谷胱甘肽對異育銀鯽生長及辛硫磷解毒的影響

任勝杰，鄭曙明*，宋 艷，朱 龍

(1.西南大學(xué)魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心，重慶 402460；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，四川 成都 610000)

谷胱甘肽對異育銀鯽生長及辛硫磷解毒的影響

任勝杰1，鄭曙明1*，宋 艷2，朱 龍1

(1.西南大學(xué)魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心，重慶 402460；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，四川 成都 610000)

為研究還原性谷胱甘肽(GSH)對異育銀鯽生長及辛硫磷中毒后的解毒效果，本試驗分別對試驗魚投喂基礎(chǔ)飼料和添加GSH的飼料，試驗周期為40 d，測定GSH對異育銀鯽生長性能、血細胞數(shù)目、臟體指數(shù)、辛硫磷的解毒效果和肝臟辛硫磷殘留量的影響。結(jié)果顯示：同對照組相比，20 d時各試驗組魚生長出現(xiàn)顯著的促進作用(P<0.05)同時餌料系數(shù)顯著降低(P<0.05)；當飼料中添加GSH劑量超過200 mg/kg時,鯽魚的肝體比、腎體比、脾體比，均呈現(xiàn)升高趨勢；各試驗組魚的紅細胞，白細胞的數(shù)量顯著增加(P<0.05)；急性攻毒后試驗組魚的死亡率均顯著低于對照組(P<0.05)，且添加劑量越高死亡率越低(P<0.05)；各試驗組魚肝臟中辛硫磷殘留量均顯著低于對照組(P<0.05)，且GSH添加劑量為400 mg/kg時，殘留值(0.62±0.01)mg/kg為最低。

還原性谷胱甘肽；異育銀鯽；生長性能；解毒

谷胱甘肽包含兩種形式：氧化型谷胱甘肽(GSHG)和還原型谷胱甘肽(GSH)。通常在細胞中起生理功能的谷胱甘肽為GSH。還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽在組織中的含量比約為100/1，GSH在機體中起著抗氧化、抗衰老等生理功能，而GSHG則不具有這些功能[1-2]。GSH經(jīng)谷胱甘肽合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶3種酶催化細胞內(nèi)的甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸經(jīng)過脫水而成的含有巰基的天然小分子肽[3]。水生動物體內(nèi)的GSH水平對外界條件的變化很敏感[4]，目前國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖中關(guān)于應(yīng)用GSH的研究主要包括其對淡水魚和蝦類的促生長、抗病力[5]、相關(guān)酶活性[6]、抗氧化[7-8]及魚體重金屬毒性損傷修復(fù)[9]，抗微囊藻毒素[10]等方面。辛硫磷又名肟硫磷，倍腈松，腈肟磷，是一種高效低毒廣譜的有機磷農(nóng)藥，無內(nèi)吸作用，主要以觸殺和胃毒作用為主，目前廣泛用于農(nóng)林漁牧生產(chǎn)[11]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，主要用來殺滅水體中的害蟲。辛硫磷對哺乳動物低毒，對魚類等水生生物具有一定毒性。目前我國對植物性食品和家禽家畜的肌肉中辛硫磷殘留量已進行規(guī)定并建立相應(yīng)的國家標準，但對水產(chǎn)品中辛硫磷殘留量的檢測尚未建立國標[12]。同時，有關(guān)GSH對辛硫磷解毒方面的研究也尚未見報道。本試驗探討飼料中添加不同含量的GSH對異育銀鯽CarassiusauratusGibelio生長性能，臟體比，紅、白細胞數(shù)目，急性攻毒死亡率，以及肝臟辛硫磷殘留量的影響，從而為GSH對魚類生長及辛硫磷中毒的解毒效果提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與試驗飼料

