fā)生明顯變化，而當施加外源赤霉素則可以改善苧麻的耐旱性［12］。利用Illumina測序，Liu等首次開展了旱脅迫苧麻的全基因組表達譜分析，共識別1516個旱逆境應答基因，其中24個為轉錄因子編碼基因［13］。qRT－PCR進一步證實了其中12個旱逆境應答的轉錄因子編碼基因表達受旱逆境調(diào)控。在這12個轉錄因子基因中，其中一個基因為DELLA蛋白編碼基因，其能降解赤霉素。由于赤霉素是促進植物生長重要激素，該團隊提出赤霉素代謝相關基因的表達變化是導致逆境苧麻的重要原因。之后，An等也用聚乙二醇（PEG）處理苧麻根和葉，以模擬苧麻的干旱脅迫，并開展Illumina測序，共識別到25個旱逆境相關的轉錄因子編碼基因［14］。除了挖掘苧麻自身逆境應答因子，An［15］等還通過導入外源耐旱基因以改良苧麻耐旱性。An等將水稻SNAC1基因成功轉化到苧麻中，使得轉基因植株耐旱和耐鹽能力得到顯著提高［15］。

根腐線蟲（Pratylenchuscoffeae）則是導致苧麻減產(chǎn)的主要病害，了解苧麻對害蟲的分子防御機制有利于提高苧麻的抗病性。Zhu等率先開展了根腐線蟲害苧麻的轉錄組譜研究，共識別777個受此病害調(diào)控表達的基因，并發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸代謝、類胡蘿卜素生物合成和苯丙素生物合成等三個代謝途徑顯著受到了此病害的影響［16］。另外，Yu等利用根腐線蟲高抗和易感品種分別開展了蟲害逆境下的苧麻轉錄組譜研究，但僅僅137個蟲害逆境應答基因被識別，且發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑可能在線蟲抗性中發(fā)揮重要作用［17］。苧麻夜蛾是一種重要的經(jīng)濟作物害蟲，對苧麻生產(chǎn)也具有一定的影響。Zeng等對夜蛾感染的苧麻進行了轉錄組分析，對感染和未感染苧麻葉進行測序和轉錄組比較，共發(fā)現(xiàn)了750個上調(diào)表達和1230個下調(diào)表達基因［18］。

我國南方地區(qū)土壤重金屬污染嚴重，其中鎘是最主要的污染源。苧麻具有生長快、生物產(chǎn)量大、抗逆性好、鎘金屬富集能力強等特點，被認為是理想的鎘污染土壤修復作物。但當土壤鎘含量達到一定濃度時，其生長仍然被抑制，相應的分子機制尚不清楚。因此，Liu等開展了鎘脅迫苧麻的轉錄組譜研究，在鎘脅迫苧麻和對照苧麻間共篩選到155個差異表達基因，并發(fā)現(xiàn)2個GA2氧化酶基因在鎘逆境苧麻中表達水平顯著上調(diào)［19］。由于GA2氧化酶能夠將活性赤霉素轉化成非活性狀態(tài)，因此他們推測GA2氧化酶基因的上調(diào)表達可能與鎘逆境苧麻株型矮小相關。另外，She等也利用Soleax測序構建了鎘脅迫和對照苧麻的根系基因表達譜，共篩選到3887個差異化表達基因［20］。

綜上所述，根腐線蟲害、干旱和鎘逆境是苧麻生產(chǎn)的主要生物和非生物逆境，能顯著抑制苧麻生長，導致作物株型矮小、纖維產(chǎn)量降低。為此，Liu及其團隊系統(tǒng)研究了逆境苧麻的形態(tài)、生理特征，率先完成了這些逆境下苧麻的全基因組表達譜分析，并提出旱、鎘逆境苧麻株型矮小的分子機制。這些研究成果極大的豐富了我們對苧麻的逆境應答及耐受機制的認識，而大量逆境相關基因的識別也為苧麻的抗逆分子育種提供了基因資源。由于該團隊在逆境苧麻生物學研究領域的重要突破，他們的研究也成功帶動了國內(nèi)外其它團隊在此領域的相關研究。

3.2 性狀相關基因或小RNA的識別

苧麻是重要的天然纖維作物，纖維發(fā)育相關基因的挖掘將為解析該性狀的形成和發(fā)育機制提供基礎。纖維素合成酶是植物纖維合成的關鍵酶，基于轉錄組序列，Liu等在苧麻中共識別了51個纖維素合酶基因，其中36個可能與其韌皮纖維發(fā)育相關［10］。Chen等構建了韌皮部不同發(fā)育階段的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)780個差異表達基因，其中13個為纖維素合成酶家族基因［11］。NAC蛋白是植物特有的轉錄因子，對植物的纖維發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。Liu等共識別了32個苧麻NAC基因，并發(fā)現(xiàn)其中5個與模式植物中調(diào)控纖維發(fā)育的NAC蛋白高度同源，推測它們也可能參與苧麻的纖維發(fā)育調(diào)控［21］。Chen等構建了苧麻韌皮部和木質(zhì)部的轉錄組譜，發(fā)現(xiàn)Pol II和Pol III亞基及半乳糖代謝途徑基因在韌皮部高表達，表明高活性的RNA合成和半乳糖代謝途徑可能保證韌皮部纖維的合成［22］。此外，小RNA也可能參與了苧麻的韌皮纖維發(fā)育調(diào)控。Wang等構建了苧麻纖維伸長、胞壁增厚和端壁溶解階段小RNA表達譜，并在纖維伸長增厚和端壁溶解階段分別識別了150和148個小RNA，推測他們可能也與苧麻的纖維發(fā)育相關［23］。

