一株產(chǎn)氫菌的分離鑒定與產(chǎn)氫特性

張安龍， 董婷婷， 王雪青， 王 曄

(陜西科技大學 輕工科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

一株產(chǎn)氫菌的分離鑒定與產(chǎn)氫特性

張安龍， 董婷婷， 王雪青， 王 曄

(陜西科技大學 輕工科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

從造紙廠厭氧顆粒污泥中分離出一株高效的產(chǎn)氫細菌DW01，通過16S rDNA序列分析，表明DW01菌株屬于Raoultella屬，與Raoultellasp.NGB-FR77相似性為100%.同時，在溫度為30 ℃的條件下，進一步優(yōu)化了DW01菌株在不同碳源、氮源、pH的培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)氫性能，結(jié)果表明，該菌株在以葡萄糖為碳源，L-谷氨酸為氮源，初始pH為6.0的條件下，獲得最佳氫氣產(chǎn)量和最佳產(chǎn)氫速率，分別為188.9±2.1 mL/g和93.3±7.5 mL/L/h.DW01菌株作為良好的發(fā)酵產(chǎn)氫菌，可進一步優(yōu)化產(chǎn)氫條件，提高產(chǎn)氫量.

生物制氫； 厭氧污泥； 分離鑒定； 產(chǎn)氫優(yōu)化

0 引言

在化石石油資源日益枯竭、環(huán)境污染日趨嚴峻的今天,氫氣的開發(fā)與利用備受世人的關(guān)注，生物暗發(fā)酵處理生物質(zhì)廢棄物制沼氣已逐漸成為生物質(zhì)能源領(lǐng)域的研究熱點之一，傳統(tǒng)活性污泥發(fā)酵過程中耗氫菌較多，生物質(zhì)氫轉(zhuǎn)化率較低.因此，獲得高效產(chǎn)氫菌種，是實現(xiàn)生物制氫工業(yè)化的核心技術(shù)問題.目前，產(chǎn)氫菌株方法有直接篩選菌株和通過基因工程等技術(shù)手段改良目標菌株，但后置操作復雜、設(shè)備昂貴、成功率低，盡管國際上已開展了大量相關(guān)研究, 但生物制氫產(chǎn)業(yè)化的報道相對較少[1-5]，因此分離高效產(chǎn)氫菌，為工業(yè)化制氫技術(shù)提供種質(zhì)資源，是實現(xiàn)工業(yè)化制氫的重要方面.

目前已知的暗發(fā)酵產(chǎn)氫微生物主要分布于Enterobacter，Citrobacter，Bacillus及Clostridium屬[6]，但大多數(shù)菌株耐酸性較弱，如支曉鵬等[7]分離出的Enterobactersp. Z-16和Clostridiumsp.C-32分別在最佳初始pH為7.0和8.0的情況下，比產(chǎn)氫量為2.35和2.45 mol H2/mol葡萄糖，Junghare M等[8]分離出ClostridiumbutyricumTM-9A在最佳初始pH為8.0，比產(chǎn)氫量為3.1 mol H2/mol葡萄糖，對上述所述的三株發(fā)酵產(chǎn)氫菌，當初始pH降低為6.0時，產(chǎn)氫量分別降低了94%、58%和60%，說明該類菌株對酸性的耐受性較弱，當發(fā)酵產(chǎn)氫過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物有機酸使體系pH持續(xù)降低時，會抑制微生物產(chǎn)氫，導致生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率較低.基于上述問題，本文從厭氧顆粒污泥中分離和篩選出一株高性能耐酸性發(fā)酵產(chǎn)氫菌，通過16S rDNA測序手段實現(xiàn)產(chǎn)氫菌種屬鑒定，并對分離出的產(chǎn)氫菌進行了發(fā)酵性能研究.

1 實驗部分

1.1 樣品來源

用于分離菌株的厭氧顆粒污泥來自福建某造紙廠的厭氧處理反應器.

1.2 培養(yǎng)基

(1)液體培養(yǎng)基(試劑均為分析純)：葡萄糖10 g/L,L-谷氨酸0.883 g/L,10% NaCl 10 mL,營養(yǎng)母液 (次氮基三乙酸10.0 g,MgSO4·7H2O 29.5 g,CaCl2·2H2O 3.335 g,FeSO4·7H2O 0.099 g,(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.009 3 g，微量元素(蒸餾水100 mL,ZnSO4·7H2O 1.095 g,EDTA(acid) 250 mg,FeSO4·7H2O 500 mg,H3BO311.4 mg,MnSO4·H2O 154 mg,CuSO4·5H2O 39.2 mg,Co(NO3)2·6H2O 24.8 mg)50 mL/L,蒸餾水1 000 mL,pH7.0)20mL/L，磷酸鹽緩沖溶液 (1 000 mL雙蒸水,KH2PO468.05 g,K2HPO487.09 g,pH7.0) 20 mL/L,維生素溶液煙酸0.1 mg/mL,煙酸硫胺0.05 mg/mL,生物素1 ug/mL)10 ml/L.

