生物毒素的研究與應(yīng)用：選擇性蜘蛛毒揭示Nav1.1通道在機(jī)械痛中的作用

·國外醫(yī)學(xué)動(dòng)態(tài)·

生物毒素的研究與應(yīng)用：選擇性蜘蛛毒揭示Nav1.1通道在機(jī)械痛中的作用

電壓門控性鈉（Nav）通道參與啟動(dòng)大多數(shù)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?，其中也包括痛覺初級傳入神經(jīng)纖維。局部麻醉劑可通過非特異性阻斷所有Nav通道亞型來抑制疼痛，但探求選擇性亞型調(diào)節(jié)因子將更有助于分析Nav通道亞型對化學(xué)、機(jī)械或熱痛的作用及機(jī)制。美國加州大學(xué)舊金山分校的Jeremiah D. Osteen, Volker Herzig和 David Julius等人通過運(yùn)用電生理、組織化學(xué)及行為學(xué)，篩選和鑒定出一種蜘蛛毒素可選擇性激活Nav1.1亞基，并闡明其在傷害感受和疼痛中的作用。在非神經(jīng)炎癥的情況下，Nav1.1的激活誘導(dǎo)了疼痛反應(yīng)，產(chǎn)生了機(jī)械性痛覺過敏，而對熱痛并無影響。在腸道中，高閾值機(jī)械敏感性神經(jīng)纖維表達(dá)Nav1.1，且腸易激綜合征模型小鼠也表現(xiàn)為毒素敏感性增強(qiáng)，證實(shí)了Nav1.1通道在調(diào)節(jié)機(jī)械痛的感覺神經(jīng)纖維興奮性中的作用。

一、研究背景

疼痛不但引起急性、保護(hù)性的反應(yīng)，也引起不良反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致持續(xù)性疼痛。在這些傷害性感受神經(jīng)元中，三種電壓門控性Na通道—Nav1.7,Nav1.8和Nav1.9得到了特別的關(guān)注，主要因?yàn)槭芡蛔冇绊懙倪@些亞型與持續(xù)性疼痛綜合癥有關(guān)。此外，Nav1.1也在軀體感覺神經(jīng)元中表達(dá)，但這種亞型與疼痛之間的關(guān)系目前并未可知。研究顯示，受突變影響的Nav1.1與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ绨d癇、自閉癥和阿爾茨海默?。┫嚓P(guān)。在外周神經(jīng)元中，臨床研究顯示該亞型可能也具有潛在的功能。例如，Nav1.1的功能獲得性突變引起III型家族偏癱性偏頭痛。盡管該表型是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)啟動(dòng)機(jī)制，感覺神經(jīng)元的失功能也可能促進(jìn)這種疼痛綜合征的發(fā)生。

確定Nav1.1在疼痛中作用的另一個(gè)挑戰(zhàn)是開發(fā)出這種高度保守的離子通道家族成員的亞型選擇性藥物。天然藥物可被用來作為對靶受體特異性作用物質(zhì)的一種來源。這種藥物可能存在于蜘蛛、蝎子、錐螺和蛇的復(fù)雜毒液中，它們所包含的毒素可刺激攻擊它們的捕食者的感覺感受器來引起疼痛及不適。在該報(bào)道中，作者闡述了兩種選擇性激活Nav1.1引發(fā)急性疼痛和機(jī)械性痛覺過敏的致痛性蜘蛛毒素，為該通道和表達(dá)Nav1.1的感覺神經(jīng)纖維在傷害感受和痛覺過敏中的特異性作用提供了新思路。

二、主要研究結(jié)果

1. Hm1a選擇性激活Nav1.1

為了鑒定靶向特定傷害性感受器的新毒素，運(yùn)用鈣成像技術(shù)測試100多只蜘蛛、蝎子和蜈蚣毒液對培養(yǎng)的軀體感覺神經(jīng)元的激活能力。其中，多哥星團(tuán)樹巴布狼蛛(tarantula Heteroscodra maculata)毒液可強(qiáng)烈地刺激大/小鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG)及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元。應(yīng)用MALDI-TOF MS和帶相關(guān)序列的抑制劑胱氨酸結(jié)(ICK)肽的埃德曼測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)毒液可分離出兩種活性肽，分別命名為Hm1a和Hm1b。隨之，應(yīng)用合成的Hm1a，結(jié)果顯示其可引起大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣反應(yīng)，提示Hm1a是一種有活性的毒液成分。