轉錄因子對于調(diào)控植物的逆境抗性具有重要的作用?；谵D錄組序列，大量苧麻轉錄因子編碼基因也得以發(fā)現(xiàn)。Liu等在苧麻中共發(fā)現(xiàn)了32個全長的NAC蛋白編碼基因，其中24、2和1個NAC基因分別在莖木質(zhì)部、葉和花呈現(xiàn)高表達，并且有14、11和4個NAC基因分別受旱、鎘和根腐線蟲害逆境應答調(diào)控［23］。Zheng等對苧麻在根腐線蟲害、旱和鎘三大逆境下的轉錄因子基因進行研究分析，發(fā)現(xiàn)了MYB，AP2／ERF，bZIP，COL和HD－ZIP等6個家族的179個基因中，96個基因的表達能受其中一種逆境調(diào)控，而54個基因的表達則能受到兩種逆境同時調(diào)控［24］。

COL家族是一個與擬南芥CONSTANS（CO）蛋白相類似的鋅指類蛋白轉錄因子家族，該家族中多個家族參與了植物的開花調(diào)控。Liu等從苧麻轉錄組中識別了6個COL基因，其中BnCOL2蛋白與CO蛋白高度同源［25］。亞細胞定位證實了BnCOL2蛋白主要在細胞核中發(fā)揮作用。而且光周期實驗表明，在長日照和短日照條件下BnCOL2基因的表達均呈現(xiàn)晝夜節(jié)律，且在長、短日照條件下，其呈現(xiàn)不同的節(jié)律性表達變化。據(jù)此推測，BnCOL2可能與CO功能類似，是控制苧麻開花性狀的侯選基因［25］。

谷氨酰胺合成酶在高等植物中參與氮代謝，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。Zheng等首次發(fā)現(xiàn)了3個苧麻谷氨酰胺合酶家族基因（BnGS），通過表達模式分析顯示BnGS1－1和BnGS2在葉生長過程相對富集表達，說明它們在N攝取吸收中有重要作用［26］。BnGS1－2在韌皮部和木質(zhì)部高表達，暗示可能與纖維的形成發(fā)展有關。BnGS基因的識別有利于進一步了解苧麻的飼用特性。

SAUR基因是生長素早期應答基因。Huang等首先在蕁麻科植物中識別到62個桑樹SAUR基因、56個大麻SAUR基因和71個苧麻SAUR基因［27］。隨機選取15個苧麻SAUR基因進行表達分析顯示，SAUR基因在苧麻的生長素生長調(diào)控，干旱和高溫逆境應答調(diào)控等多個生物學過程中具有功能［27］。

4 苧麻進化馴化機制研究

苧麻在我國已經(jīng)有4700余年的栽培歷史，但其確切進化馴化機制還不清楚。為此，Liu等開展了比較轉錄組研究以揭示其進化選擇模式［28］。對野生青葉苧麻和栽培種苧麻中苧1號進行轉錄組測序，分別獲得59246和56932條表達基因序列。兩轉錄組序列比較分析發(fā)現(xiàn)，兩種間共識別到10745個直系同源基因，其中85個基因受到負向選擇，13個基因受到正向選擇。這98個基因大多數(shù)與抗病性和非生物逆境有關，說明生物和非生物脅迫是馴化的主要因素。另外，研究中還發(fā)現(xiàn)兩個與苧麻纖維產(chǎn)量相關基因呈現(xiàn)快速進化，這很可能是人類祖先馴化選擇的結果?？梢姡吧r麻向栽培種進化是在自然環(huán)境和人工選擇的雙重選擇壓力下進行的［28］。

5 分子標記開發(fā)和應用

苧麻的主要農(nóng)藝性狀都屬于復雜的數(shù)量性狀，在后代中呈現(xiàn)連續(xù)的表型變異，其遺傳基礎難以界定。隨著分子標記的出現(xiàn)，使數(shù)量性狀基因位點（QTL）的遺傳定位成為可能。SSR標記具有多態(tài)性好，基因組位置易于檢測等優(yōu)點，已被廣泛用于作物的遺傳圖譜構建，種質(zhì)資源鑒定，分子育種等［29］。但一直以來，苧麻中可用的SSR分子標記非常匱乏，嚴重的阻礙了苧麻的遺傳及育種研究。為此，Liu等利用轉錄組序列大規(guī)模開發(fā)了苧麻的SSR標記，使得苧麻中可用的SSR標記由之前的不足100個增加到1827個［29］。這些標記的開發(fā)為苧麻的遺傳及分子育種研究提供了堅實的分子標記基礎。之后，Chen等也利用苧麻纖維轉錄組序列開發(fā)了苧麻SSR標記，使得標記數(shù)目進一步增加到4230個［30］。

