人類腎結(jié)石果蠅模型的新進展

戴平 王固新 張東方

人類腎結(jié)石果蠅模型的新進展

戴平 王固新 張東方

泌尿系結(jié)石是泌尿外科的常見病、多發(fā)病，發(fā)病率達5%～15%［1］，其中腎結(jié)石又占泌尿系結(jié)石的40%～50%［2］。泌尿系結(jié)石引起的病理損害主要有直接損害、梗阻和感染，三者互為因果，促使病變發(fā)展，最終破壞腎組織，損害腎功能，甚至造成腎功能衰竭。因此，尿石癥是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病。近幾十年里，由于人類臨床研究與動物模型的限制，國內(nèi)外泌尿系結(jié)石的治療與預防措施的發(fā)展受到限制。近幾年，簡單而典型的果蠅作為一種新興且強大的人類疾病轉(zhuǎn)化模型出現(xiàn)在不同領域，其中也包括腎結(jié)石模型，其可能在泌尿系結(jié)石形成的方面能提供至關重要的信息［3］。

1 腎結(jié)石模型的建立

隨著對泌尿系結(jié)石研究的深入，各種利用實驗動物的體內(nèi)和體外尿石模型也逐漸發(fā)展，并在這些年有新的突破。結(jié)石實驗模型不但可以深入了解泌尿系結(jié)石的形成過程和機制，且可以篩選抗尿路結(jié)石的藥物，確認其藥理作用和機制。因此，設計和建立尿路結(jié)石的動物及體外模型，無疑為探討尿路結(jié)石的發(fā)病機制、尋找有效防治尿路結(jié)石的藥物奠定良好的基礎。目前已知的建模方法有通過乙二醇法建立的大鼠等小型哺乳動物結(jié)石模型［4］；通過異物植入法建立的豬等大型哺乳動物及目前最新的通過遺傳和環(huán)境改變誘發(fā)的果蠅結(jié)石模型。

1.1 大鼠模型 大鼠模型通過乙二醇法建立，乙二醇法是目前較成熟的方法，成石液多為乙二醇與氯化氨。乙二醇為草酸代謝通路的中間產(chǎn)物，亦是草酸的前體，進入體內(nèi)后轉(zhuǎn)化成羥乙酸，后者既可在羥乙酸氧化酶的作用下直接轉(zhuǎn)化為草酸，也可通過乳酸脫氧酶的催化轉(zhuǎn)化為乙醛酸，乙醛酸又可直接在非酶作用下轉(zhuǎn)化為草酸。因此，攝入乙二醇可導致動物體內(nèi)草酸增加而形成草酸鈣。在有腎結(jié)石的人類和大鼠腎乳頭表面均能發(fā)現(xiàn)草酸鈣或磷酸鈣的有機晶體。高草酸尿癥能引起人類和大鼠的草酸鈣結(jié)石。飲食因素在腎結(jié)石的形成過程中起著重要作用［5-6］。人類和大鼠的草酸代謝幾乎是相同的。因此，在誘發(fā)人類和大鼠腎結(jié)石形成的實驗中有較多的相似性。因此大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型可以用于研究人類腎結(jié)石形成的機制［7-8］。大鼠模型的優(yōu)勢在于結(jié)石形成率高，飼養(yǎng)方便和解剖結(jié)構明確。然而，實驗性大鼠的繁殖和飼養(yǎng)費用在逐年增加，對大鼠進行遺傳操作的成本較高，且伴隨著一些技術性的困難。此外，大鼠模型的使用還出現(xiàn)一些其他問題，包括正常動物的異位鈣化會存在天然抑制劑及結(jié)石形成與溶解的代謝途徑調(diào)控基因存在未知的啟動子［9］。

1.2 豬模型 豬模型通過異物植入法建立，異物植入法是通過微創(chuàng)或開放手術直接將結(jié)石或誘發(fā)結(jié)石的異物放入豬等大型哺乳動物的腎盂或膀胱內(nèi)。

1.3 果蠅模型 果蠅模型通過改變遺傳與環(huán)境條件方法建立。果蠅的馬氏管（Malpighian tubules）在功能上與人類腎小管相似，馬氏管也是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運及排泄鈣、磷、尿酸等離子的場所［10］。昆蟲學家發(fā)現(xiàn)馬氏管內(nèi)的離子沉積凝固物，認為馬氏管是果蠅溶質(zhì)沉積的場所［11］。國外團隊應用先進的同步輻射技術發(fā)現(xiàn)馬氏管內(nèi)的凝固物與人類腎結(jié)石形成時的異味鈣化板塊具有相同特征［12］。果蠅結(jié)石模型提供了一個獨特的機會了解泌尿系結(jié)石具體發(fā)生機制，是可操作性強與可量化的成石方式［3］。

由于泌尿系結(jié)石的發(fā)病機制至今尚未明確，一直阻礙著對其預防和治療措施的發(fā)展。人體臨床研究和泌尿系結(jié)石動物模型一直受到成本、道德標準及較長的成石周期的約束。此外，這些哺乳動物模型遺傳和生理的復雜性掩蓋了實驗過程中飲食操作、環(huán)境改變、遺傳變異對結(jié)石形成基本過程的真正影響。