河豚毒素TTX可阻斷Hm1a所誘發(fā)的鈣反應(yīng)，表明這些反應(yīng)與Nav通道有關(guān)。全細(xì)胞膜片鉗記錄TG神經(jīng)元，結(jié)果顯示Hm1a顯著抑制了Nav電流的失活。這些神經(jīng)元所表達(dá)的Nav亞型中，只有Nav1.1，1.6和1.7對TTX是敏感的，縮小了其研究范圍。下一步檢測發(fā)現(xiàn)，ICA-121431，一種Nav1.1和Nav1.3亞型選擇性的小分子抑制劑，可減弱胚胎鼠DRG和新生鼠三叉培養(yǎng)系中由Hm1a誘發(fā)的鈣離子反應(yīng)，表明在軀體感覺神經(jīng)元中Nav1.1是Hm1a主要的靶點(diǎn)。作為對照，ICA-121431僅部分阻斷SGTx1的反應(yīng)。同Hm1a相比，它在Nav亞型中表現(xiàn)出更低的選擇性且可激活更多的感覺神經(jīng)元細(xì)胞群。為了證實(shí)該毒素對Nav1.1通道是選擇性的，我們在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中異源表達(dá)Nav1.1-Nav1.8 α亞基。Hm1a有效地抑制了人類(h) Nav1.1通道的失活（半數(shù)有效濃度EC50=38±6 nM），但卻大幅度減弱了對hNav1.2和hNav1.3的影響，對hNav1.4-Nav1.8無影響。天然Hm1b可獲得相似的結(jié)果。Nav1.9在重組體系統(tǒng)中并不是高效表達(dá)，但替代的嵌合體（大鼠Kv2.1通道包含來自每個(gè)hNav1.9的四個(gè)結(jié)構(gòu)域的S3b-S4毒素結(jié)合域）也對毒素不敏感。

以前Hm1b是一種未知毒素，但Hm1a是第一個(gè)作為κ-theraphotoxin-Hm1a被鑒定的，是一種電壓門控通道Kv1.4的中度親和力阻斷劑。然而，高濃度的合成Hm1a對小鼠Kv4.1電流的阻斷作用僅能達(dá)到20%，且1 μM天然Hm1a對Nav1.1表現(xiàn)出飽和效應(yīng)卻并不阻斷mKv4.1。此外，在培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元中，外向K+電流并沒有受到Hm1a的影響，表明它的主要靶點(diǎn)是Nav1.1。該結(jié)果或許可以解釋為什么向小鼠腦注射Hm1a引起了抽搐和迅速死亡。這些結(jié)果也證明了Hm1a是通過選擇性靶向Nav1.1通道來激活一系列的感覺神經(jīng)元。

用全細(xì)胞電流鉗配置分析三叉神經(jīng)元Hm1a反應(yīng)表明這是毒素誘發(fā)的過度興奮。Hm1a并不改變靜息膜電位RMP，但它在注入20 pA電流時(shí)極大地增強(qiáng)了放電頻率。Hm1a也顯著延長了動(dòng)作電位。我們發(fā)現(xiàn)毒素反應(yīng)最強(qiáng)烈的是來自幼小的（胚胎或新生）小鼠和大鼠的培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元，可能反映了在這些細(xì)胞或培養(yǎng)條件中動(dòng)作電位放電閾值更低。

2. 選擇性依賴于IV型結(jié)構(gòu)域的S1-S2環(huán)

