亞致死濃度甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾蛋白質(zhì)和糖類含量的影響

張?zhí)熹?，常曉麗，滕海媛，袁永達(dá)，王冬生

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海東保農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海 201106）

亞致死濃度甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾蛋白質(zhì)和糖類含量的影響

張?zhí)熹?，常曉麗，滕海媛，袁永達(dá)*，王冬生*

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海東保農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海 201106）

研究了亞致死濃度甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾幼蟲血淋巴蛋白質(zhì)和糖類含量的影響，結(jié)果表明：甲氧蟲酰肼處理甜菜夜蛾幼蟲72 h后，能顯著提高血淋巴中的蛋白質(zhì)含量，并且隨著處理濃度的增加而升高，LC40處理組蛋白含量最高為6.74 mg/mL。此外亞致死濃度甲氧蟲酰肼處理后對(duì)甜菜夜蛾還存在一定的后續(xù)影響，4齡時(shí)，LC10、LC20和LC30處理組的蛋白質(zhì)濃度顯著高于對(duì)照組，而LC40處理組的蛋白質(zhì)濃度在各處理組中最低為7.61 mg/mL。血淋巴SDS-PAGE分析也表明，LC10、LC20和LC30處理組幾條主要蛋白條帶含量要明顯高于對(duì)照組。5齡時(shí)LC10、LC20處理組的蛋白含量要顯著低于LC30、LC40處理組和對(duì)照組。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，5齡血淋巴中最主要蛋白條帶（85.1 KD）含量在LC10、LC20處理組中要明顯低于對(duì)照組和其他處理組。對(duì)甜菜夜蛾幼蟲血淋巴中總糖含量測(cè)定結(jié)果表明，亞致死濃度的甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾幼蟲血淋巴中總糖含量的升高具有促進(jìn)作用。殺蟲劑處理72 h后，各處理組的總糖含量要顯著高于對(duì)照組。甲氧蟲酰肼處理結(jié)束后，對(duì)甜菜夜蛾幼蟲后續(xù)不同發(fā)育階段的總糖含量也有一定持續(xù)影響，如4齡和5齡各處理組的糖含量都明顯高于對(duì)照組。

甜菜夜蛾；甲氧蟲酰肼；亞致死濃度；蛋白質(zhì)；糖類

甲氧蟲酰肼作為雙酰肼類昆蟲生長調(diào)節(jié)劑具有與常規(guī)殺蟲劑不同的作用方式，可模擬昆蟲蛻皮激素的功能，通過與蛻皮激素受體結(jié)合，誘導(dǎo)昆蟲早熟蛻皮，從而導(dǎo)致昆蟲死亡［1］。以往的研究表明甲氧蟲酰肼除了對(duì)昆蟲生長繁殖等方面具有一定的亞致死效應(yīng)外［2-3］，還能影響昆蟲體內(nèi)一些相關(guān)酶系的活性［4-6］。例如張?zhí)熹龋?］前期對(duì)甲氧蟲酰肼亞致死效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的甲氧蟲酰肼能影響甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）的生長繁殖以及食物利用率和轉(zhuǎn)化率等相關(guān)指標(biāo)。任龍等［5］研究發(fā)現(xiàn)亞致死劑量甲氧蟲酰肼對(duì)棉鈴蟲Helicoverpa armigera的多功能氧化酶（MFO）、酯酶（EST）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）的比活力變化具有一定的影響。然而殺蟲劑對(duì)昆蟲的亞致死作用是多方面多層次的，除了上述亞致死作用外，殺蟲劑還能影響昆蟲體內(nèi)一些生物大分子的含量［7-8］。如張潔等［8］研究發(fā)現(xiàn)亞致死劑量的烯啶蟲胺處理褐飛虱Nilaparvata lugens后，能改變其體內(nèi)蛋白質(zhì)、可溶性糖等物質(zhì)的含量。甲氧蟲酰肼作為一種防治甜菜夜蛾的常用藥劑，對(duì)甜菜夜蛾這方面的影響還未見報(bào)道，因此為了進(jìn)一步全面闡明甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾的毒力作用，本研究探討了亞致死劑量的甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾血淋巴中總蛋白、糖類等相關(guān)物質(zhì)含量的影響。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)昆蟲

