植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵條件的研究

曹珂珂，李 妍，王 娣

蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠，233030

植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵條件的研究

曹珂珂，李 妍，王 娣

蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠，233030

研究了培養(yǎng)基成分(生長(zhǎng)因子、碳源、氮源)和培養(yǎng)條件(培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、接種量、初始pH)對(duì)植物乳桿菌B002高密度培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，菌體最適培養(yǎng)基條件為：在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5%番茄汁、3%葡萄糖和2.5%胰蛋白胨；最適的培養(yǎng)條件為：5%接種量、初始pH6.5、37℃培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)結(jié)束后，菌體密度達(dá)到4.71×109cfu/mL。

植物乳桿菌；高密度培養(yǎng)；培養(yǎng)基優(yōu)化

乳酸菌是對(duì)能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)乳酸等有機(jī)酸的革蘭氏陽(yáng)性菌的統(tǒng)稱[1]，它能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，促進(jìn)消化[2]，被廣泛應(yīng)用于乳制品行業(yè)以及泡菜生產(chǎn)、發(fā)酵香腸等。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，兼性厭氧或者厭氧，屬于同型發(fā)酵乳酸菌，具有促進(jìn)維生素D的吸收，提高鈣、磷的利用率，促進(jìn)脂類的消化吸收，提高蛋白質(zhì)的可消化性，緩解乳糖不耐受等作用，可用于發(fā)酵飲料、泡菜和肉制品。乳酸菌發(fā)酵蔬菜制品，既能賦予蔬菜清新香味，又能保持蔬菜原料脆、嫩、鮮、香的自然風(fēng)味[3-4]。

高密度發(fā)酵是新近發(fā)展起來(lái)的一種發(fā)酵技術(shù),它是生產(chǎn)高質(zhì)量的濃縮型菌體和代謝產(chǎn)物、實(shí)現(xiàn)菌種規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素[5-6]。本研究以MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究植物乳桿菌B002菌株的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基條件單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，正交優(yōu)化了植物乳桿菌B002菌株培養(yǎng)基條件，以期提高植物乳桿菌的生長(zhǎng)能力和活菌數(shù)[7-9]，為制備植物乳桿菌蔬菜發(fā)酵專用發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)B002，從酸黃瓜中選育，保存于蚌埠學(xué)院生物與食品工程系微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

10%脫脂乳培養(yǎng)基，MRS肉湯培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器

BHC-1300ⅡA/B2生物潔凈安全柜(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，BSD-YX2200立式智能精密搖床(上海恒訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，ZDX-35BI型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

1.2 方法1.2.1 種子液的制備

將已活化的植物乳桿菌B002取出搖勻，用微量移液器按1%的量將其移接到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。

1.2.2 活菌數(shù)測(cè)定

采用平板活菌計(jì)數(shù)法，即用無(wú)菌水逐級(jí)稀釋，選取3個(gè)合適的稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)。

1.2.3 植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

將生長(zhǎng)因子、碳源、氮源分別以一定的量添加到MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)不同的培養(yǎng)時(shí)間、起始pH、溫度、接種量，檢測(cè)不同的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基對(duì)菌體密度的影響。

1.2.4 植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵的正交試驗(yàn)

由于植物乳桿菌生長(zhǎng)要求較復(fù)雜，根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇的培養(yǎng)基成分，采用三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定培養(yǎng)基的最佳方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵培養(yǎng)條件的選擇

2.1.1 生長(zhǎng)曲線

為了解植物乳桿菌B002在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，將菌株在37℃下培養(yǎng)48 h，每隔4 h取出采用稀釋涂布法計(jì)活菌數(shù)。由圖1可知，植物乳桿菌B002在經(jīng)過(guò)短暫的4 h的延滯期后，迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在此時(shí)期，菌體快速生長(zhǎng)繁殖，16 h后，基本進(jìn)入穩(wěn)定期生長(zhǎng)階段，在20 h左右，細(xì)胞密度達(dá)到2.28×109cfu/mL。

圖1 植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線

2.1.2 接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將種子液按1%、3%、5%、7%、9% 的接種量接種于MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20 h，測(cè)定活菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。接種量對(duì)植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵有一定的影響，隨著接種量的增加，植物乳桿菌B002活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)；接種量為5%時(shí)，植物乳桿菌B002活菌數(shù)達(dá)到最高，隨后逐漸下降。接種量較少，菌體密度較??；接種量增加，菌體密度相應(yīng)增加，但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快，培養(yǎng)后期隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，部分菌體會(huì)逐漸死亡，所以該菌株的最適接種量為5%。

圖2 接種量對(duì)菌體密度的影響

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

按5%接種量將種子液接種于MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別放于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、45℃下培養(yǎng)20 h，測(cè)活菌數(shù)，結(jié)果如圖3所示。微生物在最適生長(zhǎng)溫度條件下，菌種密度會(huì)達(dá)到最大值。植物乳桿菌B002的最適生長(zhǎng)溫度是37℃，在此溫度下，生長(zhǎng)繁殖最旺盛，所以選擇37℃培養(yǎng)該菌株。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體密度的影響