研究表明Hm1a抑制Nav1.1快速失活的速度和程度，與少數(shù)的選擇性肽類毒素結(jié)合到IV型結(jié)構(gòu)域的S3b-S4電壓傳感區(qū)域的機(jī)制類似。為了檢測Hm1a是否靶向相同的位置，作者分別將hNav1.1的四個(gè)S3b–S4結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移至四聚體rKv2.1電壓門控鉀通道所在的同源位點(diǎn)上，該位置通常對毒素不敏感。僅DIV S3b-S4結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)移可釋放rKv2.1對Hm1a的敏感性，證明了該部分是毒素起作用的主要決定因素。然而，這段區(qū)域在hNav1.1，hNav1.2 和hNav1.3中都是相同且相對保守的，因此這不能完全解釋毒素的選擇性。為了驗(yàn)證其他重要區(qū)域的功能性，作者在Nav1.1和Nav1.4之間構(gòu)建了嵌合體，它對Hm1a完全不敏感。將rNav1.4和hNav1.1的S3b–S4結(jié)構(gòu)域進(jìn)行替換后就失去了毒素的敏感性，反之將S3b–S4和S1–S2環(huán)轉(zhuǎn)移進(jìn)入后能完全導(dǎo)致毒素敏感性。這些結(jié)果說明這些結(jié)構(gòu)域一起決定了毒素敏感性和亞型選擇性。

3. Nav1.1在有髓鞘的Aδ纖維上表達(dá)

通過原位雜交的方法，我們發(fā)現(xiàn)Nav1.1轉(zhuǎn)錄本主要表達(dá)于中等直徑的感覺神經(jīng)元（占DRG中所有神經(jīng)元的35%），這些神經(jīng)元大部分（＞75%）屬于有髓鞘群體（NF200陽性）。作為對照，我們發(fā)現(xiàn)只有（5%～11%）的Nav1.1陽性神經(jīng)元與小直徑神經(jīng)元標(biāo)記物，無髓鞘神經(jīng)元標(biāo)記物包括TRPV1、CGRP、酪氨酸羥化酶和凝集素IB4有共標(biāo)。但是，我們看到Nav1.1陽性神經(jīng)元與有髓鞘Aδ神經(jīng)元的標(biāo)記物5-HT3受體有大量共標(biāo)（43%的Nav1.1陽性神經(jīng)元表達(dá)5-HT3）。最后，22%的Nav1.1陽性神經(jīng)元也表達(dá)TRPM8受體，TRPM8受體在Aδ和C纖維中都有發(fā)現(xiàn)。從上面結(jié)果我們總結(jié)出Nav1.1主要表達(dá)在有髓鞘神經(jīng)元包括Aδ纖維中，與之前的組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)一致。我們也概括出Hm1a敏感性神經(jīng)元對其他受體選擇性激動(dòng)劑有反應(yīng)這一特征，進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)果。顯而易見地，大部分（＞ 85%）的Nav1.1陽性神經(jīng)元同樣表達(dá)Nav1.7，說明這類髓鞘神經(jīng)元對傷害性感受起到一定的作用。接下來我們采用離體皮膚神經(jīng)制備實(shí)驗(yàn)來研究Hm1a對機(jī)械性傷害感受的Aδ纖維中的作用。我們發(fā)現(xiàn)在皮膚感受區(qū)處理1μM Hm1a可顯著地增加機(jī)械性傷害感受的Aδ纖維對機(jī)械刺激的反應(yīng)的放電頻率，這些證實(shí)了功能性Nav1.1在傳入神經(jīng)的表達(dá)。之前的研究結(jié)果表明TRPV1在機(jī)械性傷害感受的Aδ纖維中少量表達(dá)，這與我們發(fā)現(xiàn)的Nav1.1和TRPV1只有少量共標(biāo)相一致。同時(shí)，這些功能性結(jié)果證明了Nav1.1表達(dá)在有髓鞘的Aδ纖維，也進(jìn)一步說明Nav1.1參與了機(jī)械性傷害感受。