所用甜菜夜蛾為室內(nèi)在不接觸農(nóng)藥條件下多年飼養(yǎng)的種群，飼養(yǎng)條件為溫度27℃±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光照L∶D為14∶10。

1．2 藥劑處理

根據(jù)前期生測(cè)結(jié)果，以LC10、LC20、LC30和LC40值作為亞致死濃度，取新鮮洗凈的甘藍(lán)葉片，在不同的亞致死濃度甲氧蟲酰肼藥液中浸10 s，室溫晾干，分別置于養(yǎng)蟲瓶中，接入大小一致的2齡幼蟲，每處理共300頭幼蟲。以未用殺蟲劑處理葉碟作對(duì)照，共5個(gè)處理。處理72 h后將存活幼蟲接入裝有不含殺蟲劑飼料的玻璃試管中單頭飼養(yǎng)。

1．3 樣品制備

參照Tojo等［9］的方法，于甲氧蟲酰肼處理72 h，以及存活幼蟲發(fā)育至4齡、5齡時(shí)分別取樣。每處理取幼蟲20—30頭，重復(fù)4次。剪去幼蟲腹足，取血淋巴于預(yù)冷的放有少許苯基硫脲的1.5 mL離心管中，4℃5 000 g離心10 min，取上清液用磷酸鹽緩沖液稀釋4倍，儲(chǔ)存在－75℃，供試。

1．4 甜菜夜蛾血淋巴蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析及含量測(cè)定

參考李愷等［10］的方法，采用不連續(xù)體系，分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為3%，在20 mA恒定電流下進(jìn)行，采用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。血淋巴總蛋白含量測(cè)定參照Bradford考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定［11］。

1．5 甜菜夜蛾血淋巴總糖含量測(cè)定

按照肖猛［12］的方法，制備各樣品的無蛋白血清。然后采用蒽酮法［13］，于620 nm處比色檢測(cè)通過制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各處理的總糖含量。

1．6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0等軟件進(jìn)行分析，各處理間差異采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2．1 甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾血淋巴蛋白質(zhì)含量的影響

亞致死濃度LC10、LC20、LC30和LC40甲氧蟲酰肼處理甜菜夜蛾2齡幼蟲，對(duì)其血淋巴中的蛋白質(zhì)含量影響從圖1中可見，甲氧蟲酰肼處理72 h后，除LC10處理組外，其他各組的蛋白質(zhì)含量都要顯著高于對(duì)照組。并且隨著處理濃度的增加，血淋巴中蛋白質(zhì)濃度逐漸升高，處理72 h時(shí)LC40處理組蛋白含量最高為6.74 mg/mL，顯著高于其他各處理組和對(duì)照組。由此可見，一定濃度的甲氧蟲酰肼處理甜菜夜蛾幼蟲能增加其血淋巴中的蛋白質(zhì)含量。

此外，當(dāng)甲氧蟲酰肼處理結(jié)束后對(duì)甜菜夜蛾還存在一定的后續(xù)影響，并且與甜菜夜蛾齡期和前期的處理劑量相關(guān)，從圖2中可見，當(dāng)甜菜夜蛾發(fā)育至四齡時(shí)，LC10、LC20和LC30處理組的蛋白質(zhì)濃度顯著高于對(duì)照組。而LC40處理組的蛋白質(zhì)濃度在各處理組中最低為7.61 mg/mL。從4齡幼蟲血淋巴SDS-PAGE電泳圖（圖3）也可看出，LC10、LC20和LC30處理組幾條主要蛋白條帶含量要明顯高于對(duì)照組，而在4齡幼蟲血淋巴中含量最高的蛋白條帶（151.7 KD）在LC40處理組（泳道5）其含量要顯著低于各處理組和對(duì)照組。這與上述蛋白含量測(cè)定結(jié)果相一致。對(duì)5齡甜菜夜蛾幼蟲血淋巴中蛋白質(zhì)含量分析結(jié)果表明，LC10、LC20處理組的蛋白含量要顯著低于LC30、LC40處理組和對(duì)照組，LC30處理組的蛋白含量最高為26.91 mg/mL。從各處理組5齡血淋巴SDS-PAGE電泳圖（圖4）也可見，5齡幼蟲血淋巴中最主要蛋白條帶（85.1 KD）含量在LC10、LC20處理組中（泳道2、3）要明顯低于對(duì)照組和其他處理組。由此可見，前期甲氧蟲酰肼處理劑量的不同，對(duì)甜菜夜蛾幼蟲血淋巴中蛋白含量的后續(xù)影響也存在一定差異。