為了開展苧麻農(nóng)藝性狀的遺傳分析，Liu等利用扦插繁殖技術構建了苧麻F2無性分離群體。基于此群體，該團隊繪制了苧麻首張SSR標記遺傳圖譜，并對纖維產(chǎn)量等性狀進行QTL定位分析，共發(fā)現(xiàn)了33個纖維產(chǎn)量相關QTL［31］。苧麻是高度雜合的物種，自交會導致纖維產(chǎn)量等性狀的衰退，甚至植株的死亡，因此，苧麻性狀具有雜種優(yōu)勢。通過對纖維產(chǎn)量相關性狀進行遺傳分析，該團隊發(fā)現(xiàn)大量纖維產(chǎn)量相關的QTL具有超顯性效應，從而他們提出大量超顯性QTL的存在是苧麻產(chǎn)量相關性狀雜種優(yōu)勢的遺傳基礎［31］。此外，Liu等也對4個開花相關的性狀進行了QTL分析，共檢測到29個QTL［32］。可見，Liu及其團隊在苧麻的數(shù)量遺傳學研究方面已取得了好的突破，他們率先繪制了苧麻的分子標記遺傳圖譜，并完成了多個農(nóng)藝性狀的QTL定位。由于大量QTL的識別能為苧麻的分子標記輔助選擇育種提供了目標位點，他們的研究也極大的推動了苧麻分子育種的發(fā)展。

6 問題與展望

苧麻是我國特色的天然纖維作物，在我國已有數(shù)千年的栽培歷史。近年來苧麻飼用功能的開發(fā)，進一步突顯了該作物的重要性。然而，受制于苧麻遺傳和分子生物學學科的發(fā)展，苧麻的分子育種工作一直未起步。近10年來，高通量測序技術快速發(fā)展，并應用于苧麻的遺傳和生物學研究中，使得苧麻遺傳和分子生物學學科快速發(fā)展，這為發(fā)展苧麻的分子育種提供新的契機。但是，高通量測序技術在推動苧麻生物學研究中的作用還沒有完全釋放，在推動苧麻生物學研究及分子育種研究，仍還有許多工作需要開展，其主要表現(xiàn)在以下兩個方面。

（1）苧麻基因組特征仍未闡明。一般來講，基因組測序的完成及序列的釋放，將能極大的推動物種的遺傳，分子生物學和分子育種工作的開展。但是，目前的苧麻的基因組研究還沒有完成，很大程度上限制苧麻生物學的研究。

（2）苧麻生物組學研究仍然沒有起步。變異組學和野生種泛基因組研究將能夠廣泛的挖掘作物的優(yōu)異基因資源，以推動作物性狀生物學機制研究。目前，高通量序列分析技術使得水稻，大豆，黃瓜等主要作物都相繼完成了相關的研究，但苧麻中相關的研究仍然沒有開展。

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［32］Zhu S，Zheng X，Dai Q，et al.Identification of quantitative trait loci for flowering time traits in ramie（Boehmerianivea L. Gaud）［J］.Euphytica，2016，210（3）：367-374.

App lication of High－throughput Sequencing Technology in the Research of Ram ie（Boehmerianivea L．Gaud）Biology

YILangbo1，LIFu1，CUIGuoxian2
（1.College of Biology and Environmental Sciences，Jishou University，Jishou，Hunan 416000，China；2.Hunan Agricultural University，Changsha，410128，China）

In the past ten years，the high－throughput next－generation sequencing（NGS）technology appeared and developed rapidly，and itwaswidely applied inmedicine，life sciences，agriculture and so on.The NGS technology shows several advantages than traditional Sanger sequence，such as low－costand high efficiency，whichmade thede novoassembly of genome and transcricptome become feasible in non－model species.Ramie is an important natural fiber crop in China，and both its fiber yield and plant acreage in China accounted for 90%of the global yield and acreage.It is of crucial importance to analyze its formationmechanism of traits formolecular improvement.In recent years，domestic and international scientists carried a great deal of studies for the ramie biology based on the transcriptome analysis by high－throughput NGS technology in order to understand the biologicalmechanism of traits.In conclusion，the NGS technology has not only greatly promoted the development of trait biology，but also provided a basis formolecular breeding in ramie.

high－throughput next－generation sequencing technology；ramie；transcriptome；gene expression；SSR marker；QTL

S563.1

A

1671－3532（2017）02－0088－06

2017－01－17

易浪波（1980－），女，湖南漣源人，碩士，高級實驗師，主要從事植物學研究。E－mail：26063568＠qq.com

*通訊作者：崔國賢（1963－），男，教授，博士／博士生導師，從事苧麻栽培和遺傳育種研究。E－mail：gx－cui＠163.com