4. Hm1a引發(fā)疼痛和機(jī)械性痛覺過敏

我們研究了表達(dá)Nav1.1的纖維的激活是否會產(chǎn)生疼痛行為。將Hm1a（5 μM/10 μl）注射進(jìn)入小鼠后爪，在整個(gè)觀察期間小鼠產(chǎn)生了迅速而強(qiáng)烈的傷害性反應(yīng)（反復(fù)舔咬注射的爪）。在淺層同側(cè)的脊髓背角神經(jīng)元中注射毒素同樣可明顯增加Fos蛋白免疫反應(yīng)，說明傷害性感受器和它的中樞有功能性銜接。為了排除這個(gè)反應(yīng)是賴于TRPV1和Nav1.1共標(biāo)的那一小部分纖維的可能性，我們通過鞘內(nèi)注射辣椒素來脫敏TRPV1陽性末端，Hm1a誘發(fā)的傷害性反應(yīng)在這樣處理的小鼠中依然持續(xù)。顯而易見的，被注射過Hm1a的爪子不會有腫脹或血漿外滲的反應(yīng)，而肽能C纖維傷害性感受器的激活容易誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，這些感受器包括了大部分的TRPV1表達(dá)的神經(jīng)元。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示Hm1a是通過激活非肽能有髓鞘感覺神經(jīng)纖維來誘發(fā)痛。通過遺傳或藥理學(xué)方法敲除TRPV1表達(dá)纖維能極大的降低傷害性熱敏，但對機(jī)械刺激敏感無影響。鑒于解剖和生理的結(jié)果，通過監(jiān)測足底注射不足以引起急性行為的的毒素劑量（500 nM,10μl）后熱刺激和機(jī)械刺激的反應(yīng)檢測Hm1a在其中是否有不同的影響。足底注射Hm1a后并不改變熱敏，但是對機(jī)械刺激產(chǎn)生很強(qiáng)的敏化作用且不依賴于TRPV1表達(dá)纖維。注射Hm1b后能夠看到相似的機(jī)械敏感變化。與這些行為學(xué)結(jié)果相符，除了那些也對辣椒素敏感的神經(jīng)之外，所有Hm1a陽性成年DRG神經(jīng)元展示出機(jī)械活化電流。

為了確認(rèn)Nav1.1在毒素誘導(dǎo)的行為學(xué)中的作用，我們雜交小鼠Nav1.1等位基因去線性表達(dá)受外周蛋白啟動(dòng)子控制的Cre重組酶，這在發(fā)育期間有很大比例的有髓和無髓感覺神經(jīng)元表達(dá)活躍。分析外周蛋白-Cre X黃色熒光蛋白（YFP）受體線性關(guān)系表明46%的Nav1.1陽性細(xì)胞表達(dá)Cre重組酶。值得注意的是，從這些纖維群中去除Nav1.1能夠明顯減弱毒素誘發(fā)的行為學(xué)，包括急性疼痛反應(yīng)和機(jī)械性致敏。通過神經(jīng)損傷或炎癥強(qiáng)烈的激活傷害感受途徑具有原發(fā)性和繼發(fā)性敏化作用，后者可以表現(xiàn)為對側(cè)對刺激的機(jī)械或熱超敏反應(yīng)。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)單側(cè)注射Hm1a在注射的同側(cè)及對側(cè)都產(chǎn)生強(qiáng)烈且相似的機(jī)械性致敏。重要的是，Hm1a介導(dǎo)的機(jī)械性致敏在Nav1.1外周蛋白Cre小鼠的同側(cè)及對側(cè)足底均會減低，證明對側(cè)的敏化作用依賴于Nav1.1。