圖1 甲氧蟲酰肼處理72 h血淋巴中的蛋白質(zhì)含量Fig．1 The content of protein in hemolymph treated with methoxyfenozide for 72 hours

圖2 不同蟲齡血淋巴中的蛋白質(zhì)含量Fig．2 The content of protein in hemolymph at different instars

圖3 4齡血淋巴蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖Fig．3 SDS-PAGE of hemolymph proteins at 4th instar

圖4 5齡血淋巴蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖Fig．4 SDS-PAGE of hemolymph proteins at 5th instar

2．2 甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾幼蟲血淋巴總糖含量的影響

亞致死濃度甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾幼蟲血淋巴中總糖含量的影響從圖5中可見，殺蟲劑處理72 h后，各處理組的總糖含量要顯著高于對(duì)照組。并且高濃度處理組（LC30、LC40處理組）的糖含量要高于低濃度處理組（LC10、LC20處理組）?？梢妬喼滤罎舛鹊募籽跸x酰肼對(duì)甜菜夜蛾幼蟲血淋巴中總糖含量的升高具有一定的促進(jìn)作用。此外，從圖6中還可發(fā)現(xiàn)，甲氧蟲酰肼處理結(jié)束后，對(duì)甜菜夜蛾幼蟲后續(xù)不同發(fā)育階段的總糖含量也有一定影響。如在甜菜夜蛾幼蟲4齡和5齡時(shí)，各處理組的糖含量都明顯高于對(duì)照組，表明即使在甲氧蟲酰肼處理結(jié)束后，仍能增加甜菜夜蛾幼蟲血淋巴總糖含量，具有一定的持續(xù)效應(yīng)。

圖5 甲氧蟲酰肼處理72 h血淋巴中的糖含量Fig．5 The content of carbohydrate in hemolymph treated with methoxyfenozide for 72 hours

圖6 不同蟲齡血淋巴中的糖含量Fig．6 The content of carbohydrate in hemolymph at different instars