試驗設(shè)置1個對照組和3個試驗組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)隨機放入25尾魚。對試驗魚分別投喂基礎(chǔ)飼料和添加200 、400和600 mg/kg GSH的試驗飼料。養(yǎng)殖周期為30 d，測定異育銀鯽生長性能、紅白細胞數(shù)目、臟體比。30 d養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，用辛硫磷24 hLC50攻毒，測定死亡率。后將各組攻毒存活試驗魚繼續(xù)飼喂10 d并統(tǒng)計最終死亡率和測定肝臟中辛硫磷殘留量。

基礎(chǔ)飼料以菜粕和豆粕等為主要蛋白源，豆油為脂肪源，次粉為主要糖源，具體的配方和營養(yǎng)組成見表1。試驗組GSH的添加量分別為200、400、600 mg/kg。飼料原料均經(jīng)40目篩粉碎，混合均勻后使用小型顆粒飼料機(SLR-150)制成沉性顆粒(直徑3 mm)，于45 ℃烘箱中快速烘干，隨即裝入自封袋，-20 ℃保存待用。

1.2 試驗用魚與飼養(yǎng)管理

500尾(42.46±0.37) g異育銀鯽均從四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所獲得。試驗魚暫養(yǎng)2周并隨機分組。然后分別在12個500 L的玻璃養(yǎng)殖缸中放入無病無傷的異育銀鯽25尾。每日補充經(jīng)充分暴氣的自來水約占缸內(nèi)總水量的1/6。非投喂時間適度曝氣，溶氧不低于6 mg/L，水溫范圍在25.0～28.0 ℃，pH6.9～7.5。氨氮和余氯每周檢測1次分別控制低于0.1 mg/L和低于0.05 mg/L。每天投喂兩次，日投喂率為2 %。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 辛硫磷24 hLC50測定 實驗前，多次進行攻毒預(yù)試驗，找出死亡率在0～100 %辛硫磷劑量的最小范圍大致為10～21 mg/L。根據(jù)改良寇氏法按等對數(shù)間距設(shè)置濃度梯度(10.05、12.06、14.47、17.37、20.84 mg/L)，求出辛硫磷 24 hLC50=14.73

表1 基礎(chǔ)飼料的配方及其營養(yǎng)水平( %干物質(zhì))

Table 1 Composition and nutrition levels of the basal diet (dry matter basis, %)

原料Items含量Content魚粉Fishmeal3.0豆油Soybeanoil2.0豆粕Soybeanmeal18.5維生素預(yù)混料Vitaminmix0.1菜粕Rapeseedmeal20.0礦物質(zhì)預(yù)混料Mineralmix0.5麥芽根Rootofmalt10.0磷酸二氫鈣Calciumphosphate1.2棉粕Cottonseedmeal12.0纖維素Cellulose2.8次粉Wheatmiddlings24.0統(tǒng)糠Crudericebran5.0磷脂Soybeanlecithin0.5維生素CVitaminC0.1氯化膽堿Cholinechloride0.3粗蛋白(DM)Crudeprotein30.1粗灰分(DM)Crudeash7.5粗脂肪(DM)Crudefat3.6能量(kJ·g-1)(DM)Energy7.7

mg/L。

1.3.2 生長指標測定 試驗開始時，隨機抽取5尾試驗魚，測定試驗魚測定指標初始值。之后，每10 d測定1次指標，每個重復(fù)隨機取2尾試驗魚，每個試驗處理共取6尾魚，稱重，解剖并快速分離肝、脾、腎臟，并計算試驗魚的肝體比、脾體比、腎體比、增重率、特定生長率、餌料系數(shù)。

肝體比(%)=100×肝臟質(zhì)量/魚體質(zhì)量

脾體比(%)=100×脾臟質(zhì)量/魚體質(zhì)量

腎體比(%)=100×腎臟質(zhì)量/魚體質(zhì)量

增重率(%)=100×[(試驗?zāi)~體平均質(zhì)量-試驗初魚體平均質(zhì)量)/試驗初魚體平均質(zhì)量]

特定生長率(%)=100×[(ln試驗?zāi)~體平均質(zhì)量-ln試驗初魚體平均質(zhì)量)/試驗天數(shù)]

餌料系數(shù)=投飼質(zhì)量/(增重質(zhì)量+死魚質(zhì)量)