2 果蠅模型的應用

草酸鈣模型的建立是研究腎結(jié)石的基礎。Chen等［9］在果蠅培養(yǎng)基中加入各種濃度的草酸前體物質(zhì)：乙二醇、草酸鈉、羥脯氨酸，經(jīng)過一段時間后解剖并分離果蠅馬氏管可見一水草酸鈣與二水草酸鈣結(jié)晶，分析結(jié)石成分主要為草酸鈣結(jié)石，同時加入枸櫞酸鉀飼養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)果蠅結(jié)石形成明顯減少，壽命明顯延長。該實驗在一定程度上表明果蠅可能具有與哺乳動物相似的內(nèi)外源性草酸代謝途徑。

果蠅模型在一些腎結(jié)石的基礎研究中也有新的發(fā)展，其中比較突出的是異位鈣化，通過研究異位鈣化的起始因素，進而對腎結(jié)石的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。目前有研究［13］證明抑制人或狗體內(nèi)黃嘌呤脫氫酶可致腎結(jié)石的發(fā)生。Chi［3］通過抑制黃嘌呤脫氫酶基因的表達建立果蠅結(jié)石模型，并分析結(jié)石成分發(fā)現(xiàn)果蠅馬氏管中出現(xiàn)鋅離子高度濃縮現(xiàn)象，這種現(xiàn)象同樣也出現(xiàn)在人類腎結(jié)石和蘭達爾斑塊中。為了進一步研究鋅離子在異位鈣化中的作用，抑制果蠅的鋅離子轉(zhuǎn)運體基因表達，從而發(fā)現(xiàn)果蠅馬氏管中的結(jié)石形成受到明顯抑制。此外，還通過飲食、藥物等多種途徑降低鋅離子的攝入，并證實鋅離子在異位鈣化中起十分重要的作用，這些對明確腎結(jié)石的發(fā)病機制和制定預防措施有重要意義。

眾所周知硫酸鹽特別是硫代硫酸鹽是氰化物中毒的解毒劑也可用于降低鉑化物對腎臟的損害。因硫代硫酸根離子與Slc26a6的親和力比草酸根高，較多實驗團隊從硫代硫酸鹽研究防治草酸鈣結(jié)石。Landry［14］應用非洲爪蟾蜍卵細胞，通過電生理學實驗證明硫代硫酸根離子與Slc26a6的親和力高于草酸根，并用敲除了草酸轉(zhuǎn)運體基因的果蠅模型，在果蠅培養(yǎng)基中同時加入乙二醇和硫代硫酸鈉/硫酸鹽，發(fā)現(xiàn)果蠅馬氏管中的草酸鈣結(jié)石顯著減少，從而證實硫代硫酸根離子通過競爭性結(jié)合草酸轉(zhuǎn)運體蛋白拮抗草酸根離子與受體結(jié)合，進而減少草酸的分泌和吸收，抑制草酸鈣結(jié)石的形成。上述研究成功應用果蠅結(jié)石模型，為臨床應用硫代硫酸鹽防治腎結(jié)石提供了理論基礎和依據(jù)。

3 小結(jié)

果蠅模型已經(jīng)成功應用于人類多種疾病及多器官、多系統(tǒng)的研究。但果蠅也有著局限性，其腎臟系統(tǒng)在解剖結(jié)構上是分離的且無腎小球樣結(jié)構，其尿液產(chǎn)生也不是超濾的，而是通過主動分泌水、電解質(zhì)形成，且對尿液的重吸收功能也不是馬氏管而是與其相連的胃腸系統(tǒng)［12，15］。此外，因果蠅體積較小，目前尚無收集并監(jiān)測果蠅血液、尿液成分的有效方法，這就導致無法確定果蠅是否出現(xiàn)高草酸尿、酸中毒或高草酸血癥等，這可能使分析結(jié)果出現(xiàn)錯誤，例如乙二醇處理的果蠅無法確定其壽命縮短的主要原因是酸中毒還是草酸鈣，枸櫞酸鉀處理的果蠅壽命延長的主要原因是枸櫞酸鉀螯合鈣離子還是鉀離子濃度升高抑制鈣離子分泌從而使草酸鈣結(jié)石形成減少，亦或是枸櫞酸鉀中和減輕了由乙二醇引起的酸中毒［12，15］。當然，果蠅的優(yōu)勢也是不容忽視的，這種多用途的動物已經(jīng)成為一個具有已知實用數(shù)據(jù)和明確功能優(yōu)勢的人類腎結(jié)石翻譯模型。低成本獲取、簡短的生命周期這些優(yōu)點均有利用快速且低成本建模。果蠅的基因組是高度保守且極具特色，易通過一系列行之有效的和復雜的基因組工作操作。果蠅的突變株系也容易得到及培育。當然，最重要的還是果蠅馬氏管的基因活動、解剖結(jié)構、生理功能與人類腎小管非常相似。此外，這個模型的直觀性及允許簡單地定量操作實驗條件是其他模型所不及的?？傊?，人類腎結(jié)石果蠅模型既有明顯優(yōu)勢又有無法避免的劣勢，如何充分利用果蠅模型開展針對腎結(jié)石發(fā)生、發(fā)展過程及其防治的研究工作將是未來重要的課題。

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518000 廣東醫(yī)科大學附屬福田區(qū)人民醫(yī)院