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    植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵條件的研究

    2017-01-11 07:01:30曹珂珂
    宿州學(xué)院學(xué)報(bào) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:氮源菌體高密度

    曹珂珂,李 妍,王 娣

    蚌埠學(xué)院生物與食品工程系,安徽蚌埠,233030

    植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵條件的研究

    曹珂珂,李 妍,王 娣

    蚌埠學(xué)院生物與食品工程系,安徽蚌埠,233030

    研究了培養(yǎng)基成分(生長(zhǎng)因子、碳源、氮源)和培養(yǎng)條件(培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、接種量、初始pH)對(duì)植物乳桿菌B002高密度培養(yǎng)的影響,結(jié)果表明,菌體最適培養(yǎng)基條件為:在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5%番茄汁、3%葡萄糖和2.5%胰蛋白胨;最適的培養(yǎng)條件為:5%接種量、初始pH6.5、37℃培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)結(jié)束后,菌體密度達(dá)到4.71×109cfu/mL。

    植物乳桿菌;高密度培養(yǎng);培養(yǎng)基優(yōu)化

    乳酸菌是對(duì)能利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)乳酸等有機(jī)酸的革蘭氏陽(yáng)性菌的統(tǒng)稱[1],它能促進(jìn)腸道蠕動(dòng),促進(jìn)消化[2],被廣泛應(yīng)用于乳制品行業(yè)以及泡菜生產(chǎn)、發(fā)酵香腸等。植物乳桿菌是乳酸菌的一種,兼性厭氧或者厭氧,屬于同型發(fā)酵乳酸菌,具有促進(jìn)維生素D的吸收,提高鈣、磷的利用率,促進(jìn)脂類的消化吸收,提高蛋白質(zhì)的可消化性,緩解乳糖不耐受等作用,可用于發(fā)酵飲料、泡菜和肉制品。乳酸菌發(fā)酵蔬菜制品,既能賦予蔬菜清新香味,又能保持蔬菜原料脆、嫩、鮮、香的自然風(fēng)味[3-4]。

    高密度發(fā)酵是新近發(fā)展起來(lái)的一種發(fā)酵技術(shù),它是生產(chǎn)高質(zhì)量的濃縮型菌體和代謝產(chǎn)物、實(shí)現(xiàn)菌種規(guī)模化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素[5-6]。本研究以MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ),通過(guò)單因素試驗(yàn)研究植物乳桿菌B002菌株的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基條件單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,正交優(yōu)化了植物乳桿菌B002菌株培養(yǎng)基條件,以期提高植物乳桿菌的生長(zhǎng)能力和活菌數(shù)[7-9],為制備植物乳桿菌蔬菜發(fā)酵專用發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)B002,從酸黃瓜中選育,保存于蚌埠學(xué)院生物與食品工程系微生物實(shí)驗(yàn)室。

    1.1.2 主要培養(yǎng)基

    10%脫脂乳培養(yǎng)基,MRS肉湯培養(yǎng)基,MRS固體培養(yǎng)基。

    1.1.3 主要儀器

    BHC-1300ⅡA/B2生物潔凈安全柜(蘇州凈化設(shè)備有限公司),BSD-YX2200立式智能精密搖床(上海恒訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),ZDX-35BI型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

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    (責(zé)任編輯:汪材印)

    1.2 方法1.2.1 種子液的制備

    將已活化的植物乳桿菌B002取出搖勻,用微量移液器按1%的量將其移接到MRS液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)12 h。

    1.2.2 活菌數(shù)測(cè)定

    采用平板活菌計(jì)數(shù)法,即用無(wú)菌水逐級(jí)稀釋,選取3個(gè)合適的稀釋度涂平板,每個(gè)稀釋度做3次重復(fù),37℃培養(yǎng)24 h,計(jì)數(shù)。

    1.2.3 植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵的單因素試驗(yàn)

    將生長(zhǎng)因子、碳源、氮源分別以一定的量添加到MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)不同的培養(yǎng)時(shí)間、起始pH、溫度、接種量,檢測(cè)不同的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基對(duì)菌體密度的影響。

    1.2.4 植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵的正交試驗(yàn)

    由于植物乳桿菌生長(zhǎng)要求較復(fù)雜,根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇的培養(yǎng)基成分,采用三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn),以確定培養(yǎng)基的最佳方案。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵培養(yǎng)條件的選擇

    2.1.1 生長(zhǎng)曲線

    為了解植物乳桿菌B002在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,將菌株在37℃下培養(yǎng)48 h,每隔4 h取出采用稀釋涂布法計(jì)活菌數(shù)。由圖1可知,植物乳桿菌B002在經(jīng)過(guò)短暫的4 h的延滯期后,迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在此時(shí)期,菌體快速生長(zhǎng)繁殖,16 h后,基本進(jìn)入穩(wěn)定期生長(zhǎng)階段,在20 h左右,細(xì)胞密度達(dá)到2.28×109cfu/mL。

    圖1 植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線

    2.1.2 接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

    將種子液按1%、3%、5%、7%、9% 的接種量接種于MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)20 h,測(cè)定活菌數(shù),結(jié)果如圖2所示。接種量對(duì)植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵有一定的影響,隨著接種量的增加,植物乳桿菌B002活菌數(shù)呈上升趨勢(shì);接種量為5%時(shí),植物乳桿菌B002活菌數(shù)達(dá)到最高,隨后逐漸下降。接種量較少,菌體密度較??;接種量增加,菌體密度相應(yīng)增加,但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快,培養(yǎng)后期隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗,部分菌體會(huì)逐漸死亡,所以該菌株的最適接種量為5%。