1.3.3 紅細胞、白細胞數(shù)目測定 采用尾靜脈取血法，取0.5 mL血樣立即注入1 %肝素鈉抗凝處理過的抗凝管備用。采用顯微鏡直接計數(shù)法來測定血細胞數(shù)量。紅細胞計數(shù)時，用移液槍準確量取20 (l抗凝血。0.65 %生理鹽水把所取抗凝血準確稀釋100倍，后用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。白細胞計數(shù)時，用1 %的醋酸龍膽紫將20 (l抗凝血稀釋20倍后，用血球計數(shù)板顯微鏡下直接計數(shù)。

表2 不同GSH劑量對異育銀鯽的生長性能的影響

注：相同天數(shù)同列無字母或數(shù)據(jù)肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。 Note:The different letters within the same column means significant differences (P>0.05), and the same letters within the same column means not significant differences(P<0.05).The same as below.

1.3.4 急性攻毒 30 d養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，用辛硫磷24 hLC50攻毒，為防止餌料影響，急性攻毒期間不投餌，攻毒24 h后立即換水，正常增氧。測定試驗魚死亡率。繼續(xù)飼喂10 d并統(tǒng)計最終死亡率。

1.3.5 異育銀鯽肝臟辛硫磷殘留量檢測 急性攻毒試驗后，存活試驗魚繼續(xù)飼喂10 d，參照劉茜、石旺榮[11-12]用基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法對試驗魚的肝臟中的辛硫磷殘留量進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH對異育銀鯽生長性能的影響

由表2可見，第10天時對照組與各試驗組魚在增重率、特定生長率、餌料系數(shù)3個指標上均無顯著差異(P<0.05)，第20、30天時，GSH添加量為400和600 mg/kg的試驗組魚，在增重率、特定生長率顯著高于對照組和200 mg/kg試驗組魚(P<0.05)，餌料系數(shù)則顯著低于對照組和200 mg/kg試驗組魚(P<0.05)。

2.2 GSH對異育銀鯽臟體比的影響

從圖1～3可知，與對照組相比，各試驗組第10、20、30天時肝體比、腎體比、脾體比均出現(xiàn)顯著增高(P<0.05)。

2.3 GSH對異育銀鯽紅、白細胞數(shù)目的影響

由圖4可知，10、20、30 d時對照組魚同試驗組魚的紅細胞數(shù)目出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，且GSH添加量為600 mg/kg時試驗魚的紅細胞數(shù)目最多；由圖5可知，同對照組相比10、20、30 d時異育銀鯽白細胞數(shù)目差異顯著(P<0.05)，30 d時GSH添加量為600 mg/kg時試驗魚的白細胞數(shù)目最多。

2.4 攻毒后試驗魚死亡率及肝臟中辛硫磷殘留量

由表4可知，對照組攻毒處理后死亡率顯著高于各試驗組(P<0.05)，各試驗組間死亡率無顯著性差異(P<0.05)。最終死亡率結(jié)果，對照組試驗魚的死亡率顯著高于各試驗組(P<0.05)，GSH的添加量為200 mg/kg組死亡率顯著高于添加量為400和600 mg/kg的試驗組(P<0.05)，且添加量為400和600 mg/kg的試驗組間無差異顯著性(P>0.05)。對照組及各試驗組間異育銀鯽肝臟辛硫磷殘留量均具有顯著性差異(P<0.05)且添加量為400 mg/kg的試驗組肝臟辛硫磷殘留值最低。

相同天數(shù)無字母或數(shù)據(jù)標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同The result noted with no letter or different letters means significant differences (P>0.05), and with the same letters means not significant differences(P<0.05).The same as below圖1 不同GSH添加量對異育銀鯽肝體比的影響Fig.1 Effect of dietary GSH level on the liver to body ratio of the crucian carp

圖2 不同GSH添加量對異育銀鯽脾體比的影響Fig.2 Effect of dietary GSH level on the spleen to body ratio of the crucian carp