(2)固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+瓊脂(1.6%～2.0%).

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)氫菌的分離和鑒定

(1)富集：取10 g的厭氧顆粒污泥，置于裝有200 mL的無菌蒸餾水中，加入數(shù)粒玻璃沸石，用氮氣將發(fā)酵罐中的空氣洗脫干凈，后置于恒溫振蕩器中振蕩5 h，將顆粒污泥打碎，使其均勻分散在水中.用無菌注射器吸取5 mL，接種至盛有25 mL培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中.在30±1 ℃的恒溫震蕩器中培養(yǎng)48 h.

(2)初選：取1 mL富集好的菌液用無菌超純水依次制成10-1～10-5稀釋梯度的菌懸浮液，分別用純木質(zhì)接種棒對梯度懸浮液進行平板劃線，置于厭氧培養(yǎng)箱中，在30 ℃的條件下進行培養(yǎng)，10 h后獲得單菌落，挑取單菌落于平板培養(yǎng)基中重復劃線三次，在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)大小是否一致，重復劃線直至得到純種菌株.

(3)復選：將分離得到的產(chǎn)氫菌株進行發(fā)酵實驗，分別接種至盛有50 mL發(fā)酵液的注射器中，至于30 ℃、100 r/min的條件下，進行發(fā)酵產(chǎn)氣實驗，用氣相色譜法檢測產(chǎn)氣中是否含有H2，選擇產(chǎn)氣能力較強的菌株為實驗菌株并對其進行冷凍保存及鑒定.

1.3.2 菌株的產(chǎn)氫特性

將分離出的高效產(chǎn)氣菌株接種到裝有50 mL培養(yǎng)基的厭氧發(fā)酵罐中,置于(30±1) ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min生化培養(yǎng)箱中活化一次，將活化的菌種接種于1 000 mL的發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)，當菌株生長至對數(shù)期時，在無菌環(huán)境下將其搖勻分裝置50 mL的離心管中，離心(5 000 r/min,10 min)收集菌體，用不同條件的培養(yǎng)基懸浮，調(diào)節(jié)OD值均為0.4，后將懸浮液接種至50 mL發(fā)酵罐中進行厭氧發(fā)酵.測試DW01菌株在不同碳源、不同的氮源、不同的起始pH值時對發(fā)酵產(chǎn)氫的影響.其中，碳源包括單糖(鼠李糖、木糖、半乳糖)和二糖(D-纖維素二糖、乳糖、蔗糖、D-麥芽糖)、氮源為L-谷氨酸、酵母粉、蛋白胨、NaNO3、NH4Cl；用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)初始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；每組做三個平行實驗，結(jié)果取平均值.定時測其氫氣產(chǎn)量、pH值、菌濁，通過修正的Gompertz方程考察了該菌株的產(chǎn)氫特性.

1.3.3 發(fā)酵終端氣相產(chǎn)物的檢測

生物氣檢測氣相色譜儀(島津GC-2014)檢測[9]，擔體TDS-01(60/80目)，載氣為氮氣，流速70 mL/min，進樣量500 uL，柱室溫度70 ℃，氣化室溫度80 ℃，檢測器100 ℃.

1.3.4 細菌的產(chǎn)氫動力學模型

根據(jù)細菌生長與時間之間的關(guān)系[10]，對Gompertz方程進行修正后得到修正的Gompertz方程，如式(1)所示：

(1)

式(1)中：H—細菌發(fā)酵所產(chǎn)生的氫氣體積(mL/L)；Hmax—細菌可能產(chǎn)生的最大氫氣體積(mL/L)；Rm—細菌的最大產(chǎn)氫速率(g/L/h)；λ—細菌產(chǎn)氫的延滯時間(h)；t—反應時間(h)；e—為自然對數(shù)，數(shù)值為2.718 28.