5. Nav1.1和腸易激綜合征

腸易激綜合征（IBS）患者腹痛的發(fā)生是慢性機(jī)械性超敏反應(yīng)產(chǎn)生的基礎(chǔ)。鑒于Nav1.1在機(jī)械傷害感受器中的作用，我們研究這個(gè)通道是否表達(dá)于內(nèi)臟的機(jī)械敏感纖維，如果是，那么它對慢性內(nèi)臟超敏模型（CVH）中神經(jīng)元的敏化是否起到作用。我們檢測來自于正常及CVH小鼠的離體內(nèi)臟神經(jīng)的機(jī)械響應(yīng)。在正常小鼠中，Hm1a增加40%的高閾值慢性結(jié)腸傳入神經(jīng)（構(gòu)成假定的機(jī)械傷害感受器）中的機(jī)械誘發(fā)的spiking。相應(yīng)地，ICA-121431降低50%的纖維研究的機(jī)械響應(yīng)并阻斷Hm1a誘發(fā)的敏化作用。此外，Hm1a顯著降低45%的逆行標(biāo)記的結(jié)腸DRG神經(jīng)元的動(dòng)作電位的發(fā)放閾值，結(jié)果通過全細(xì)胞電流鉗分析得出。這些結(jié)果表明高閾值機(jī)械敏感性結(jié)腸纖維表達(dá)功能性Nav1.1通道。CVH小鼠的結(jié)腸傳入神經(jīng)的基線機(jī)械感覺反應(yīng)較正常對照小鼠有所升高。Hm1a的應(yīng)用提高了36%CVH纖維的機(jī)械誘發(fā)spiking，超過其本身提升的水平。尤其，在CVH的情況下（與正常對照組形成對比），毒素的使用顯著增加多數(shù)（64%）逆行標(biāo)記結(jié)腸DRG神經(jīng)元的電興奮性，表明Nav1.1通道的功能性上調(diào)。此外，ICA-121431使多數(shù)（70%）CVH敏感纖維的機(jī)械感覺傳導(dǎo)反應(yīng)降低到類似于基線水平。同時(shí)，這些結(jié)果支持Nav1.1在IBS中參與機(jī)械超敏反應(yīng)這一觀點(diǎn)。

三、總結(jié)

Nav通道的亞型選擇性配體的開發(fā)是一個(gè)重要但具有挑戰(zhàn)性的目標(biāo)。我們的研究結(jié)果確定了在DIV S1-S2環(huán)內(nèi)有個(gè)點(diǎn)可增強(qiáng)亞型選擇性，為設(shè)計(jì)其他亞型特異性門控調(diào)節(jié)器提供了一個(gè)潛在的方案。此外，毒素如Hm1a和Hm1b可能特定地作用于激發(fā)Nav通道活性，然而Nav通道部分功能喪失與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和兒嚴(yán)重肌陣攣癲癇有關(guān)系。毒素和離子通道相互作用的分析，包括該藥效團(tuán)的多位點(diǎn)種類，可能為開發(fā)更廣泛的一類帶有相似選擇性和功能性配置的分子提供新的策略。Nav1.1在大腦中的關(guān)鍵性的作用可能是阻礙它經(jīng)過前識別成為外周疼痛信號的貢獻(xiàn)者。目前我們的結(jié)果明確表明Nav1.1和表達(dá)Nav1.1的有髓鞘傳入神經(jīng)在傷害感受中的重要作用。在沒有引起神經(jīng)源性炎癥情況下激活或敏化這些纖維足以引起強(qiáng)烈的急性疼痛和機(jī)械性痛覺過敏，這些纖維有別與己被充分研究的C-傷害性感受器。先前的研究涉及到有髓鞘的Aδ纖維在傷害性感受機(jī)理中，且目前Nav1.1為更精確地鑒定這些纖維對急性和慢性疼痛的作用提供了一個(gè)重要的新對照。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，用藥理學(xué)方法阻斷Nav1.1代表了一種新的治療策略來減弱IBS中的慢性疼痛，或許這對其他疼痛（偏頭痛與機(jī)械性致敏）也有治愈作用。盡管大腦Nav1.1活動(dòng)可能會導(dǎo)致III型家族偏癱性偏頭痛患者的發(fā)作先兆，我們的結(jié)果表明這些功能獲得性突變在機(jī)械性痛覺感受器中可能會通過Nav1.1的活動(dòng)產(chǎn)生偏頭痛。實(shí)際上，抗痙攣藥可靶向Nav通道，包括Nav1.1，已被證明可減輕某些個(gè)體的偏頭痛發(fā)作。此外，盧非酰胺，即一種鎮(zhèn)痙劑最近被證明能夠抑制Nav1.1。報(bào)道顯示，其可減輕神經(jīng)損傷誘發(fā)的機(jī)械性痛覺過敏。我們的發(fā)現(xiàn)為這些研究提供了一個(gè)深入機(jī)制。

（Jeremiah D. Osteen, Volker Herzig, John Gilchrist,et al. ARTicLE,2016, 534:494 ～ 499. 蘇州大學(xué) , 余書敏 譯 陶金 校）

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.02.002