3 討論

殺蟲劑對(duì)昆蟲的亞致死效應(yīng)研究是昆蟲毒理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。殺蟲劑施用后，隨著時(shí)間推移或昆蟲個(gè)體之間接觸農(nóng)藥劑量的不同，導(dǎo)致亞致死劑量殺蟲劑對(duì)昆蟲生長繁殖、生理生化以及行為等方面產(chǎn)生一系列的亞致死效應(yīng)［14］。對(duì)殺蟲劑亞致死效應(yīng)的研究有助于全面掌握殺蟲劑對(duì)昆蟲的毒力作用，從而指導(dǎo)殺蟲劑田間的合理使用。昆蟲體內(nèi)血淋巴中含有與其生殖、變態(tài)等重要功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)、糖類等生物大分子。這些物質(zhì)含量的改變必然會(huì)對(duì)昆蟲的生長繁殖等性能產(chǎn)生一系列影響。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，亞致死濃度甲氧蟲酰肼處理甜菜夜蛾2齡幼蟲72 h后，除了LC10處理組外，其他各組的幼蟲血淋巴中可溶性蛋白質(zhì)較對(duì)照有顯著增加。以往的研究中也有相似的研究結(jié)果，如王紅等［15］用吡蟲啉致死中濃度處理大豆蚜成蟲，可明顯升高體成蟲體內(nèi)可溶性蛋白含量。廖月枝等［16］用甲氧蟲酰肼處理舞毒蛾4齡幼蟲12 h后能明顯增加血淋巴中的某些蛋白質(zhì)的表達(dá)量，這些均與本研究結(jié)果一致。此外本研究還探討了甲氧蟲酰肼對(duì)甜菜夜蛾總蛋白含量的后續(xù)影響，發(fā)現(xiàn)在不同幼蟲生長發(fā)育時(shí)期受影響的蛋白條帶不同，如4齡主要是影響分子量為151.7 KD的蛋白含量。而在5齡時(shí)則影響分子量為85.1 KD的蛋白含量。甲氧蟲酰肼導(dǎo)致幼蟲血淋巴中蛋白含量的增加，這一方面與其能誘導(dǎo)甜菜夜蛾早熟蛻皮的相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)有關(guān)，同時(shí)可能為與抗藥性相關(guān)酶系以及同工酶的表達(dá)所致［1，5］。而甲氧蟲酰肼影響蛋白質(zhì)條帶的種類、性質(zhì)以及作用機(jī)理有待今后深入研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，亞致死濃度甲氧蟲酰肼處理甜菜夜蛾2齡幼蟲能增加其血淋巴中總糖的含量。印建莉等［7］在褐飛虱上也有相似研究結(jié)果。由于昆蟲血淋巴中的血糖主要為海藻糖，因此血淋巴中總糖含量的增加，可能是甲氧蟲酰肼抑制甜菜夜蛾體內(nèi)海藻糖酶的活性，阻礙了海藻糖的分解代謝，從而導(dǎo)致血淋巴中糖含量的升高。然而也有研究表明殺蟲劑處理后能降低昆蟲血淋巴中的糖含量，如趙克非等［17］研究發(fā)現(xiàn)亞致死劑量的吡蟲啉能增強(qiáng)褐飛虱體內(nèi)海藻糖酶活性，從而導(dǎo)致海藻糖含量下降。兩者之間的差異可能與殺蟲劑作用機(jī)理和昆蟲種類不同有關(guān)。

［1］CARLSON G R，DHADIALLA T S，HUNTER R，et al.The chemical and biological properties of methoxyfenozide，a new insecticidal ecdysteroid agonist［J］.Pest Manag Sci，2001，57（2）：115-119.

［2］張?zhí)熹?，王冬生，袁永達(dá)，等.甲氧蟲酞阱對(duì)甜菜夜蛾生長繁殖的亞致死效應(yīng)［J］.長江蔬菜，2010（18）：90-92.

［3］廖月枝，嚴(yán)善春，曹傳旺，等.低劑量甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾生長發(fā)育的影響［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2009，36（6）：555-560.

［4］劉娟，董利霞，譚曉偉，等.棉鈴蟲對(duì)甲氧蟲酰肼抗性機(jī)理的初步研究［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（1）：87-90.

［5］任龍，徐希寶，張靖，等.甲氧蟲酰肼對(duì)棉鈴蟲解毒酶活力的亞致死效應(yīng)研究［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15（3）：273-278.

［6］王建軍，田大軍.甲氧蟲酰肼對(duì)斜紋夜蛾亞致死效應(yīng)研究［J］.棉花學(xué)報(bào)，2009，21（3）：212-217.

［7］印建莉，胡君歡，徐海偉，等.殺蟲劑脅迫下褐飛虱遷飛蟲和本地蟲后代體內(nèi)粗脂肪、可溶性糖及氨基酸含量的比較［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2008，51（11）：1103-1112.

［8］張潔，秦小娃，袁鳳輝，等.亞致死劑量烯啶蟲胺對(duì)褐飛虱體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、可溶性糖及游離氨基酸含量的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，50（6）：88-93.

［9］TOJO S，TOYOSHI Y.Purification and characterization of three storage proteins in the common cutworm，Spodoptera litura［J］.Insect Biochem. Mol.Biol.，1994，24（7）：729-738.