1.3.5 16S rDNA的序列分析

細菌DNA的提取參照文獻[11,12].用于16S rDNA擴增的PCR反應引物為通用引物Forward 27 F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；Reverse1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-

TT-3′.PCR反應體系(50 uL)：5 ng/uLDNA模板2uL,10×buffer2.0μL,2.5 mmol/L(Mg2+)1.5 uL；dNTPs 5μL；20 pmol/L引物各1μL；ExTaq DNA酶0.25μL；加雙蒸水至50 uL；PCR擴增條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1.5 min，重復以上3個步驟，進行30個循環(huán)；延伸72 ℃ 5 min；擴增結(jié)束后；取2.5 uL擴增產(chǎn)物，加入溴酚藍作指示劑，利用渦流攪拌器混勻，短暫離心，檢測PCR擴增產(chǎn)物，用EB作為染色劑涂布染色30 min，在1%的瓊脂糖凝膠上點樣電泳，觀察電泳結(jié)果.切膠回收目的片段基因，進行DNA測序.測序工作委托寶生物工程(大連)有限公司完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 DW01菌株的生長發(fā)育樹分析

將篩選出的DW01菌株進行16S rDNA 基因序列測定分析，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知16S rDNA 序列進行比較，通過NCBI的Blast序列比對進行同源性分析.結(jié)果如圖1所示，DW01菌株的基因與Raoultella的關(guān)系密切，Blast序列對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與Raoultellasp. NGB -FR77相似性達到100%，從DW01菌株的生長發(fā)育樹可以看出DW01菌株與Raoultella處于同一分支，表明DW01菌屬于Raoultella屬的一株新的菌株.

圖1 基于16S rDNA序列的 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 DW01菌株對不同碳源的利用

碳源對發(fā)酵產(chǎn)氫是一個重要的參數(shù),在生物制氫細菌的活動和產(chǎn)氫量中起關(guān)鍵作用.本文對此菌株利用不同碳源情況進行了考察，旨在研究其在處理造紙廢液過程中對碳源的利用情況.

表1列出了在溫度30 ℃、pH為7.0條件下，DW01菌株對不同碳源的利用的動力參數(shù)，從表1中可以看出，在以L-谷氨酸為氮源，碳源濃度為10 g/L的情況下，DW01菌株不能利用L-鼠李糖產(chǎn)生氫氣，但可以利用單糖(木糖、半乳糖、葡萄糖)和二糖(D-纖維素二糖、乳糖、蔗糖、D-麥芽糖)發(fā)酵產(chǎn)氫，其中，葡萄糖的累積產(chǎn)氫量最大，為161.3 mL/g,蔗糖次之，為117.4 mL/g,DW01菌株利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)氫的累積產(chǎn)氫量優(yōu)于文獻[13]報道的Clostridiumpapyrosolvens菌株.該菌株對乳糖也表現(xiàn)出了較好的發(fā)酵產(chǎn)氫性能，為109.8 mL/L.DW01菌株利用不同碳源發(fā)酵產(chǎn)氫的遲滯時間相差較大，其中利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氫遲滯時間最短，為10.8 h左右，而其他碳源的遲滯時間都在30～40 h之間.比產(chǎn)氫率最高的為蔗糖，1.63 mol H2/mol底物，最低的為木糖，0.08 mol H2/mol底物.從發(fā)酵

終端的pH及生長情況看，在以L-鼠李糖為碳源時，發(fā)酵終端pH值相較其他各組最低，為4.96，OD600為0.527，而以蔗糖、葡萄糖為碳源的情況下，發(fā)酵終端的pH分別為5.30、5.84和OD600分別為0.93、1.021，相較其他各組不同碳源發(fā)酵產(chǎn)氫情況，說明DW01菌株在以L-鼠李糖為碳源的情況下，可以完成自身的生長，但不能發(fā)酵產(chǎn)氫.總體來看，DW01菌株對半纖維素水解液中存在量相對比較多的單糖(半乳糖、葡萄糖)及二糖(D-纖維素二糖)具有較好的發(fā)酵產(chǎn)氫性能.

2.3 不同氮源對DW01菌株發(fā)酵產(chǎn)氫性能的影響

氮是細胞的一種重要組成元素，細胞所吸收的氮素營養(yǎng)用于合成細胞內(nèi)各種氨基酸和堿基，從而合成菌體的蛋白質(zhì)、核酸等細胞成分，其中無機氮源是微生物生長的速效氮源，而有機氮源能夠為微生物生長提供氮元素及必須的生長因子，在以10g/L的葡萄糖為碳源，考察了不同氮源對DW01菌株發(fā)酵產(chǎn)氫性能的影響，如圖2所示.