圖3 不同GSH添加量對異育銀鯽腎體比的影響Fig.3 Effect of dietary GSH level on the kidney to body ratio of the crucian carp

Table 4 The mortality of the text fish after acute attack and the phoxime residual amount in the liver

GSH劑量(mg/kg)GSHdose急性攻毒死亡率Mortalityofacuteattack最終死亡率Finalmortality殘留量(mg/kg)Residualcontent0 0.54±0.01a0.63±0.01a1.14±0.04a2000.36±0.05b0.47±0.07b0.93±0.01b4000.33±0.03b0.35±0.03c0.62±0.01d6000.30±0.03b0.39±0.03c0.83±0.03c

3 討 論

3.1 飼料中添加GSH對水產(chǎn)動物生長性能的影響

研究表明，飼料中添加GSH能夠提高草魚的生長性能[13-14]，表現(xiàn)為增重率升高和飼料效率升高，添加GSH各組草魚的飼料效率和增重率，特定生長率均顯著高于對照組。羅非魚飼料中添加GSH，結(jié)果顯示適量的GSH可以促進羅非魚幼魚的生長，提高飼料的消化率和利用率[15]。這與本試驗異育銀鯽基礎(chǔ)飼料中添加GSH結(jié)果相一致，并且本實驗還發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)飼料中添加外源性GSH一定時間后對異育銀鯽的生長具有顯著的促進作用。且添加劑量在0～400 mg/kg增加效果隨添加量的增加而更明顯。這可能是因為GSH是廣泛存在于細胞內(nèi)的三肽化合物，對水產(chǎn)動物的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)具有積極的影響作用，能夠促進生長激素的水平在正常范圍出現(xiàn)升高，從而進一步對水產(chǎn)動物體內(nèi)蛋白的合成和細胞的增殖產(chǎn)生促進作用[12]。然而Steven等[16]研究指出GSH在較高的濃度時可以對淋巴細胞產(chǎn)生毒性，并造成DNA損傷。劉曉華等[6]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加過高劑量的 GSH 會顯著抑制凡納濱對蝦的生長。所以在飼料中添加適當劑量的GSH 則可以有效的對水產(chǎn)動物增長產(chǎn)生促進作用，劑量過高則會對水產(chǎn)動物的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。

圖4 不同GSH添加量對異育銀鯽紅細胞數(shù)目的影響Fig.4 Effect of different GSH addition on the erythrocyte number of the crucian carp

圖5 不同GSH添加量對異育銀鯽白細胞數(shù)目的影響Fig.5 Effect of different GSH addition on the leukocyte number of the crucian carp

3.2 GSH對水產(chǎn)動物肝體比、脾體比、腎體比的影響

肝臟、腎臟、脾臟分別為魚體內(nèi)最重要的消化和免疫器官[17]。本試驗對試驗魚的肝體比、脾體比，腎體比測定結(jié)果顯示：基礎(chǔ)飼料中添加GSH的劑量在超過200 mg/kg時，試驗魚的各比值出現(xiàn)升高趨勢。研究表明，生長激素可使動物的肝臟、腎臟和心臟的質(zhì)量增加。輔酶A可使生長抑素分子的二硫鍵斷開，使得生長激素等其他促生長激素解除抑制，谷胱甘肽中的半胱胺是輔酶A的重要組成成分[18]。GSH具有促進試驗魚體內(nèi)生長激素釋放的功效，從而促使肝體比、脾體比，腎體比增大，并最終促進異育銀鯽體指數(shù)呈升高的趨勢。