    圖2 接種量對(duì)菌體密度的影響

    2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

    按5%接種量將種子液接種于MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,分別放于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、45℃下培養(yǎng)20 h,測(cè)活菌數(shù),結(jié)果如圖3所示。微生物在最適生長(zhǎng)溫度條件下,菌種密度會(huì)達(dá)到最大值。植物乳桿菌B002的最適生長(zhǎng)溫度是37℃,在此溫度下,生長(zhǎng)繁殖最旺盛,所以選擇37℃培養(yǎng)該菌株。

    圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體密度的影響

    圖4 初始pH值對(duì)菌體密度的影響

    2.1.4 初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

    用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基的起始pH值分別為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8,37℃培養(yǎng)20 h,測(cè)定活菌數(shù)。pH值是影響微生物生長(zhǎng)的主要因素之一,每種微生物都有最適生長(zhǎng)的pH值。由圖4可知,培養(yǎng)基的初始pH為6.5時(shí),植物乳桿菌B002生長(zhǎng)最為旺盛,活菌數(shù)較高。初始pH過(guò)低或過(guò)高,都不利于其生長(zhǎng),因此,該菌株在培養(yǎng)時(shí),初始pH值可以控制在6~7之間。

    2.2 植物乳桿菌B002高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇2.2.1 不同生長(zhǎng)因子對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

    在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,依次添加5%(V/V)的番茄汁、香菇汁、玉米汁、胡蘿卜汁和黃瓜汁作為不同的生長(zhǎng)因子,按5%接種量,37℃培養(yǎng)20 h,測(cè)活菌數(shù),結(jié)果如圖5所示。植物乳桿菌為生長(zhǎng)因子異養(yǎng)型微生物,自身不能合成生長(zhǎng)因子[10],在培養(yǎng)基中添加番茄汁、胡蘿卜汁、玉米汁等作為生長(zhǎng)因子的供體,可以促進(jìn)菌種的生長(zhǎng)。在幾種生長(zhǎng)因子中,番茄汁對(duì)植物乳桿菌B002的增殖效果最明顯,可能是番茄汁作為生長(zhǎng)因子能提供一些礦物質(zhì)、維生素,對(duì)其生長(zhǎng)繁殖有一定的促進(jìn)作用。

    2.2.2 不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

    分別選擇葡萄糖、乳糖、果糖和蔗糖4種碳源以2%含量添加到MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,初始pH值6.5,5%接種量,37℃培養(yǎng)20 h,測(cè)活菌數(shù),結(jié)果如圖6所示。作為微生物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,碳源不僅是微生物生長(zhǎng)的能源物質(zhì),也是微生物的組成物質(zhì)。由圖6可以看出,植物乳桿菌B002在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好,菌體密度明顯高于含有其他碳源的培養(yǎng)基,因此該菌株的碳源選擇葡萄糖。

    圖5 生長(zhǎng)因子對(duì)菌體密度的影響

    圖6 碳源對(duì)菌體密度的影響

    2.2.3 不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

    可以被微生物利用的氮源很多,本實(shí)驗(yàn)在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)上分別添加2%的胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨和硝酸銨作為氮源,結(jié)果如圖7所示。4種被試氮源中,有機(jī)氮源效果好于無(wú)機(jī)氮源,其中添加胰蛋白胨增菌效果最好,可能是作為有機(jī)氮源的胰蛋白胨含有植物乳桿菌B002生長(zhǎng)所需要的氨基酸等物質(zhì)。

    圖7 氮源對(duì)菌體密度的影響

    2.2.4 正交試驗(yàn)

    通過(guò)單因素試驗(yàn)確定正交試驗(yàn)中每種物質(zhì)的添加量,采用L9(34)三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方,結(jié)果如表1和表2。

    表1 正交試驗(yàn)因素水平表

    表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

    由表2中極差R可以看出,影響植物乳桿菌增殖的各因素中,葡萄糖>胰蛋白胨>番茄汁。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,確定最佳的培養(yǎng)基配方組合是A2B3C3。

    2.2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

    為了驗(yàn)證正交優(yōu)化組合A2B3C3是否能達(dá)到植物乳桿菌B002的高密度培養(yǎng),將A2B3C3組合與正交表中A2B2C3組合進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn),按照正交優(yōu)化組合A2B3C3的培養(yǎng)基條件,以5%接種量,初始pH6.5,37℃培養(yǎng)20 h,植物乳桿菌B002的活菌數(shù)達(dá)到4.71×109cfu/mL,高于正交試驗(yàn)表中的所有結(jié)果,所以該菌株培養(yǎng)基最佳組合為在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5%番茄汁、3%葡萄糖和2.5%胰蛋白胨。

    3 結(jié)束語(yǔ)

    以植物乳桿菌B002為出發(fā)菌株,優(yōu)化其高密度培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,最優(yōu)培養(yǎng)基組合為:在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加番茄汁5%、葡萄糖3%和2.5%胰蛋白胨,在此條件下,初始pH6.5,5%接種量,37℃培養(yǎng)20 h,培養(yǎng)結(jié)束后,植物乳桿菌B002菌體密度達(dá)到4.71×109cfu/mL。

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    (責(zé)任編輯:汪材印)

    10.3969/j.issn.1673-2006.2016.03.031

    2015-11-25

    安徽省高校自然科學(xué)研究一般項(xiàng)目“蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌的選育及其凍干發(fā)酵劑的研究”(KJ2013Z194)。

    曹珂珂(1980-),女,安徽界首人,碩士,講師,主要研究方向:微生物發(fā)酵。

    Q939.97

    A

    1673-2006(2016)03-0123-04

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