表1 DW01菌株對不同碳源的利用

圖2 DW01菌株在不同氮源條件下 的產(chǎn)氫過程擬合曲線

根據(jù)表2列出的DW01菌株在不同氮源條件下Gompertz模型擬合產(chǎn)氫菌的生長過程所獲得的動力學參數(shù)，結(jié)合圖2可以看出，該菌株可以利用多種氮源進行發(fā)酵產(chǎn)氫，當使用有機氮源L-谷氨酸時累積產(chǎn)氫量最大，為161.4 mL/g，酵母浸粉次之，為122.6 mL/g；蛋白胨與NH4Cl相比較前兩種氮源，該菌株的累積產(chǎn)生氫氣量較少，分別為92.5 mL/g和87.3 mL/g，該菌株在以NaNO3為氮源的情況下不能生長和發(fā)酵產(chǎn)氫.總體而言，有機氮源更有利于DW01菌株發(fā)酵產(chǎn)氫，這可能是由于有機氮源在微生物生長代謝過程中提供了必要的氨基酸及生長因子.但在實際工業(yè)生產(chǎn)中，考慮到經(jīng)濟成本問題，對于DW01菌株可以使用無機氮源NH4Cl代替部分有機氮源，從而減少有機氮源的使用量，具有良好的工業(yè)開發(fā)潛力.

表2 Gompertz 模型擬合產(chǎn)氫菌的

2.4 不同初始pH對發(fā)酵產(chǎn)氫性能的影響

在溫度為30 ℃條件下，以10 g/L的葡萄糖為碳源，L-谷氨酸為氮源,考察了DW01菌株在不同pH條件下的發(fā)酵產(chǎn)氫能力，實驗結(jié)果如圖3所示.

根據(jù)表3列出的DW01菌株在不同pH條件下Gompertz模型擬合產(chǎn)氫菌的生長過程所獲得的動力學參數(shù),結(jié)合圖3可以發(fā)現(xiàn)，DW01菌株在pH從5.0到9.0變化的過程中，過高或過低都會對產(chǎn)氫性能產(chǎn)生影響.當pH為6.0時，累積產(chǎn)氫量最大，為189.5 mL/g，產(chǎn)氫速率最快為93.3 mL/L/h.當pH為9.0時，該菌株的累積產(chǎn)氫量相較其它各組低，產(chǎn)氫速率及遲滯時間最長，分別為66.3 mL/g、28.4 mL/L/h和35.5 h，這可能是由于在不同pH條件下，產(chǎn)氫酶的活性受到抑制或是細胞代謝途徑受到影響[14].

表3 Gompertz模型擬合產(chǎn)氫菌的

圖3 DW01菌株在不同初始pH 條件下的產(chǎn)氫過程擬合曲線

3 結(jié)論

從厭氧顆粒污泥中分離出23株厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫菌，對其中一株產(chǎn)氫性能較好的DW01菌株進行了16S rDNA序列對比分析及產(chǎn)氫性能研究，結(jié)果表明，DW01菌株屬于Raoultella屬的一個新種，與Raoultellasp. NGB-FR77相似性達到100%.在溫度為30 ℃條件下，發(fā)現(xiàn)該菌株具有較寬的pH適應范圍，能在較低初始pH5.0的環(huán)境中生長且具有較強的產(chǎn)氫性能.當DW01菌株在初始pH為6.0、L-谷氨酸為有機氮源發(fā)酵葡萄糖時獲得最大產(chǎn)氫量188.9±2.1 mL/g，最大產(chǎn)氫速率為93.3±7.5 mL/L/h.同時，DW01菌株也可以利用多種氮源、以不同碳源為底物發(fā)酵產(chǎn)氫.

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【責任編輯：陳 佳】

Isolation and characterization of a hydrogen-production bacteria

ZHANG An-long， DONG Ting-ting， WANG Xue-qing， WANG Ye

(College of Bioresources Chemical and Materials Engineering， Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

An efficient hydrogen-producing bacteria named DW01 was isolated from the anaerobic paper mill granular sludge,and the 16S rDNA sequence analysis showed that DW01 strain belonged toRaoultellagenus,and was identified having high similarity of 100% withRaoultellasp. NGB-FR77.Meanwhile,under temperature of 30 ℃ conditions,effects of carbon sources,nitrogen source and initial pH on the hydrogen production with DW01 were also studied.Results showed that when the strain utilized glucose as the carbon source,L-glutamic acid as nitrogen source under initial pH6.0 condition, the maximum hydrogen yield and hydrogen production rates were obtained as 188.9±2.1 mL/g and 93.3±7.5 mL/L/h. For DW01 strain was regarded as a advantage hydrogen production bacteria,it should be further optimized to improve the hydrogen production performance.

bio-hydrogen； anaerobic sludge； isolation and identification； hydrogen producting characteristics

2016-10-17

國家十二五科技支撐計劃項目(2011BAC11B04); 陜西科技大學研究生創(chuàng)新基金項目

張安龍(1963-)，男，陜西延安人，教授，研究方向：造紙工業(yè)廢水生物處理

1000-5811(2017)01-0040-05

Q939

A