3.3 GSH對異育銀鯽紅、白細胞數(shù)目的影響

研究表明GSH主要是通過提高血細胞數(shù)量來增強水產(chǎn)動物的防御能力[20]，主要表現(xiàn)在保護紅細胞膜蛋白質(zhì)的巰基處于還原狀態(tài)，防止溶血，和血紅蛋白不受過氧化氫氧化、自由基等氧化轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而使它持續(xù)正常發(fā)揮運輸氧的能力[21]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，GSH可以使紅白細胞的數(shù)目增多，結(jié)果與趙紅霞等[5]用GSH刺激使得草魚的血液白細胞數(shù)目增加從而達到增強其非特異性細胞免疫相一致。白細胞在動物細胞免疫過程中具有非常重要的作用。白細胞在機體內(nèi)可以通過多種方式來對抗病原體，例如吞噬、包囊、凝聚、沉淀及釋放酚氧化物酶和黑色素等[22-23]。紅、白細胞是血液的主要組成部分，血液在動物體內(nèi)起著十分重要的作用，當外界因子變化，而引起魚體而出現(xiàn)生理變化，都將會在其血液指標中有所體現(xiàn)。

3.4 GSH對異育銀鯽急性攻毒死亡率及肝臟辛硫磷殘留量的影響

據(jù)報道GSH在解毒代謝中有著十分重要的作用，其解毒機理主要表現(xiàn)在能夠和化學(xué)毒物的代謝中間產(chǎn)物，以親核結(jié)合反應(yīng)方式進行解毒。此外，GSH在細胞中的高含量也能夠更好的競爭結(jié)合有毒的親電子物質(zhì)。首先，GSH與親電子代謝物形成結(jié)合物，然后經(jīng)酶的催化反應(yīng)去掉甘氨酸，再通過N-乙酞化酶的催化反應(yīng)，最后以惰性產(chǎn)物形式被排出體外[25-26]。除此之外GSH通過其自身的抗氧化特性來有效降低毒物的過氧化能力，從而降低毒物的毒性效應(yīng)[27]。本試驗結(jié)果顯示，急性攻試驗中GSH各添加組的死亡率顯著低于對照組，試驗魚肝臟中辛硫磷殘留量試驗組顯著低于對照組，且各試驗組間也存在顯著差異，添加GSH含量為400 mg/kg時，肝臟中辛硫磷殘留值最低可能是因為添加GSH的試驗組魚體內(nèi)結(jié)合辛硫磷代謝中間產(chǎn)物的能力，和機體抗氧化能力強于對照組試驗魚有關(guān)[28]。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Effect of Dietary Glutathione onCarassiusauratusGibelio Growth Performance and Phoxim Poisoning

REN Sheng-jie1,ZHENG Shu-ming1*,SONG Yan2,ZHU Long1

(1.Fisheries Breeding and Healthy Cultivation Research Centre of Southwest University, Chongqing 402460，China;2.Institute of Agro-products Processing Science and Technology,Sichuan Chengdu 610000，China)

In present study,CarassiusauratusGibelio was fed by basal diet (control group) and 3 kinds of test diets were added 200, 400 and 600 mg/kg GSH. The culture period was 40 days. The effects of GSH on the growth performance to the text fish, the number of blood cells, the weight of the organs and the detoxification of the toxin and the residual amounts of the residues in the liver of the fish were determined. The results showed that:compared with the control group, the 20 days test group of fish growth significantly promoted at the same time the feed coefficient was significantly decreased (P<0.05); when adding dose of GSH more than 200 mg/kg in feed, the index of liver, kidney and spleen were increased in the experimental fish; the number of erythrocyte and leucocyte in the experimental group was significantly increased (P<0.05); the mortality of the fish in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P<0.05), and the higher the mortality was lower (P<0.05); in the experimental groups, the residual amount was significantly lower than that of the control group (P<0.05), when the GSH additive was 400 mg/kg, the residual value was the lowest (0.62±0.01).

Glutathione；CarassiusauratusGibelio；Growth performance；Detoxify

1001-4829(2016)12-3009-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.042

2015-12-23

國家科技支撐計劃(2012BAD25B10-1)；重慶市應(yīng)用開發(fā)計劃項目(CSTC2014yykfC80001)

任勝杰(1989-)，男，碩士研究生，主要從事魚病防控與水產(chǎn)品食品安全研究， E-mail：601897646@qq.com，*為 通訊作者：鄭曙明，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)研究，E-mail：zhsm22@163.com。

S966

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