［10］李愷，張?zhí)熹?，張麗莉，?龜紋瓢蟲卵黃蛋白的分子特性及發(fā)生動(dòng)態(tài)［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2007，50（10）：975-980.

［11］王方海，龔和，欽俊德.滯育和非滯育棉鈴蟲血淋巴中蛋白質(zhì)含量及圖譜的比較［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，1998，41（4）：426-430.

［12］肖猛.昆蟲病原線蟲侵染鱗翅目幼蟲的血淋巴病理學(xué)［J］.中國生物防治，2000，16（3）：114-117.

［13］田鈴，嵇保中，劉曙雯，等.桑天牛成蟲交配后血淋巴和生殖系統(tǒng)內(nèi)可溶性總糖和蛋白質(zhì)含量的變化［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2008，51（1）：96-101.

［14］DESNEUX N，DECOURTYE A，DELPUECH JM.The sublethal effects of pesticides on beneficial arthropods［J］.Annu.Rev.Entomol.，2007，52：81-106.

［15］王紅，徐忠新，趙奎軍，等.致死中濃度吡蟲啉對(duì)大豆蚜體內(nèi)能源物質(zhì)含量的影響［J］.中國生物防治學(xué)報(bào)，2014，30（5）：654-659.

［16］廖月枝，嚴(yán)善春，曹傳旺，等.甲氧蟲酰肼對(duì)舞毒蛾幼蟲解毒酶及其體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響［J］.林業(yè)科學(xué)，2012，48（8）：99-105.

［17］趙克非，戈林泉，程耀，等.三種殺蟲劑對(duì)褐飛虱海藻糖含量和海藻糖酶活性的影響［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2011，54（7）：786-792.

（責(zé)任編輯：張睿）

Profile of protein and carbohydrate in Spodoptera exigua treated with sublethal concentration of methoxyfenozide

ZHANG Tian-shu，CHANG Xiao-li，TENG Hai-yuan，YUAN Yong-da*，WANG Dong-sheng*
（Institute of Eco-Environment and Plant Protection，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology，Shanghai Dongbao Agricultural Science and Technology Co.，Ltd.，Shanghai 201106，China）

After treated with sublethal concentration of methoxyfenozide，the total protein and carbohydrate contents in Spodoptera exigua larval haemolymph were analyzed.Treated with methoxyfenozide for 72 hours the total protein content was raised with the increase of treatment concentration.And the protein concentration of LC40treatment 6.74 mg/mL was the highest.Moreover，the sublethal concentration methoxyfenozide had the obvious subsequent effects for the beet armyworm.At 4 th instar，the protein concentrations of LC10，LC20and LC30treatment groups were higher than that of control group significantly，and the protein concentration of LC40treatment，7.61 mg/mL，was the lowest among the treatment groups.Furthermore，the SDS-PAGE results also showed that contents of several major protein bands of LC10，LC10and LC30treatment groups were higher than that of control group remarkably.At 5 th instar，the protein concentrations of LC10，LC20treatment groups were lower than that of control and other treatment groups significantly，and the SDS-PAGE analysis indicated that the main protein band（85.1 KD）content of LC10，LC20treatment groups was the lowest.As to the total carbohydrate content in haemolymph，the results showed that sublethal concentration methoxyfenozide had the positive effects on the increase of total carbohydrate in larva haemolymph.After being treated with methoxyfenozide for 72 hours，the total carbohydrate contents of all treatment groups were higher than that of control.And the subsequent effects were the same，at 4 th and 5 th instar，the total carbohydrate concentrations of all treatment groups were higher than that of control remarkably.

Spodoptera exigua；Methoxyfenozide；Sublethal concentration；Protein；Carbohydrate

S433

A

1000-3924（2016）06-087-05

2016-04-28

上海市自然科學(xué)基金（13ZR1418000）；上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金［農(nóng)科發(fā)2013（18）］

張?zhí)熹?977—），男，博士，副研究員，主要從事昆蟲毒理及生理生化研究。E-mail：zhangtianshu2000＠sohu.com

*通信作者，E-mail：yuanyongda＠saas.sh.cn，zb3＠saas.sh.cn