圖4 初始pH值對(duì)菌體密度的影響

2.1.4 初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基的起始pH值分別為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，37℃培養(yǎng)20 h，測(cè)定活菌數(shù)。pH值是影響微生物生長(zhǎng)的主要因素之一，每種微生物都有最適生長(zhǎng)的pH值。由圖4可知，培養(yǎng)基的初始pH為6.5時(shí)，植物乳桿菌B002生長(zhǎng)最為旺盛，活菌數(shù)較高。初始pH過(guò)低或過(guò)高，都不利于其生長(zhǎng)，因此，該菌株在培養(yǎng)時(shí)，初始pH值可以控制在6～7之間。

2.2 植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇2.2.1 不同生長(zhǎng)因子對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，依次添加5%(V/V)的番茄汁、香菇汁、玉米汁、胡蘿卜汁和黃瓜汁作為不同的生長(zhǎng)因子，按5%接種量，37℃培養(yǎng)20 h，測(cè)活菌數(shù)，結(jié)果如圖5所示。植物乳桿菌為生長(zhǎng)因子異養(yǎng)型微生物，自身不能合成生長(zhǎng)因子[10]，在培養(yǎng)基中添加番茄汁、胡蘿卜汁、玉米汁等作為生長(zhǎng)因子的供體，可以促進(jìn)菌種的生長(zhǎng)。在幾種生長(zhǎng)因子中，番茄汁對(duì)植物乳桿菌B002的增殖效果最明顯，可能是番茄汁作為生長(zhǎng)因子能提供一些礦物質(zhì)、維生素，對(duì)其生長(zhǎng)繁殖有一定的促進(jìn)作用。

2.2.2 不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

分別選擇葡萄糖、乳糖、果糖和蔗糖4種碳源以2%含量添加到MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，初始pH值6.5，5%接種量，37℃培養(yǎng)20 h，測(cè)活菌數(shù)，結(jié)果如圖6所示。作為微生物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，碳源不僅是微生物生長(zhǎng)的能源物質(zhì)，也是微生物的組成物質(zhì)。由圖6可以看出，植物乳桿菌B002在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，菌體密度明顯高于含有其他碳源的培養(yǎng)基，因此該菌株的碳源選擇葡萄糖。

圖5 生長(zhǎng)因子對(duì)菌體密度的影響

圖6 碳源對(duì)菌體密度的影響

2.2.3 不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

可以被微生物利用的氮源很多，本實(shí)驗(yàn)在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)上分別添加2%的胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨和硝酸銨作為氮源，結(jié)果如圖7所示。4種被試氮源中，有機(jī)氮源效果好于無(wú)機(jī)氮源，其中添加胰蛋白胨增菌效果最好，可能是作為有機(jī)氮源的胰蛋白胨含有植物乳桿菌B002生長(zhǎng)所需要的氨基酸等物質(zhì)。

圖7 氮源對(duì)菌體密度的影響

2.2.4 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定正交試驗(yàn)中每種物質(zhì)的添加量，采用L9(34)三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方，結(jié)果如表1和表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2中極差R可以看出，影響植物乳桿菌增殖的各因素中，葡萄糖>胰蛋白胨>番茄汁。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳的培養(yǎng)基配方組合是A2B3C3。

2.2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證正交優(yōu)化組合A2B3C3是否能達(dá)到植物乳桿菌B002的高密度培養(yǎng)，將A2B3C3組合與正交表中A2B2C3組合進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)，按照正交優(yōu)化組合A2B3C3的培養(yǎng)基條件，以5%接種量，初始pH6.5，37℃培養(yǎng)20 h，植物乳桿菌B002的活菌數(shù)達(dá)到4.71×109cfu/mL，高于正交試驗(yàn)表中的所有結(jié)果，所以該菌株培養(yǎng)基最佳組合為在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5%番茄汁、3%葡萄糖和2.5%胰蛋白胨。

3 結(jié)束語(yǔ)

以植物乳桿菌B002為出發(fā)菌株，優(yōu)化其高密度培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，最優(yōu)培養(yǎng)基組合為：在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加番茄汁5%、葡萄糖3%和2.5%胰蛋白胨，在此條件下，初始pH6.5，5%接種量，37℃培養(yǎng)20 h，培養(yǎng)結(jié)束后，植物乳桿菌B002菌體密度達(dá)到4.71×109cfu/mL。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2016.03.031

2015-11-25

安徽省高校自然科學(xué)研究一般項(xiàng)目“蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌的選育及其凍干發(fā)酵劑的研究”(KJ2013Z194)。

曹珂珂(1980-)，女，安徽界首人，碩士，講師，主要研究方向：微生物發(fā)酵。

Q939.97

A

1673-2006(2016)03-0123-04